機器エンジニアリングによる下流の病原体検出のための柑橘類の芽処理の自動化

要約

師部が豊富な樹皮の柑橘類のつぼみ組織を迅速に処理する機器を設計、製造、検証しました。現在の方法と比較して、バッドウッド組織抽出器(BTE)はサンプルスループットを向上させ、必要な人件費と設備コストを削減しました。

要約

ウイルス、ウイロイド、バクテリアなどの柑橘類の移植片伝染性の師部制限病原体は、世界中で壊滅的な流行と深刻な経済的損失の原因となっています。たとえば、柑橘類のトリステザウイルスは世界中で1億本以上の柑橘類の木を殺しましたが、「Candidatus Liberibacter asiaticus」はフロリダに90億ドルの費用をかけました。病原体でテストされた柑橘類の芽を樹木の繁殖に使用することは、そのような病原体の管理にとって重要です。カリフォルニア大学リバーサイド校の柑橘類クローン保護プログラム(CCPP)は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)アッセイを使用して、カリフォルニアの柑橘類を保護し、全米クリーンプラントネットワークにクリーンな繁殖ユニットを提供するために、毎年柑橘類の芽木源の木から数千のサンプルをテストしています。柑橘類ウイルスおよびウイロイドのハイスループット分子検出における深刻なボトルネックは、植物組織処理ステップです。

適切な組織調製は、高品質の核酸の抽出とPCRアッセイにおけるダウンストリーム使用に不可欠です。核酸の分解を避けるために、低温での植物組織の粉砕、計量、凍結乾燥、粉砕、および遠心分離は、時間と労力を要し、高価で特殊な実験装置を必要とします。この論文では、柑橘類の芽から師部に富む樹皮組織を迅速に処理するように設計された、芽木組織抽出器(BTE)と呼ばれる特殊な機器の検証を紹介します。BTEは、現在の方法と比較してサンプルスループットを100%向上させます。さらに、それは人件費と設備のコストを削減します。この研究では、BTEサンプルのDNA収量(80.25 ng / μL)は、CCPPのハンドチョッピングプロトコル(77.84 ng / μL)に匹敵しました。この機器と迅速な植物組織処理プロトコルは、カリフォルニアのいくつかの柑橘類診断研究所とプログラムに利益をもたらし、世界中の他の木本多年生作物の組織処理のモデルシステムになります。

概要

ウイロイド、ウイルス、バクテリアなどの柑橘類の移植片伝染性師部制限病原体は、世界のすべての柑橘類生産地域で壊滅的な流行と深刻な経済的損失を引き起こしています。柑橘類のウイロイドは、三葉、三葉の雑種、みかん、クレメンタイン、みかんなどの経済的に重要な柑橘類の種類で引き起こす外皮質と悪液質の病気のために、生産要因を制限しています^1,2,3。カリフォルニアでは、これらのウイロイドに敏感な柑橘類の種類は、皮をむきやすく、セグメント化され、^{種のない果物}に対する消費者の好みの変化傾向に続いて、「イージーピーラー」の成長と収益性の高い市場の基盤となっています4,5,6。したがって、柑橘類のウイロイドは、カリフォルニア州食品農業省(CDFA)の「柑橘類の苗床害虫清浄度プログラム-上院法案140」の下で規制されており、CDFAの植物害虫診断部門の研究所は、毎年何千もの柑橘類のウイロイド検査を実施しています7,8,9,10

プロトコル

1.柑橘類のつぼみサンプルを収集して出荷する

1. テクノロジー進化ソリューションにツリー情報のスプレッドシートを送信して、Webサーバーにロードします(最終的には、ユーザーは新しいツリーを作成します)。
2. 電話アプリ TES トラッカー を使用してツリーを選択し、近距離無線通信 (NFC) カラー タグを電話機に保持してツリー情報をタグに読み込みます。
3. 3〜4個の柑橘類のつぼみサンプルをBTE互換のビニール袋キャリアに挿入し、蓋をして閉じます。
   1. つぼみの長さが8インチを超えず、5インチ以上であることを確認してください。
      1. 長さが8インチを超える場合は、滅菌済みの使い捨てかみそりの刃を使用するか、10%漂白剤溶液(1%次亜塩素酸ナトリウム)で除染した剪定ばさみを使用して短くします。
      2. 長さが5インチ未満の場合は、別のつぼみのサンプルを収集してバッグに入れます。
   2. 腋窩の成長や大きなとげは、手で、または10%の漂白消毒された切削工具(1%次亜塩素酸ナトリウム)を使用して除去するようにしてください。
      注意: このステップは、つぼみがチャンバーの開口部で操作しやすくするために重要です。
   3. 湾曲した特徴を持つつぼみのサンプルがないことを確認してください。その場合は、10%漂白消毒切削工具(1%次亜塩素酸....

結果

BTE処理した柑橘類組織を用いたRNA抽出・精製・品質および組織処理時間の評価
このテストでは、255本の代表的な柑橘類の木の芽木サンプルを使用して、BTEのRNA品質と標準的な手順を比較しました。サンプルは、バッドウッド組織抽出器(BTE)(プロトコルステップ4.1〜4.6および 図2、右側、ステップ1、ステップ5、およびステップ6)によって処理されるか、Dang.......

ディスカッション

HLB柑橘類病の出現により、損失を減らすために、柑橘類産業、規制当局、および診断研究所は、病気管理の実践と組み合わせて、個々の樹木の検査のために、低スループットの手動サンプル処理およびqPCR³⁴ などの病原体検出アッセイと組み合わせたハイスループット核酸抽出法に依存するように促されています³⁵.カリフォルニア州のHLB陽性率は、2012年の0........

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.08" Hex Trimmer line	PowerCare	FPRO07065	Needed to replace blades.
1 Hp, 8 gal air compressor	California Air Tools	8010	Quickly dry chambers after rinsed
1.5 mL microcentrifuge tube	Globe Scientific	111558B	Store sample in after swishing with syinges
10 mL Syringe Set	Technology Evolving Solutions	TE006-F1-10A-G1000-E1	Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING - contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required - do not mix with bleach
12" Ruler	Westcott	‎16012	To measure trimmer line before cutting
12% Sodium Hypochlorite	Hasa	1041	Disinfects chambers after processing
-20 C Freezer	Insignia	NS-CZ70WH0	Store sample after processing
4" x 12" plastic bags	Plymor	FP20-4x12-10	Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal
6" Cotton Swab	Puritan	806-PCL	Swab to remove clogs
7 Gallon Storage Tote	HDX	206152	Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers
Air blow gun	JASTIND	‎JTABG103A	Directs air into the chambers at high pressure
Black Sharpie	Sharpie	S-19421	Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later
Bottle Top Dispensor	Brand	Z627569	Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe
BTE Chamber	Technology Evolving Solutions	TE002BB-A05-E1	Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool
Dish Soap	Dawn	57445CT	Surfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber
Fume hood with hepa filter	Air Science	P5-36XT-A	Fume hood with hepa filter (ASTS-030)  to limit possible contamination and protect against chemical spills
Insulated foam shipping container	PolarTech	261/J50C	Insulated shipping container to ship samples on ice after they are collected
Lab coat	Red Kap	KP14WH LN 46	Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills
Laptop	Microsoft	Surface	Wifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base
NFC Capable Phone	Samsung	Galaxy S9	Phone to download and use TES phone app
NFC clip tag	Technology Evolving Solutions	TE005-Clip-E1	Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app
NFC Collar Tag	Technology Evolving Solutions	TE005-Collar-E1	Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app
Nitrile Gloves	Usa Scientific	3915-4400	Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills
Noise-Reducing Earmuff	3M	90565-4DC-PS	Protect ears while operating air compressor and tissue processing base
Polyurethane Recoil Air Hose	FYPower	‎510019	Attaches air gun to compressor
Saftey glasses	Solidwork	SW8329-US	Protect eyes for chemical and physical hazards
Spray bottle	JohnBee	B08QM81BJV	Spray bleach to deconatinate surfaces
Tissue Extractor Base	Technology Evolving Solutions	TE001-A-E1	System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench
Tissue Processing Base Weight Scale	Technology Evolving Solutions	TE003-A05-200g-01-E1	200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield
Vermiculite	EasyGoProducts	B07WQDZGRP	Needed to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service
Wire Cutter	Boenfu	‎BOWC-06002-US	Wire cutters to cut trimmer line