기기 엔지니어링을 통한 다운스트림 병원균 검출을 위한 Citrus Budwood 가공 자동화

요약

우리는 체관부가 풍부한 나무 껍질 감귤류 새싹 조직을 신속하게 처리하는 도구를 설계, 제작 및 검증했습니다. 현재 방법에 비해 버드우드 조직 추출기(BTE)는 시료 처리량을 늘리고 필요한 인건비 및 장비 비용을 절감했습니다.

초록

바이러스, 바이로이드 및 박테리아와 같은 감귤류의 이식편 전염성, 체관 제한 병원체는 전 세계적으로 치명적인 전염병과 심각한 경제적 손실을 초래합니다. 예를 들어, 감귤류 트리스테자 바이러스는 전 세계적으로 1억 그루 이상의 감귤 나무를 죽인 반면, "칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스"는 플로리다에 90억 달러의 비용을 초래했습니다. 나무 번식을 위해 병원균 테스트를 거친 감귤류 새싹을 사용하는 것이 이러한 병원균 관리의 핵심입니다. 캘리포니아 대학교 리버사이드의 감귤 클론 보호 프로그램(CCPP)은 중합효소연쇄반응(PCR) 분석을 사용하여 매년 감귤류 새싹나무에서 수천 개의 샘플을 테스트하여 캘리포니아의 감귤류를 보호하고 국립 청정 식물 네트워크에 청정 번식 장치를 제공합니다. 감귤류 바이러스와 바이로이드의 고처리량 분자 검출에서 심각한 병목 현상은 식물 조직 처리 단계입니다.

적절한 조직 준비는 고품질 핵산의 추출과 PCR 분석의 다운스트림 사용에 매우 중요합니다. 핵산 분해를 방지하기 위해 저온에서 식물 조직 절단, 계량, 동결 건조, 분쇄 및 원심분리는 시간과 노동 집약적이며 고가의 특수 실험실 장비가 필요합니다. 이 논문은 감귤류 새싹나무에서 체관부가 풍부한 껍질 조직을 신속하게 처리하도록 설계된 특수 기구인 버드우드 조직 추출기(BTE)의 검증을 제시합니다. BTE는 현재 방법에 비해 시료 처리량을 100% 증가시킵니다. 또한 노동력과 장비 비용을 절감합니다. 이 연구에서, BTE 샘플은 CCPP의 핸드 베핑 프로토콜 (77.84 ng / μL)과 비슷한 DNA 수율 (80.25 ng / μL)을 가졌다. 이 기기와 신속한 식물 조직 처리 프로토콜은 캘리포니아의 여러 감귤 진단 실험실 및 프로그램에 도움이 될 수 있으며 전 세계의 다른 목본 다년생 작물에 대한 조직 처리를 위한 모델 시스템이 될 수 있습니다.

서문

바이로이드, 바이러스 및 박테리아와 같은 감귤류의 이식편 전염성 체관 제한 병원체는 전 세계 모든 감귤 생산 지역에서 치명적인 전염병과 심각한 경제적 손실을 초래했습니다. 감귤류 바이로이드는 삼엽충, 삼엽충 잡종, 만다린, 클레멘타인 및 귤과 같은 경제적으로 중요한 감귤류 유형에서 유발하는 엑소코르티스 및 악액질 질환^때문에 생산 인자를 제한하고 있다 ^1,2,3. 캘리포니아에서 이러한 바이로이드에 민감한 감귤류 유형은 껍질을 벗기기 쉽고, 세분화되고, 씨가 없는 과일에 대한 소비자의 선호도 변화 추세에 따라 성장하고 수익성 있는 "이지필러" 시장의 기반이 됩니다 ^4,5,6. 따라서 감귤류 바이로이드는 캘리포니아 식품 농업부(CDFA)의 "감귤류 묘목 해충 청결 프로그램-상원 법안 140"에 따라 규제되며 CDFA의 식물 해충 진단 부서의 실험실은 매년 수천 건의 감귤류 바이로이드 테스트를 수행합니다 7,8,9,10 . 감귤류 트리스테자 바이러스(CTV)는 1930년대^전 세계적으로 전염병이 시작된 이래로 1억 그루 이상의 감귤 나무의 죽음을 초래했습니다 3,9,10,11. 캘리포니아에서는 줄기 구멍과 삼엽충 파괴 저항성 바이러스 분리가 36억 달러 규모의 캘리포니아 감귤 산업에 심각한 위협이 되고 있습니다^12,13,14. 결과적으로 CDFA는 CTV를 규제 된 클래스 A 식물 해충으로 분류하고 CCTEA (Central California Tristeza Eradication Agency)의 실험실은 매년 광범위한 현장 조사와 수천 건의 바이러스 테스트를 수행합니다^15,16. 박테리아 "Candidatus Liberibacter asiaticus"(CLas)와 황룡빙(HLB) 질병은 감귤 면적의 40% 감소, 감귤 운영의 57% 감소, 거의 8,000개의 일자리 손실의 결과로 플로리다에 거의 90억 달러의 경제적 피해를 입힌 것으로 추정됩니다^17,18. 캘리포니아에서는 HLB로 인해 감귤 재배 면적이 20% 감소하면 8,200개 이상의 일자리가 손실되고 주 국내총생산(GDP)이 50억 달러 이상 감소할 것으로 예측되었습니다. 따라서 감귤류 해충 및 질병 예방 프로그램은 캘리포니아^14,17,19,20에서 CLa를 테스트, 탐지 및 근절하기 위한 조사에 연간 4천만 달러 이상을 지출합니다.

감귤류 바이로이드, 바이러스 및 박테리아 관리의 핵심 요소는 나무 생산을 위해 병원균 테스트를 거친 번식 물질(즉, 새싹나무)을 사용하는 것입니다. 병원균 테스트를 거친 감귤류 새싹나무는 고급 병원균 제거 및 검출 기술을 사용하는 포괄적인 검역 프로그램 내에서 생산 및 유지됩니다^10,21. 캘리포니아 대학교 리버사이드의 감귤 클론 보호 프로그램(CCPP)은 캘리포니아의 감귤류를 보호하고 감귤류를 위한 전국 청정 식물 네트워크(National Clean Plant Network for Citrus^10,17,22)의 기능을 지원하기 위해 주와 미국으로 새로 수입된 감귤 품종과 감귤류 새싹 나무에서 매년 수천 개의 새싹나무 샘플을 테스트합니다. 대량의 감귤류 검사를 처리하기 위해 높은 처리량, 신뢰할 수 있고 비용 효율적인 병원체 검출 분석은 CCPP ^7,10,22와 같은 프로그램의 성공을 위한 기본 구성 요소입니다.

중합효소연쇄반응(PCR)과 같은 분자 기반 병원체 검출 분석을 통해 식물 진단 실험실에서 처리량을 크게 늘릴 수 있었지만, 경험상 고처리량 프로토콜 구현에서 가장 중요한 병목 현상 중 하나는 식물 조직 샘플 처리 단계입니다. 잎자루와 새싹 나무 껍질과 같은 체관부가 풍부한 조직을 처리하기 위해 현재 사용 가능한 프로토콜은 노동 집약적이고 시간이 많이 걸리며 값 비싸고 전문화 된 실험실 장비가 필요하기 때문에 감귤류의 경우 특히 그렇습니다. 이러한 프로토콜은 핵산 분해를 피하기 위해 저온에서 손으로 자르고, 무게를 측정하고, 동결건조하고, 분쇄하고, 원심분리하는 것을 필요로 한다 8,23,24. 예를 들어, CCPP 진단 실험실에서 샘플 처리에는 (i) 손 자르기(6-9 samples/h/operator), (ii) 동결 건조(16-24시간), (iii) 분쇄(30-60초) 및 (iv) 원심분리(1-2시간). 또한 이 공정에는 특수 소모품(예: 견고한 안전 잠금 튜브, 스테인리스 스틸 연삭 볼, 어댑터, 블레이드, 장갑)과 여러 개의 고가의 실험실 장비(예: 초저온 냉동고, 동결 건조기, 조직 분쇄기, 액체 질소 냉동 장치, 냉장 원심 분리기)가 필요합니다.

모든 산업과 마찬가지로 장비 엔지니어링 및 프로세스 자동화는 비용을 절감하고 처리량을 늘리며 고품질의 균일한 제품과 서비스를 제공하는 데 핵심적인 역할을 합니다. 감귤 산업은 작동에 최소한의 기술이 필요하며, 따라서 신속한 다운스트림 병원균 검출을 위한 높은 샘플 처리 용량을 허용하기 위해 진단 실험실 및 현장 작업으로 쉽게 이전할 수 있는 저비용 조직 처리 기기가 필요합니다. TES(Technology Evolving Solutions)와 CCPP는 체관부가 풍부한 감귤 조직(즉, 버드우드)의 신속한 처리를 위한 저비용(즉, 특수 실험실 장비의 필요성 제거) 기기를 개발(즉, 설계 및 제작) 및 검증(즉, 감귤 샘플로 테스트하고 표준 실험실 절차와 비교)했으며, 이는 버드우드 조직 추출기(BTE)라고 합니다. 그림 1에서 볼 수 있듯이 BTE에는 전력 및 제어를 위한 기본 구성 요소와 감귤 버드우드 가공을 위한 탈착식 챔버가 포함되어 있습니다. BTE 챔버는 감귤류 새싹에서 체관부가 풍부한 껍질 조직을 벗겨내도록 특별히 설계된 연삭 휠로 구성됩니다. 파쇄된 껍질 조직은 슬라이드 포트를 통해 추출 완충액이 들어 있는 주사기로 빠르게 배출되고, 여과되며, 추가 취급이나 준비 없이 핵산 추출 및 정제를 위해 준비됩니다(그림 1). BTE 시스템에는 종이 없는 샘플 추적 애플리케이션과 통합 계량 애플리케이션이 포함되어 있어 샘플 처리 정보를 온라인 데이터베이스에 실시간으로 기록합니다.

BTE 시스템은 CCPP의 실험실 진단 능력을 100% 이상 증가시켰으며 PCR 분석을 사용하여 고품질 핵산의 정제 및 감귤류의 이식편 전염성 병원체의 다운스트림 검출에 적합한 감귤류 조직 추출물을 지속적으로 생산했습니다. 보다 구체적으로, BTE는 조직 처리 시간을 샘플 당 24 시간 이상에서 ~ 3 분으로 단축하고 $ 60,000 이상의 비용이 드는 실험실 장비를 교체했으며 (그림 2, 2-4 단계) 더 큰 샘플 크기를 처리 할 수있었습니다.

이 논문은 각각 CCPP Rubidoux 검역 시설 및 Lindcove 재단 시설의 모든 적절한 양성 및 음성 대조군을 포함하여 소스 나무의 감귤 새싹 샘플을 사용한 BTE 고처리량 감귤 껍질 조직 처리, 핵산 추출 및 병원체 검출 검증 데이터를 제시합니다. 또한 현재 실험실 절차와 비교한 처리량 및 처리 시간 변화를 제시합니다(그림 2). 또한 이 작업은 감귤류 병원균 테스트 실험실을 위한 상세한 단계별 프로토콜을 제공하고 BTE가 병원균 청정 종묘장, 조사 및 박멸 프로그램의 기능을 지원할 수 있는 방법을 보여줍니다.

그림 1: 버드우드 조직 추출기. BTE에는 전원 및 제어를위한 기본 구성 요소와 감귤류 버드 우드 처리를위한 탈착식 챔버가 포함되어 있습니다. BTE 챔버는 감귤류 새싹에서 체관부가 풍부한 껍질 조직을 벗겨내도록 특별히 설계된 연삭 휠로 구성됩니다. 파쇄된 껍질 조직은 슬라이드 포트를 통해 주사기로 빠르게 배출되고 여과되며 추가 취급이나 준비 없이 핵산 추출 및 정제를 위해 준비됩니다. 약어: BTE = budwood tissue extractor. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 기존의 수동 절단 실험실 절차와 BTE 공정 간의 단계별 비교. BTE 처리는 고처리량 감귤류 껍질 조직 처리, 핵산 추출 및 병원체 검출을 포함한다. 각 단계의 시간은 괄호 안에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

프로토콜

1. 배송할 감귤류 새싹 샘플 수집

1. Technology Evolving Solutions에 트리 정보 스프레드시트를 보내 웹 서버에 로드할 수 있도록 합니다(결국 사용자는 새 트리를 생성하게 됩니다).
2. 전화 앱 TES 추적기 를 사용하여 트리를 선택하고 NFC(근거리 통신) 칼라 태그를 전화기에 대고 나무 정보를 태그에 로드합니다.
3. 3-4 개의 감귤류 버드 우드 샘플을 BTE 호환 비닐 봉지 캐리어에 넣고 뚜껑을 닫습니다.
   1. 버드우드의 길이가 8인치를 초과하지 않고 5인치 이상인지 확인하십시오.
      1. 길이가 8인치보다 큰 경우 멸균 일회용 면도날이나 10% 표백제 용액(1% 차아염소산나트륨)으로 오염을 제거한 가지치기 가위를 사용하여 길이를 짧게 만듭니다.
      2. 길이가 5인치 미만인 경우 다른 버드우드 샘플을 수집하여 가방에 넣습니다.
   2. 겨드랑이의 성장이나 큰 가시는 손으로 제거하거나 10% 표백제 살균 절단 도구(1% 차아염소산나트륨)를 사용하여 제거해야 합니다.
      알림: 이 단계는 챔버 개구부에서 새싹이 더 쉽게 움직일 수 있도록 중요합니다.
   3. 곡선 형상이 있는 새싹 샘플이 없는지 확인합니다. 만약 그렇다면, 10% 표백제 살균 절삭 공구(1% 차아염소산나트륨)를 사용하여 제거하고, 샘플의 직선 부분만을 BTE 백에 넣는다.
      알림: 구부러진 새싹은 악기 안으로 들어가기가 매우 어렵기 때문에 껍질 줄무늬가 고르지 않습니다.
4. 전화 앱 TES 추적기 를 사용하여 나무의 NFC 칼라 태그를 스캔하고 샘플 백의 NFC 클립 태그와 연결합니다.
5. 작업자가 BTE 챔버 내부의 체관부가 풍부한 새싹 나무 껍질을 벗겨내는 방법을 결정하는 버드우드의 두께에 주의하십시오.
   1. 새싹의 두께가 0.20인치 미만인 경우 챔버의 고속 회전실이 전체 새싹나무를 코어, 나무 껍질 층을 넘어 나무와 속의 체관이 없는 조직으로 분쇄하기 때문에 새싹을 벗기는 동안 주의하십시오.
   2. 체관부가 풍부하지 않은 새싹 조직을 피하면서 나무 껍질 조직을 벗겨내는 것이 더 쉽기 때문에 두꺼운 새싹을 선택하십시오.
6. 샘플을 몇 개의 얼음 팩과 함께 단열 된 선적 컨테이너에 넣습니다.

2. 흄 후드에 설치

알림: 흄 후드 내부에서 BTE를 작동하는 것이 좋습니다. 이렇게 하면 식물 조직 교차 오염 및 실험실 오염의 위험을 줄일 수 있습니다.

1. 10%(1% 차아염소산나트륨) 스프레이 병을 사용하여 소독합니다.
   1. 후드 표면에 스프레이를 뿌리고 표백제를 약 1분 동안 그대로 두었다가 종이 타월로 닦습니다.
   2. 종이 타월에 표백제 용액을 뿌립니다. TE 베이스, 체중계 구성 요소(체중계, 에어 쉴드 및 타워) 및 마커 펜을 닦습니다.
2. 처리할 샘플 수에 대한 주사기 세트의 포장을 풀고 덮개가 있는 판지 상자 안에 넣습니다.
3. 필요한 경우를 대비하여 후드 외부에 면봉 팩을 준비하십시오.
4. 체중계를 준비합니다.
   1. 체중계에서 웨이트 타워를 제거하고 전원 버튼을 길게 눌러 켭니다. 눈금이 0을 표시한 후 타워를 눈금 중앙에 놓습니다.
   2. 체중계 에어 실드를 체중계 전면 위로 밉니다.
5. 뒷면의 스위치를 뒤집어 조직 추출기 베이스를 준비합니다. 상자 왼쪽의 스위치가 상단에서 눌러져 있는지 확인합니다. 챔버가 준비되었음을 나타내는 깜박이는 녹색 LED를 기다립니다.

3. 청소 스테이션을 설정합니다(보충 그림 S1).

1. 초음파 세척기에 물 1L를 넣습니다.
2. 초음파 세척기 위에 두 개의 쓰레기 봉투를 감쌉니다.
3. ~ 5L의 10 % 표백제 (1 % 차아 염소산 나트륨 용액)를 초음파 세척기에 붓습니다.
4. 챔버가 잠길 만큼 충분한 물을 물통에 채우십시오.
5. 공기 압축기를 켜고 밸브를 엽니다.
6. 챔버가 건조되는 동안 액체를 잡을 수 있도록 배경을 설정하십시오.

4. 감귤류 버드우드 껍질 스트리핑을 위한 BTE용 재료 가공

1. 챔버를 BTE 베이스에 로드합니다.
   1. BTE 챔버를 준비하십시오.
      1. 빈 샘플 백을 챔버 뒤쪽에 부착합니다. 두 개의 O-링을 사용하여 빈 백을 BTE 챔버의 후면 노즐에 고정합니다.
      2. 블레이드가 플라스틱으로 계속되는 블레이드에 형성된 절단 또는 팁에 형성되는 절단과 같은 마모 또는 손상의 징후가 있는지 검사합니다. 블레이드의 화살표가 단일 잠금 기호와 일치하는지 확인합니다.
      3. 챔버 바닥의 공기 방출이 O 기호 쪽으로 향하고 있는지 확인합니다. 챔버 개구부 위에 투명 뚜껑을 놓고 챔버 오른쪽에 있는 트랙을 사용하여 투명 BTE 슬라이드를 챔버에 밀어 넣습니다. 챔버 바닥의 잠금 장치를 슬라이드 안으로 최대한 밀어 넣습니다. 플런저 캡이 슬라이드 상단에 장착되어 있는지 확인하십시오.
   2. BTE 베이스의 노즐이 챔버 뒤쪽으로 돌출된 상태에서 챔버를 BTE 베이스에 놓습니다. 파란색 LED가 깜박일 때까지 기다렸다가 배치가 성공했음을 나타냅니다.
2. NFC 클립 태그의 흰색 스티커를 상자 오른쪽의 Z로 이동하여 샘플을 BTE 베이스에 로드합니다. 노란색 표시등이 깜박이기 시작할 때까지 Z에서 느린 원을 그리며 태그를 움직입니다. 샘플을 BTE 베이스에 부착하고 샘플 백에 구멍이 없는지 확인하십시오. 구멍이 있으면 테이프로 패치하십시오. 샘플 백 위에 O-링을 놓아 BTE 노즐 전면에 고정합니다.
3. 사용하지 않은 주사기 세트를 로드합니다.
   1. 주사기 세트의 용기를 가중시킵니다. 사용하지 않은 주사기 세트를 저울 타워에 놓습니다. 빨간색 표시등이 깜박이기 시작하거나 체중계에 0이 표시되면 주사기 세트를 제거합니다.
   2. 필터가 있는 주사기에서 플런저를 제거합니다. 유체가 바닥(필터가 아닌) 주사기에 있는지 확인하십시오. 플런저를 종이 타월이나 검은색 플런저가 표면에 닿지 않는 타워에 따로 두십시오.
   3. 출구 포트를 주사기에 넣고 90° 돌려 주사기를 슬라이드 출구 포트에 부착합니다.
4. 버드우드 샘플을 처리합니다.
   주의 : BTE에는 고속 움직이는 부품이 있습니다. 모든 작업은 흄 후드 내부에서 이루어져야 합니다. 모든 사용자는 보호 안경, 귀마개(귀마개) 및 장갑 및 실험복과 같은 기타 모든 개인 보호 장비(PPE)를 사용해야 합니다.
   1. 상단 검은색 버튼을 눌러 기기를 시작합니다. 두 번 누르면 처리 중 언제든지 모터가 중지됩니다.
      알림: 상자에는 제대로 작동하는지 확인하기 위해 속도 및 온도 감지 기능이 있습니다.
   2. 가방을 통해 하나의 버드 우드 스틱을 잡고 BTE 노즐의 상단 을 통해 넣습니다.
   3. 다른 손으로 챔버의 반대편에 있는 버드우드 스틱을 잡고 천천히 칼날 안으로 내려갑니다. 새싹 나무가 껍질을 벗기고 있음을 나타내는 부드러운 윙윙 거리는 소리에 귀를 기울이십시오. 버드우드를 회전시키면서 천천히 앞뒤로 움직입니다.
      1. 크고 공격적인 베는 소리가 들리면 빠르게 분기를 상단으로 이동하거나 상단 버튼을 눌러 모터를 중지하십시오. 모터를 중지하려면 오른쪽 스위치를 사용하여 처리를 마칩니다(4.4.3.2단계 참조).
      2. 절단할 때 출구에서 재료가 나오지 않으면 챔버가 막힌 것입니다. 모터를 끄고 슬라이드 플런저 캡을 제거한 다음 면봉의 플라스틱을 사용하여 막힌 부분을 기계 출구로 밀어냅니다. 오른쪽 스위치를 사용하여 처리를 마칩니다: 위로 = 정방향 절단; 중간 = 모터 꺼짐; 아래쪽 = 역방향 절단.
   4. 나머지 분기에 대해 4.4.2단계와 4.4.3단계를 반복합니다.
      알림: 충분한 새싹 나무 껍질이 벗겨졌다는 일반적인 지표는 주사기의 25%가 식물 조직으로 채워졌을 때입니다. 감귤류의 이식편 전염성 병원균은 나무에 고르지 않게 분포 될 수 있습니다. 따라서 3-4 개의 버드 우드 샘플이 감귤 나무 캐노피 주변에서 수집됩니다. BTE 캐리어 백의 모든 버드우드 샘플이 최종 분쇄 조직 샘플에 기여하여 전체 나무 대표 샘플이 병원균에 대해 테스트되도록 하는 것이 중요합니다.
   5. 상단 검은색 버튼을 눌러 처리를 중지합니다. 표시등이 다시 노란색으로 깜박이기 시작할 때까지 기다리십시오.
5. 샘플 무게를 확인합니다.
   1. 주사기를 90° 회전하고 아래로 당겨 분리합니다. 플런저를 주사기에 다시 놓고 주사기를 타워에 놓습니다.
   2. 저울이 샘플을 자동으로 감지할 때까지 기다렸다가 적절한 무게 범위(0.25g ± 0.05g) 내에 있는지 확인합니다. 샘플 무게가 너무 낮으면(<0.20g) 4.4단계를 반복합니다. 빨간색 LED가 깜박이기 시작합니다. 샘플 무게가 너무 높으면(>0.30g), 샘플 재료의 일부를 제거하십시오. 노란색 LED가 더 천천히 깜박이기 시작합니다. 만약 sample이 범위 내에 있으면 녹색 LED가 깜박이기 시작합니다.
6. 새싹 시료 균질화
   1. 샘플이 있는 주사기에서 플런저를 제거하고 샘플이 있는 주사기에 유체를 밀어 넣은 다음 플런저를 다시 추가합니다. 플런저는 버퍼와 식물 수액을 메쉬 필터(큰 껍질 조직 조각은 제외)와 고무 튜브를 통해 빈 주사기로 밀어 넣습니다.
   2. 버퍼와 식물 수액을 한 주사기에서 다른 주사기로 앞뒤로 밀어 샘플을 혼합합니다. 샘플이 균질한 녹색 액체 혼합물이 될 때까지 ~3x-4x를 반복합니다.
   3. 잘 균질화되면 메쉬 필터 없이 식물 수액 샘플을 주사기에 밀어 넣고 샘플이 있는 주사기에서 필터가 있는 고무 튜브와 주사기를 분리합니다.
   4. 주사기에서 식물 수액 샘플을 2mL 멸균 미세 원심분리기 튜브로 배출하고 추가 사용이 있을 때까지 -20°C에서 보관합니다. 영구 마커를 사용하여 백 번호로 샘플에 라벨을 붙입니다.
      참고: 4.6.5단계의 식물 샘플 수액은 이제 핵산 추출 및 정제(7단계 참조) 및 감귤류의 이식편 전염성 병원체의 다운스트림 검출(8단계 참조)을 위해 페놀-클로로포름, 실리카 컬럼 또는 마그네틱 비드 9,25,26,27을 기반으로 하는 추출 방법인 사용 가능한 핵산, RNA 또는 DNA^, 추출 방법으로 처리할 수 있습니다.

5. BTE 탈착식 챔버 살균

주의 : 주사기 세트의 버퍼가 챔버나 슬라이드에 닿으면 세척하기 전에 헹구고 실험실의 모든 안전 규칙을 따르십시오. 주사기 세트에는 구아니딘 티오시아네이트가 포함되어 있습니다. 주사기 세트의 완충액이 표백제와 접촉하면 시안화물 가스가 생성됩니다.

1. 챔버에서 10번째 샘플을 처리한 후 다음 단계를 수행합니다. 녹색 LED는 파란색으로 깜박이는 대신 계속 깜박입니다.
2. 가능한 모든 오염 물질을 청소하기 위해 BTE 챔버를 분해하십시오. 투명 플라스틱 덮개를 제거하고, 챔버 슬라이드를 청소하고, 챔버 슬라이드의 막힌 포트를 청소합니다.
3. 챔버 바닥의 공기 방출 밸브를 열림 위치(자물쇠 표시 열림)로 돌립니다. 챔버 구성 요소를 설정 초음파 세척기에 넣습니다(3.1단계 참조). 뚜껑이 뜨지 않도록 챔버 아래에 뚜껑을 놓습니다. 초음파 세척기를 15 분 동안 작동시킵니다.
   참고: 초음파 세척 수조(5L)는 최대 2개의 챔버를 수용할 수 있습니다.
4. 챔버 구성 요소를 수조(3.4단계)에서 최소 30초 동안 헹굽니다. 챔버 구성 요소를 건조 스테이션으로 이동합니다.
   주의 : 건조하면 챔버 내에서 부품이 빠르게 움직이고 큰 소음(~85데시벨[dB])이 발생하며 튀길 수 있습니다. 모든 사용자는 운영 실험실의 안전 규칙에서 요구하는 대로 보호 안경, 귀마개(귀마개), 실험복 및 기타 모든 PPE를 사용해야 합니다.
5. BTE 챔버를 건조시킵니다.
   1. 챔버의 상부 개구부의 홈(일반적으로 슬라이드가 있는 위치)과 일직선으로 에어건을 배치합니다. 총의 방아쇠를 눌러 ~30초 동안 공기를 분배합니다.
      알림: 개구부가 사용자로부터 배경 방향으로 떨어져 있는지 확인하십시오. 이렇게 하면 블레이드 세트가 회전하여 그 아래에 갇힌 액체가 제거됩니다.
   2. 에어건을 챔버의 상단 노즐 쪽으로 배치합니다. 에어건의 방아쇠를 누르고 각 노즐 입구의 세 개의 완전한 원을 천천히 추적합니다.
   3. 에어건을 BTE 중앙에 놓습니다. 가장 안쪽 지점에서 시작하여 방아쇠를 누른 상태에서 에어건이 슬라이드가 있는 곳을 가리킬 때까지 이동합니다.
   4. 표면수를 외부에서 빼내기 위해 전면과 후면의 전체 챔버에 공기를 빠르게 흐르게 합니다.
6. BTE 슬라이드를 건조시킵니다.
   1. 에어건을 슬라이드의 플런저 슬롯에 놓고 방아쇠를 눌러 슬라이드 출구에서 물을 배출합니다.
   2. 슬라이드의 내부 표면을 따라 에어건을 작동시켜 건조시킵니다.
   3. 슬라이드 홈을 따라 에어건을 작동시켜 물을 밀어냅니다.
   4. 전체 외부에 공기를 빠르게 흐르게 하여 지표수를 제거합니다.
7. 구성 요소를 건조시킵니다.
   1. 슬라이드 플런저 캡과 O-링을 손에 들고 방아쇠를 당깁니다.
   2. 뚜껑 안쪽 표면에 공기총을 쏘십시오.
   3. 구성 요소를 챔버에 넣고 밀어서 건조를 계속하거나 재조립합니다.
      참고: 여러 기능성 BTE가 있는 높은 조직 처리 환경의 경우 10개의 챔버를 동시에 오염을 제거할 수 있는 배치 살균 시스템을 제공할 수 있습니다.

6. 폐기 및 살균

1. 주사기와 고무 튜브는 지정된 구아니딘 폐기물 용기에 버리십시오.
2. 생물학적 유해 폐기물 용기에 있는 모든 식물 재료를 폐기하십시오.
3. BTE 베이스로부터 BTE 챔버를 제거한다.
4. BTE 챔버를 분해하고 5단계에서 설명한 대로 오염 제거를 진행합니다.

7. 감귤 새싹나무 추출물로부터 정제된 BTE RNA의 조직 처리 및 품질의 평가

참고: 이 프로토콜에서는 255개의 감귤 나무에서 채취한 새싹나무 샘플을 사용하여 감귤류 새싹나무 조직 처리에 필요한 시간과 BTE에 의해 제조된 껍질 조직 추출물로부터 정제된 RNA의 품질을 비교했습니다(그림 2, 오른쪽, 1단계, 5단계 및 6단계) 손으로 껍질을 벗기고 자르는 것을 사용하여 규제적으로 승인된 감귤 새싹나무 조직 처리 방법에 따라 제조된 것과 비교합니다. Dang et ^al.23 에 의해 기술된 바와 같이 껍질 조직의 동결 건조, 분쇄 및 원심분리(그림 2, 왼쪽, 단계 1-6).

1. 현재 실험실 절차: 규정상 승인된 방법²³에 따라 조직 처리를 위해 새싹 샘플을 준비합니다.
   1. Dang et ^al.23 에 설명된 대로 껍질 조직의 손으로 껍질을 벗기고 자르고, 동결 건조, 분쇄, 원심분리하고, 식물 수액을 RNA 추출 튜브로 옮깁니다(그림 2, 왼쪽, 1-6단계).
   2. 각각의 시험된 나무로부터 3 내지 4개의 버드우드 샘플을 손으로 박리한 후, 모든 버드우드를 BTE-상용성 비닐 봉지 캐리어 안에 넣고, BTE 처리가 될 때까지 4°C에서 저장한다 (단계 7.2).
2. BTE 절차: BTE 감귤 버드우드 조직 처리를 개시한다 (섹션 4, 단계 4.1-4.6; 그림 2, 오른쪽, 1단계, 5단계 및 6단계).
   1. 7.1.2 단계에서 BTE 캐리어 백 안에 보관 된 버드 우드 샘플을 사용하십시오.
3. 규제적으로 승인된 반자동 자기 비드^{기반 방법} 8,23,28을 사용하여 현재의 실험실 절차(단계 7.1.1) 및 BTE 절차(단계 7.2.2)로부터 얻은 식물 수액으로부터 RNA를 추출하고 정제한다.
4. 농도, 순도 및 무결성을 측정하여 RNA 품질을 평가합니다 ^{8,23,24,29,3 3,31}.
   1. 농도를 계산하려면 260nm 파장에서 분광 광도계와 광학 밀도(OD)를 사용하십시오.
   2. 순도를 평가하려면 260/280의 분광 광도계 OD 비율을 사용하십시오.
   3. 무결성을 확인하려면 NADH 탈수소효소 감귤류 유전자^24,32의 mRNA를 표적으로 하는 역전사(RT) 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 반응을 사용하십시오.

8. BTE 감귤류 새싹 추출물로부터 정제된 RNA를 이용한 감귤류 바이러스 및 바이로이드의 교차 오염 및 검출 평가

참고: 이 프로토콜에서, 우리는 BTE에 의해 처리될 때 샘플 사이의 교차 오염 가능성을 평가하기 위해 72개의 감염되지 않은 감귤 나무와 바이러스 및 바이로이드에 혼합된 1그루의 새싹 샘플을 사용했습니다(그림 2, 오른쪽, 1단계, 5단계 및 6단계) 및 감귤류 바이러스 및 바이로이드의 RT-qPCR 검출을 위한 템플릿으로 사용하기 위해 BTE에 의해 제조된 껍질 조직 추출물로부터 정제된 RNA의 적합성.

1. 제1 BTE 샘플 처리: 72개의 비감염 샘플로 기준선 실험을 수행한다.
   1. 3 개의 (A-C) BTE 챔버를 준비합니다 (4.1.1 단계).
   2. 모든 비감염 감귤류 새싹나무 샘플(1-72)을 BTE 담체 백에 준비하고, 각 샘플에 대해 하나의 주사기 시스템을 사용하여 2개의 시린지 BTE 샘플 수집 시스템에서 동일한 수(72)를 준비한다(단계 2.4).
   3. 샘플 캐리어 백과 샘플 수집 주사기를 각각 12개의 샘플로 구성된 6개의 배치(I-VI)로 분리합니다.
   4. BTE 감귤 버드우드 조직 프로세싱을 아래의 순서 (단계 8.1.4.1-8.1.4.6)에 따라 개시한다 (표 1, 제 1 BTE 샘플 프로세싱 참조).
      1. 배치 I/샘플 1-12의 경우, 챔버 A를 사용하여 12개의 샘플을 처리하고, 샘플 12 후에 챔버 A를 살균합니다(5단계).
      2. 배치 II/샘플 13-24의 경우 샘플 12를 처리합니다.amp챔버 B를 사용하여 샘플 24(5단계).
      3. 배치 III/샘플 25-36의 경우 챔버 C를 사용하여 12개의 샘플을 처리합니다. 샘플 36 후 챔버 C를 살균합니다(5단계).
      4. 배치 IV/샘플 37-48의 경우 12개의 샘플을 살균된 챔버 A를 사용하여 처리합니다(단계 8.1.4.1).
      5. 배치 V/S의 경우amp49--60, 12개의 s를 처리amp살균된 챔버 B를 사용합니다(단계 8.1.4.2).
      6. 배치 VI/샘플 60-72의 경우 살균된 챔버 C를 사용하여 12개의 샘플을 처리합니다(단계 8.1.4.3).
   5. 모든 샘플과 함께 BTE 캐리어 백을 4°C에서 단계 8.2에서 사용할 때까지 보관하십시오.
   6. 8.1.4.1-8.1.4.6단계에서 생성된 72개의 식물 수액 샘플에서 규제적으로 승인된 반자동 마그네틱 비드 기반 방법 8,23,28을 사용하여 RNA를 추출하고 정제합니다.
   7. 이전에 설명한 바와 같이 감귤류 바이러스 및 바이로이드의 검출을 위해 RT-qPCR을 수행하십시오 ^8,33.
2. 제2 BTE 샘플 프로세싱을 위해, 70개의 비감염 샘플 및 2개의 혼합된 감염된 샘플로 교차-오염 실험을 수행한다.
   1. 3 개의 (A-C) BTE 챔버를 준비합니다 (4.1.1 단계).
   2. 총 2개의 감염된 샘플에 대해 2개의 BTE 담체 백(단계 1.3)에 혼합-감염된 감귤 버드우드 샘플(73)을 준비한다.
   3. 총 70개의 비감염 샘플에 대해 샘플 3-배치 I 및 샘플 51-배치 V(단계 8.2.4의 샘플 교체 참조)를 제외하고 단계 8.1.5에서 감염되지 않은 감귤류 버드우드 샘플과 함께 BTE 캐리어 백을 수집합니다.
   4. 총 72개의 샘플에 대해 배치 I에서 샘플 3 대신에 혼합-감염된 샘플 73을 갖는 제1 BTE 캐리어 백을 포함시키고, 배치 V에서 샘플 51 대신에 제2 캐리어 백을 포함한다.
   5. 각 샘플에 대해 하나의 이중 주사기 시스템을 사용하여 2-주사기 BTE 샘플 수집 시스템에서 동일한 번호(72)를 준비합니다(2.4단계).
   6. 72개의 샘플 캐리어 백과 샘플 수집 주사기를 각각 12개의 샘플로 구성된 6개의 배치(I-VI)로 분리합니다.
   7. BTE 감귤류 버드우드 조직 처리(단계 4)를 개시하고, 단계 8.1.4.1-8.1.4.6에서와 동일한 서열에 따른다.
      참고: 유일한 차이점은 배치의 샘플 3 및 배치의 샘플 51을 감염된 샘플 73(단계 8.2.4)으로 교체하는 것입니다(표 1, 두 번째 BTE 샘플 처리).
   8. 단계 8.1.6에서와 같이 단계 8.2.7에서 생성된 72개의 식물 수액 샘플로부터 RNA를 추출하고 정제한다.
   9. 8.1.7단계에서와 같이 감귤류 바이러스 및 바이로이드 검출을 위해 RT-qPCR을 수행합니다.

결과

BTE 처리된 버드우드 감귤 조직을 이용한 RNA 추출, 정제 및 품질 및 조직 처리 시간 평가
본 발명자들은 BTE로부터의 RNA 품질을 표준 절차와 비교하기 위해 이 시험을 위해 255개의 대표적인 감귤 나무로부터의 버드우드 샘플을 사용하였다. 샘플은 버드우드 조직 추출기(BTE)에 의해 처리되거나(프로토콜 단계 4.1-4.6 및 그림 2, 오른쪽, 단계 1, 단계 5 및 단계 6) Dang et ^al.23

토론

HLB 감귤병의 출현과 함께 손실을 줄이기 위해 감귤 산업, 규제 기관 및 진단 실험실은 질병 관리 관행과 함께 개별 나무 테스트를 위해 qPCR³⁴ 와 같은 저처리량 수동 샘플 처리 및 병원체 검출 분석과 결합된 고처리량 핵산 추출 방법에 의존할 것을 촉구받았습니다³⁵. 캘리포니아의 HLB 양성률은 2012년 0.01%에서 2020년 1.2%로 증가했습니다. qPCR은 강력하고 신뢰할 수 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.08" Hex Trimmer line	PowerCare	FPRO07065	Needed to replace blades.
1 Hp, 8 gal air compressor	California Air Tools	8010	Quickly dry chambers after rinsed
1.5 mL microcentrifuge tube	Globe Scientific	111558B	Store sample in after swishing with syinges
10 mL Syringe Set	Technology Evolving Solutions	TE006-F1-10A-G1000-E1	Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING - contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required - do not mix with bleach
12" Ruler	Westcott	‎16012	To measure trimmer line before cutting
12% Sodium Hypochlorite	Hasa	1041	Disinfects chambers after processing
-20 C Freezer	Insignia	NS-CZ70WH0	Store sample after processing
4" x 12" plastic bags	Plymor	FP20-4x12-10	Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal
6" Cotton Swab	Puritan	806-PCL	Swab to remove clogs
7 Gallon Storage Tote	HDX	206152	Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers
Air blow gun	JASTIND	‎JTABG103A	Directs air into the chambers at high pressure
Black Sharpie	Sharpie	S-19421	Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later
Bottle Top Dispensor	Brand	Z627569	Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe
BTE Chamber	Technology Evolving Solutions	TE002BB-A05-E1	Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool
Dish Soap	Dawn	57445CT	Surfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber
Fume hood with hepa filter	Air Science	P5-36XT-A	Fume hood with hepa filter (ASTS-030)  to limit possible contamination and protect against chemical spills
Insulated foam shipping container	PolarTech	261/J50C	Insulated shipping container to ship samples on ice after they are collected
Lab coat	Red Kap	KP14WH LN 46	Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills
Laptop	Microsoft	Surface	Wifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base
NFC Capable Phone	Samsung	Galaxy S9	Phone to download and use TES phone app
NFC clip tag	Technology Evolving Solutions	TE005-Clip-E1	Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app
NFC Collar Tag	Technology Evolving Solutions	TE005-Collar-E1	Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app
Nitrile Gloves	Usa Scientific	3915-4400	Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills
Noise-Reducing Earmuff	3M	90565-4DC-PS	Protect ears while operating air compressor and tissue processing base
Polyurethane Recoil Air Hose	FYPower	‎510019	Attaches air gun to compressor
Saftey glasses	Solidwork	SW8329-US	Protect eyes for chemical and physical hazards
Spray bottle	JohnBee	B08QM81BJV	Spray bleach to deconatinate surfaces
Tissue Extractor Base	Technology Evolving Solutions	TE001-A-E1	System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench
Tissue Processing Base Weight Scale	Technology Evolving Solutions	TE003-A05-200g-01-E1	200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield
Vermiculite	EasyGoProducts	B07WQDZGRP	Needed to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service
Wire Cutter	Boenfu	‎BOWC-06002-US	Wire cutters to cut trimmer line