Автоматизация переработки цитрусовых почек для последующего обнаружения патогенов с помощью приборостроения

Резюме

Мы спроектировали, изготовили и валидировали инструмент, который быстро обрабатывает богатые флоэмой ткани коры цитрусовых. По сравнению с существующими методами, экстрактор тканей почки (BTE) увеличил пропускную способность образцов и снизил требуемые затраты на рабочую силу и оборудование.

Аннотация

Трансмиссивные трансплантаты, ограниченные флоэмой патогены цитрусовых, такие как вирусы, вироиды и бактерии, ответственны за разрушительные эпидемии и серьезные экономические потери во всем мире. Например, вирус цитрусовых tristeza убил более 100 миллионов цитрусовых деревьев во всем мире, в то время как «Candidatus Liberibacter asiaticus» обошелся Флориде в 9 миллиардов долларов. Использование проверенных патогенами цитрусовых почек для размножения деревьев является ключом к борьбе с такими патогенами. Программа клональной защиты цитрусовых (CCPP) в Калифорнийском университете в Риверсайде использует полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для тестирования тысяч образцов цитрусовых почковых деревьев каждый год, чтобы защитить цитрусовые цитрусовые в Калифорнии и предоставить чистые устройства для размножения Национальной сети чистых растений. Серьезным узким местом в высокопроизводительном молекулярном обнаружении вирусов цитрусовых и вироидов является этап обработки растительных тканей.

Надлежащая подготовка тканей имеет решающее значение для извлечения качественных нуклеиновых кислот и последующего использования в ПЦР-анализах. Измельчение, взвешивание, сублимационная сушка, измельчение и центрифугирование растительных тканей при низких температурах во избежание разложения нуклеиновых кислот является трудоемким процессом и требует дорогостоящего и специализированного лабораторного оборудования. В данной статье представлена валидация специализированного прибора, разработанного для быстрой обработки богатых флоэмой тканей коры цитрусовых почек, названного экстрактором тканей почек (BTE). Заушная заушка увеличивает пропускную способность на 100% по сравнению с существующими методами. Кроме того, это снижает трудозатраты и стоимость оборудования. В этой работе заушные образцы имели выход ДНК (80,25 нг/мкл), который был сопоставим с протоколом ручного измельчения CCPP (77,84 нг/мкл). Этот инструмент и протокол быстрой обработки тканей растений могут принести пользу нескольким лабораториям и программам диагностики цитрусовых в Калифорнии и стать моделью системы обработки тканей для других древесных многолетних культур во всем мире.

Введение

Трансплантатные патогены цитрусовых, ограниченные флоэмой, такие как вироиды, вирусы и бактерии, вызвали разрушительные эпидемии и серьезные экономические потери во всех регионах мира, производящих цитрусовые. Цитрусовые вироиды являются ограничивающими факторами производства из-за болезней экзокортиса и кахексии, которые они вызывают у экономически важных видов цитрусовых, таких как тройчатые, трехлистные гибриды, мандарины, клементины и мандарины ^1,2,3. В Калифорнии эти чувствительные к вироидам виды цитрусовых являются основой растущего и прибыльного рынка «легких очистите....

протокол

1. Сбор образцов цитрусовых почек для отправки

1. Отправьте Technology Evolving Solutions электронную таблицу с информацией о деревьях, чтобы они загрузили ее на свой веб-сервер (в конечном итоге пользователь создаст новые деревья).
2. Используйте трекер TES в приложении для телефона, чтобы выбрать дерево, и приложите к телефону бирку NFC, чтобы загрузить информацию о дереве на метку.
3. Вставьте три-четыре образца цитрусовых почек в держатель для заушных пластиковых пакетов и закройте крышкой.
   1. Убедитесь, что длина почки не превышает 8 дюймов и не менее 5 дюймов.
      1. Если длина превышает 8 дюймов, исполь....

Результаты

Экстракция, очистка и качество РНК с использованием тканей цитрусовых, обработанных заушными бутонами, и оценка времени обработки тканей
Для этого теста мы использовали образцы почковой древесины из 255 репрезентативных цитрусовых деревьев, чтобы сравнить качество РНК из за.......

Обсуждение

С появлением ГЛБ цитрусовых для сокращения потерь цитрусовая промышленность, регулирующие органы и диагностические лаборатории были призваны полагаться на высокопроизводительные методы экстракции нуклеиновых кислот в сочетании с малопроизводительной ручной обработкой образцов и .......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.08" Hex Trimmer line	PowerCare	FPRO07065	Needed to replace blades.
1 Hp, 8 gal air compressor	California Air Tools	8010	Quickly dry chambers after rinsed
1.5 mL microcentrifuge tube	Globe Scientific	111558B	Store sample in after swishing with syinges
10 mL Syringe Set	Technology Evolving Solutions	TE006-F1-10A-G1000-E1	Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING - contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required - do not mix with bleach
12" Ruler	Westcott	‎16012	To measure trimmer line before cutting
12% Sodium Hypochlorite	Hasa	1041	Disinfects chambers after processing
-20 C Freezer	Insignia	NS-CZ70WH0	Store sample after processing
4" x 12" plastic bags	Plymor	FP20-4x12-10	Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal
6" Cotton Swab	Puritan	806-PCL	Swab to remove clogs
7 Gallon Storage Tote	HDX	206152	Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers
Air blow gun	JASTIND	‎JTABG103A	Directs air into the chambers at high pressure
Black Sharpie	Sharpie	S-19421	Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later
Bottle Top Dispensor	Brand	Z627569	Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe
BTE Chamber	Technology Evolving Solutions	TE002BB-A05-E1	Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool
Dish Soap	Dawn	57445CT	Surfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber
Fume hood with hepa filter	Air Science	P5-36XT-A	Fume hood with hepa filter (ASTS-030)  to limit possible contamination and protect against chemical spills
Insulated foam shipping container	PolarTech	261/J50C	Insulated shipping container to ship samples on ice after they are collected
Lab coat	Red Kap	KP14WH LN 46	Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills
Laptop	Microsoft	Surface	Wifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base
NFC Capable Phone	Samsung	Galaxy S9	Phone to download and use TES phone app
NFC clip tag	Technology Evolving Solutions	TE005-Clip-E1	Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app
NFC Collar Tag	Technology Evolving Solutions	TE005-Collar-E1	Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app
Nitrile Gloves	Usa Scientific	3915-4400	Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills
Noise-Reducing Earmuff	3M	90565-4DC-PS	Protect ears while operating air compressor and tissue processing base
Polyurethane Recoil Air Hose	FYPower	‎510019	Attaches air gun to compressor
Saftey glasses	Solidwork	SW8329-US	Protect eyes for chemical and physical hazards
Spray bottle	JohnBee	B08QM81BJV	Spray bleach to deconatinate surfaces
Tissue Extractor Base	Technology Evolving Solutions	TE001-A-E1	System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench
Tissue Processing Base Weight Scale	Technology Evolving Solutions	TE003-A05-200g-01-E1	200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield
Vermiculite	EasyGoProducts	B07WQDZGRP	Needed to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service
Wire Cutter	Boenfu	‎BOWC-06002-US	Wire cutters to cut trimmer line