Automatisierung der Verarbeitung von Zitrusblütenholz für den nachgelagerten Nachweis von Krankheitserregern durch Gerätetechnik

Zusammenfassung

Wir haben ein Instrument entwickelt, hergestellt und validiert, das phloemreiches Rindenknospenknospengewebe schnell verarbeitet. Im Vergleich zu aktuellen Methoden hat der Knospenholz-Gewebeextraktor (HdO) den Probendurchsatz erhöht und die erforderlichen Arbeits- und Gerätekosten gesenkt.

Zusammenfassung

Durch Transplantate übertragbare, phloembegrenzte Krankheitserreger von Zitrusfrüchten wie Viren, Viroide und Bakterien sind weltweit für verheerende Epidemien und schwerwiegende wirtschaftliche Verluste verantwortlich. Zum Beispiel hat das Citrus-Tristeza-Virus weltweit über 100 Millionen Zitrusbäume getötet, während "Candidatus Liberibacter asiaticus" Florida 9 Milliarden Dollar gekostet hat. Die Verwendung von pathogengetestetem Zitrusknospenholz für die Baumvermehrung ist der Schlüssel zur Bekämpfung solcher Krankheitserreger. Das Citrus Clonal Protection Program (CCPP) an der University of California, Riverside, verwendet Polymerase-Kettenreaktions-Assays (PCR), um jedes Jahr Tausende von Proben von Zitrusblütenbäumen zu testen, um die kalifornischen Zitrusfrüchte zu schützen und dem National Clean Plant Network saubere Vermehrungseinheiten zur Verfügung zu stellen. Ein schwerwiegender Engpass beim molekularen Hochdurchsatznachweis von Zitrusviren und Viroiden ist der Verarbeitungsschritt des Pflanzengewebes.

Die richtige Gewebepräparation ist entscheidend für die Extraktion hochwertiger Nukleinsäuren und die nachgelagerte Verwendung in PCR-Assays. Das Zerkleinern, Wiegen, Gefriertrocknen, Mahlen und Zentrifugieren von Pflanzengewebe bei niedrigen Temperaturen, um den Abbau von Nukleinsäuren zu vermeiden, ist zeit- und arbeitsintensiv und erfordert teure und spezialisierte Laborgeräte. In diesem Artikel wird die Validierung eines speziellen Instruments vorgestellt, das entwickelt wurde, um phloemreiches Rindengewebe aus Zitrusknospenholz schnell zu verarbeiten, das als Knospengewebeextraktor (HdO) bezeichnet wird. Das HdO erhöht den Probendurchsatz um 100 % im Vergleich zu aktuellen Methoden. Darüber hinaus senkt es den Arbeitsaufwand und die Kosten für die Ausrüstung. In dieser Arbeit wiesen die HdO-Proben eine DNA-Ausbeute (80,25 ng/μL) auf, die mit dem Handhackprotokoll des CCPP (77,84 ng/μL) vergleichbar war. Dieses Instrument und das Protokoll zur schnellen Verarbeitung von Pflanzengewebe können mehreren diagnostischen Zitruslaboren und -programmen in Kalifornien zugute kommen und zu einem Modellsystem für die Gewebeverarbeitung für andere holzige mehrjährige Kulturen weltweit werden.

Einleitung

Durch Transplantate übertragbare phloembegrenzte Krankheitserreger von Zitrusfrüchten, wie Viroide, Viren und Bakterien, haben in allen Zitrusanbaugebieten der Welt verheerende Epidemien und schwerwiegende wirtschaftliche Verluste verursacht. Zitrusviroide sind limitierende Produktionsfaktoren aufgrund der Exokortis- und Kachexie-Krankheiten, die sie bei wirtschaftlich wichtigen Zitrusarten wie Dreiblatt, Dreiblatthybriden, Mandarinen, Clementinen und Mandarinen verursachen ^1,2,3. In Kalifornien sind diese viroidempfindlichen Zitrussorten die Grundlage für den wachsenden und ....

Protokoll

1. Sammeln der Zitrusknospenholzproben für den Versand

1. Senden Sie Technology Evolving Solutions eine Tabelle mit Bauminformationen, die sie in ihren Webserver laden können (schließlich wird der Benutzer neue Bäume erstellen).
2. Verwenden Sie den TES-Tracker der Telefon-App, um einen Baum auszuwählen, und halten Sie ein NFC-Halsband-Tag (Near Field Communication) an das Telefon, um die Bauminformationen in den Tag zu laden.
3. Legen Sie drei bis vier Zitrusknospenholzproben in den BTE-kompatiblen Plastikbeutelträger und verschließen Sie ihn mit dem Deckel.
   1. Stellen Sie sicher, dass die Länge des Knospenho....

Ergebnisse

RNA-Extraktion, -Aufreinigung und -Qualität unter Verwendung von HdO-verarbeitetem Knospenholz-Zitrusgewebe und Bewertung der Zeit für die Gewebeverarbeitung
Für diesen Test haben wir Knospenholzproben von 255 repräsentativen Zitrusbäumen verwendet, um die RNA-Qualität des HdO mit dem Standardverfahren zu vergleichen. Die Proben wurden mit dem Knospenholz-Gewebeextraktor (HdO) verarbeitet (Protokollschritte 4.1-4.6 und Abbildung 2, rechte Seite, Schritt 1, Schritt 5 und Schritt 6) oder nach der .......

Diskussion

Mit dem Aufkommen der HLB-Zitruskrankheit wurden die Zitrusindustrie, die Zulassungsbehörden und die Diagnoselabore aufgefordert, sich auf Nukleinsäureextraktionsmethoden mit hohem Durchsatz in Kombination mit manueller Probenverarbeitung mit niedrigem Durchsatz und Assays zum Nachweis von Krankheitserregern wie qPCR³⁴ für die Untersuchung einzelner Bäume in Kombination mit Krankheitsmanagementpraktiken^{zu verlassen 35}. Die HLB-Positivitätsrate in Kalifornien ist von 0,.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.08" Hex Trimmer line	PowerCare	FPRO07065	Needed to replace blades.
1 Hp, 8 gal air compressor	California Air Tools	8010	Quickly dry chambers after rinsed
1.5 mL microcentrifuge tube	Globe Scientific	111558B	Store sample in after swishing with syinges
10 mL Syringe Set	Technology Evolving Solutions	TE006-F1-10A-G1000-E1	Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING - contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required - do not mix with bleach
12" Ruler	Westcott	‎16012	To measure trimmer line before cutting
12% Sodium Hypochlorite	Hasa	1041	Disinfects chambers after processing
-20 C Freezer	Insignia	NS-CZ70WH0	Store sample after processing
4" x 12" plastic bags	Plymor	FP20-4x12-10	Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal
6" Cotton Swab	Puritan	806-PCL	Swab to remove clogs
7 Gallon Storage Tote	HDX	206152	Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers
Air blow gun	JASTIND	‎JTABG103A	Directs air into the chambers at high pressure
Black Sharpie	Sharpie	S-19421	Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later
Bottle Top Dispensor	Brand	Z627569	Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe
BTE Chamber	Technology Evolving Solutions	TE002BB-A05-E1	Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool
Dish Soap	Dawn	57445CT	Surfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber
Fume hood with hepa filter	Air Science	P5-36XT-A	Fume hood with hepa filter (ASTS-030)  to limit possible contamination and protect against chemical spills
Insulated foam shipping container	PolarTech	261/J50C	Insulated shipping container to ship samples on ice after they are collected
Lab coat	Red Kap	KP14WH LN 46	Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills
Laptop	Microsoft	Surface	Wifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base
NFC Capable Phone	Samsung	Galaxy S9	Phone to download and use TES phone app
NFC clip tag	Technology Evolving Solutions	TE005-Clip-E1	Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app
NFC Collar Tag	Technology Evolving Solutions	TE005-Collar-E1	Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app
Nitrile Gloves	Usa Scientific	3915-4400	Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills
Noise-Reducing Earmuff	3M	90565-4DC-PS	Protect ears while operating air compressor and tissue processing base
Polyurethane Recoil Air Hose	FYPower	‎510019	Attaches air gun to compressor
Saftey glasses	Solidwork	SW8329-US	Protect eyes for chemical and physical hazards
Spray bottle	JohnBee	B08QM81BJV	Spray bleach to deconatinate surfaces
Tissue Extractor Base	Technology Evolving Solutions	TE001-A-E1	System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench
Tissue Processing Base Weight Scale	Technology Evolving Solutions	TE003-A05-200g-01-E1	200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield
Vermiculite	EasyGoProducts	B07WQDZGRP	Needed to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service
Wire Cutter	Boenfu	‎BOWC-06002-US	Wire cutters to cut trimmer line