Автоматизация переработки цитрусовых почек для последующего обнаружения патогенов с помощью приборостроения

Резюме

Мы спроектировали, изготовили и валидировали инструмент, который быстро обрабатывает богатые флоэмой ткани коры цитрусовых. По сравнению с существующими методами, экстрактор тканей почки (BTE) увеличил пропускную способность образцов и снизил требуемые затраты на рабочую силу и оборудование.

Аннотация

Трансмиссивные трансплантаты, ограниченные флоэмой патогены цитрусовых, такие как вирусы, вироиды и бактерии, ответственны за разрушительные эпидемии и серьезные экономические потери во всем мире. Например, вирус цитрусовых tristeza убил более 100 миллионов цитрусовых деревьев во всем мире, в то время как «Candidatus Liberibacter asiaticus» обошелся Флориде в 9 миллиардов долларов. Использование проверенных патогенами цитрусовых почек для размножения деревьев является ключом к борьбе с такими патогенами. Программа клональной защиты цитрусовых (CCPP) в Калифорнийском университете в Риверсайде использует полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для тестирования тысяч образцов цитрусовых почковых деревьев каждый год, чтобы защитить цитрусовые цитрусовые в Калифорнии и предоставить чистые устройства для размножения Национальной сети чистых растений. Серьезным узким местом в высокопроизводительном молекулярном обнаружении вирусов цитрусовых и вироидов является этап обработки растительных тканей.

Надлежащая подготовка тканей имеет решающее значение для извлечения качественных нуклеиновых кислот и последующего использования в ПЦР-анализах. Измельчение, взвешивание, сублимационная сушка, измельчение и центрифугирование растительных тканей при низких температурах во избежание разложения нуклеиновых кислот является трудоемким процессом и требует дорогостоящего и специализированного лабораторного оборудования. В данной статье представлена валидация специализированного прибора, разработанного для быстрой обработки богатых флоэмой тканей коры цитрусовых почек, названного экстрактором тканей почек (BTE). Заушная заушка увеличивает пропускную способность на 100% по сравнению с существующими методами. Кроме того, это снижает трудозатраты и стоимость оборудования. В этой работе заушные образцы имели выход ДНК (80,25 нг/мкл), который был сопоставим с протоколом ручного измельчения CCPP (77,84 нг/мкл). Этот инструмент и протокол быстрой обработки тканей растений могут принести пользу нескольким лабораториям и программам диагностики цитрусовых в Калифорнии и стать моделью системы обработки тканей для других древесных многолетних культур во всем мире.

Введение

Трансплантатные патогены цитрусовых, ограниченные флоэмой, такие как вироиды, вирусы и бактерии, вызвали разрушительные эпидемии и серьезные экономические потери во всех регионах мира, производящих цитрусовые. Цитрусовые вироиды являются ограничивающими факторами производства из-за болезней экзокортиса и кахексии, которые они вызывают у экономически важных видов цитрусовых, таких как тройчатые, трехлистные гибриды, мандарины, клементины и мандарины ^1,2,3. В Калифорнии эти чувствительные к вироидам виды цитрусовых являются основой растущего и прибыльного рынка «легких очистителей», следуя меняющейся тенденции в предпочтениях потребителей к фруктам, которые легко очищаются от кожуры, сегментированы и не содержат косточек ^4,5,6. Таким образом, вироиды цитрусовых регулируются в соответствии с Программой чистоты вредителей Сената 140 Департамента продовольствия и сельского хозяйства Калифорнии (CDFA), а лаборатории Отдела диагностики вредителей растений CDFA ежегодно проводят тысячи тестов на вироиды цитрусовых 7,8,9,10 . Вирус цитрусовых тристеза (CTV) стал причиной гибели более 100 миллионов цитрусовых деревьев с начала глобальной эпидемии в 1930-х годах: 3,9,10,11. В Калифорнии изоляты вируса, вызывающие точечную коррозию стеблей и разрыв тройчатых слоев, представляют серьезную угрозу для калифорнийской цитрусовой промышленности стоимостью 3,6 миллиарда долларов 12,13,14. Следовательно, CDFA классифицирует CTV как регулируемый вредитель растений класса А, а лаборатория Агентства по искоренению тристезы в Центральной Калифорнии (CCTEA) ежегодно проводит обширные полевые исследования и тысячи тестов на ^{вирусы.} Бактерия "Candidatus Liberibacter asiaticus" (CLas) и болезнь хуанлунбин (HLB), по оценкам, нанесли экономический ущерб Флориде на сумму около 9 миллиардов долларов в результате сокращения посевных площадей цитрусовых на 40%, сокращения производства цитрусовых на 57% и потери почти 8000^{рабочих мест.} В Калифорнии гипотетическое сокращение посевных площадей цитрусовых на 20% из-за ГЛБ, по прогнозам, приведет к потере более 8200 рабочих мест и сокращению валового внутреннего продукта штата более чем на полмиллиарда долларов. Таким образом, Программа профилактики вредителей и болезней цитрусовых ежегодно тратит более 40 миллионов долларов на исследования по тестированию, выявлению и искоренению CLas в Калифорнии^14,17,19,20.

Ключевым элементом борьбы с вироидами, вирусами и бактериями цитрусовых является использование для выращивания деревьев проверенных патогенами материалов для размножения (например, бутонов). Цитрусовые почки, проверенные на патогены, выращиваются и поддерживаются в рамках комплексных карантинных программ, в которых используются передовые методы уничтожения и обнаружения патогенов^10,21. Программа защиты клональных пород цитрусовых (CCPP) в Калифорнийском университете в Риверсайде ежегодно тестирует тысячи образцов почек из сортов цитрусовых, недавно импортированных в штат и США, а также исходных деревьев цитрусовых, чтобы защитить цитрусовые цитрусовые и поддержать функции Национальной сети чистых растений для цитрусовых^10,17,22. Для обработки больших объемов тестирования цитрусовых высокопроизводительные, надежные и экономичные анализы для обнаружения патогенов являются фундаментальным компонентом успеха таких программ, как CCPP ^7,10,22.

В то время как молекулярные методы обнаружения патогенов, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволили значительно увеличить пропускную способность лабораторий по диагностике растений, по нашему опыту, одним из наиболее критических узких мест при внедрении высокопроизводительных протоколов является этап обработки образцов растительных тканей. Это особенно актуально для цитрусовых, поскольку доступные в настоящее время протоколы обработки богатых флоэмой тканей, таких как черешки листьев и кора почек, являются трудоемкими, длительными и требуют дорогостоящего и специализированного лабораторного оборудования. Эти протоколы требуют ручного измельчения, взвешивания, сублимационной сушки, измельчения и центрифугирования при низких температурах, чтобы избежать разложения нуклеиновых кислот 8,23,24. Например, в диагностической лаборатории CCPP обработка проб включает в себя (i) ручное измельчение (6-9 проб/ч на оператора), (ii) сублимационную сушку (16-24 ч), (iii) измельчение (30-60 с) и (iv) центрифугирование (1-2 ч). Этот процесс также требует специализированных расходных материалов (например, сверхпрочных трубок с предохранительным замком, мелющих шаров из нержавеющей стали, адаптеров, лезвий, перчаток) и нескольких единиц дорогостоящего лабораторного оборудования (например, морозильной камеры со сверхнизкой температурой, сублимационной сушилки, измельчителя тканей, криостанции жидкого азота, охлаждаемой центрифуги).

Как и в любой отрасли, проектирование оборудования и автоматизация процессов являются ключом к снижению затрат, увеличению производительности и обеспечению высококачественных, однородных продуктов и услуг. Цитрусовая промышленность нуждается в недорогих инструментах для обработки тканей, которые требуют минимальных навыков для работы и, как таковые, легко переносятся в диагностические лаборатории и полевые операции, чтобы обеспечить высокую производительность обработки образцов для быстрого обнаружения патогенов. Technology Evolving Solutions (TES) и CCPP разработали (т.е. спроектировали и изготовили) и валидировали (т.е. протестировали на образцах цитрусовых и сравнили со стандартными лабораторными процедурами) недорогой (т.е. устранил необходимость в специализированном лабораторном оборудовании) прибор для быстрой обработки богатых флоэмой тканей цитрусовых (т.е. бутонов), названный экстрактором тканей бутонов (BTE). Как видно на рисунке 1, BTE включает в себя базовый компонент для питания и управления, а также съемную камеру для обработки цитрусовых бутонов. Заушная камера состоит из шлифовального круга, специально разработанного для удаления богатых флоэмой тканей коры с цитрусовых почек. Измельченная ткань коры быстро выталкивается через скользящее отверстие в шприц, содержащий буфер для экстракции, фильтруется и готовится к экстракции и очистке нуклеиновых кислот без какой-либо дополнительной обработки или подготовки (рисунок 1). Система BTE также включает в себя безбумажное приложение для отслеживания образцов и интегрированное приложение для взвешивания, которые записывают информацию об обработке образца в онлайн-базу данных в режиме реального времени.

Система BTE увеличила возможности лабораторной диагностики CCPP более чем на 100% и обеспечивает стабильное производство экстрактов тканей цитрусовых, подходящих для очистки высококачественных нуклеиновых кислот и последующего обнаружения трансплантатных патогенов цитрусовых с помощью ПЦР-анализов. В частности, BTE сократила время обработки тканей с более чем 24 часов до ~3 минут на образец, заменила лабораторные инструменты стоимостью более 60 000 долларов США (рис. 2, шаги 2-4) и позволила обрабатывать образцы большего размера.

В этом документе представлены данные о высокопроизводительной обработке тканей коры цитрусовых, экстракции нуклеиновых кислот и валидации обнаружения патогенов с образцами цитрусовых почек с исходных деревьев, включая все соответствующие положительные и отрицательные контрольные данные карантинного центра CCPP Rubidoux и Фонда Lindcove, соответственно. Мы также представляем изменения производительности и времени обработки по сравнению с текущей лабораторной процедурой (рис. 2). Кроме того, в этой работе представлен подробный, пошаговый протокол для лабораторий по тестированию на патогены цитрусовых и показано, как BTE может поддерживать функции чистого от патогенов питомника, программ обследования и уничтожения.

Рисунок 1: Экстрактор тканей Budwood. Заушная труба включает в себя базовый компонент для питания и управления, а также съемную камеру для обработки цитрусовых бутонов. Заушная камера состоит из шлифовального круга, специально разработанного для удаления богатых флоэмой тканей коры цитрусовых почек. Измельченная ткань коры быстро выталкивается через скользящее отверстие в шприц, фильтруется и готовится к экстракции и очистке нуклеиновых кислот без каких-либо дополнительных манипуляций или подготовки. Аббревиатура: BTE = экстрактор тканей из бутонов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Пошаговое сравнение между традиционной лабораторной процедурой ручного измельчения и заушной обработкой. Заушная обработка включает в себя высокопроизводительную обработку тканей коры цитрусовых, экстракцию нуклеиновых кислот и обнаружение патогенов. В скобках указано время каждого шага. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

протокол

1. Сбор образцов цитрусовых почек для отправки

1. Отправьте Technology Evolving Solutions электронную таблицу с информацией о деревьях, чтобы они загрузили ее на свой веб-сервер (в конечном итоге пользователь создаст новые деревья).
2. Используйте трекер TES в приложении для телефона, чтобы выбрать дерево, и приложите к телефону бирку NFC, чтобы загрузить информацию о дереве на метку.
3. Вставьте три-четыре образца цитрусовых почек в держатель для заушных пластиковых пакетов и закройте крышкой.
   1. Убедитесь, что длина почки не превышает 8 дюймов и не менее 5 дюймов.
      1. Если длина превышает 8 дюймов, используйте стерильное одноразовое бритвенное лезвие или секаторы, обеззараженные 10% раствором отбеливателя (1% гипохлорит натрия), чтобы сделать его короче.
      2. Если длина менее 5 дюймов, соберите другой образец почки, чтобы положить его в пакет.
   2. Убедитесь, что любые подмышечные наросты или крупные шипы удалены вручную или с помощью 10% продезинфицированных отбеливателем режущих инструментов (1% гипохлорита натрия).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг важен для того, чтобы бутону было легче маневрировать в проеме камеры.
   3. Убедитесь в отсутствии образцов почек с изогнутыми элементами. Если это так, удалите их с помощью 10% продезинфицированных отбеливателем режущих инструментов (1% гипохлорита натрия) и поместите в заушные пакеты только прямые части образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изогнутую почковую древесину очень трудно протащить в инструмент, что приводит к неравномерным полосам коры.
4. Используйте приложение для телефона TES tracker , чтобы отсканировать NFC-бирку на ошейнике дерева и связать ее с NFC-биркой на пакете с образцом.
5. Обратите внимание на толщину бутонов, так как от этого зависит, как оператор будет снимать богатую флоэмой кору почек внутри заушной камеры.
   1. Если почковая древесина имеет толщину менее 0,20 дюйма, будьте осторожны при зачистке почки, потому что высокоскоростные прядильные нити в камере измельчат всю почку до сердцевины, за пределами слоя коры и в небогатые флоэмой ткани древесины и сердцевины.
   2. Выбирайте более толстую почку, потому что с нее легче снять ткани коры, избегая тканей почки, не богатой флоэмой.
6. Поместите образцы в изолированный транспортировочный контейнер с несколькими пакетами со льдом.

2. Установка в вытяжной шкаф

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется эксплуатировать заушную заушку в вытяжном шкафу. Это снизит риск перекрестного загрязнения тканей растений и лабораторного загрязнения.

1. Дезинфицируйте с помощью 10% (1% гипохлорита натрия) пульверизатора.
   1. Распылите на поверхность вытяжки и оставьте отбеливатель примерно на 1 минуту, прежде чем протереть бумажным полотенцем.
   2. Сбрызните бумажное полотенце раствором отбеливателя. Протрите основание TE, компоненты весов (весы, воздушный щиток и башню) и маркер.
2. Разверните набор шприцев, рассчитанный на количество образцов, подлежащих обработке, и поместите их в закрытую картонную коробку.
3. Подготовьте упаковку тампонов снаружи капюшона на случай, если они понадобятся.
4. Подготовьте весы.
   1. Снимите весовую башню с весов и удерживайте кнопку питания, чтобы включить ее. Поместите башню в центр шкалы после того, как шкала отобразит 0.
   2. Наденьте воздушную защитную кожух весов на переднюю часть весов.
5. Подготовьте основание экстрактора тканей, щелкнув переключателем на задней панели. Убедитесь, что переключатель с левой стороны коробки нажат сверху. Дождитесь мигания зеленого светодиода, который указывает на то, что камера готова.

3. Настройте станции очистки (дополнительный рисунок S1).

1. Налейте 1 л воды в ультразвуковой очиститель.
2. Оберните два мешка для мусора сверху ультразвуковой ванной.
3. Налейте в ультразвуковой очиститель ~5 л 10% хлорной извести (1% раствор гипохлорита натрия).
4. Наполните ванну с водой достаточным количеством воды, чтобы погрузить камеру.
5. Включите воздушный компрессор и откройте вентиль.
6. Установите фон, чтобы улавливать жидкость во время сушки камеры.

4. Обработка материала для заушки для зачистки коры цитрусовых почек

1. Загрузите камеру на заушное основание.
   1. Подготовьте заушную камеру.
      1. Прикрепите пустой пакет для образцов к задней части камеры. Используйте два уплотнительных кольца, чтобы прикрепить пустой пакет к заднему соплу заушной камеры.
      2. Осмотрите лезвие на наличие признаков износа или повреждений, таких как порезы, образующиеся на лезвии, где оно переходит в пластик, или порезы, образующиеся на кончике. Убедитесь, что стрелка на лезвии совпадает с символом одиночного замка.
      3. Убедитесь, что выпускное отверстие для выпуска воздуха в нижней части камеры направлено в сторону символа O . Наденьте прозрачную крышку на отверстие камеры и наденьте прозрачную заушную заушку на камеру с помощью направляющей справа от камеры. Сдвиньте замок в нижней части патронника до упора, насколько он может войти в затвор. Убедитесь, что крышка плунжера установлена в верхней части затвора.
   2. Поместите камеру на основание заушного отверстия так, чтобы сопло заушного основания выступало в заднюю часть камеры. Подождите, пока синий светодиод не начнет мигать, указывая на то, что размещение прошло успешно.
2. Загрузите образец на заушную основу, переместив белую наклейку на метке зажима NFC в букву Z на правой стороне коробки. Перемещайте метку медленными круговыми движениями по Z, пока не начнет мигать желтый индикатор. Прикрепите образец к основанию заушной пробы и убедитесь, что в пакете для образцов нет отверстий; Если есть дыра, заклейте ее скотчем. Поместите уплотнительное кольцо на пакет для образцов, чтобы закрепить его на передней части заушного сопла.
3. Загрузите неиспользованный набор шприцев.
   1. Тарируйте набор шприцев. Поместите неиспользованный набор шприцев на башню весов. Извлеките набор шприцев, когда начнет мигать красный индикатор или шкала покажет 0.
   2. Снимите поршень со шприца с фильтром. Убедитесь, что жидкость находится в нижнем (без фильтра) шприце. Отложите поршень в сторону на бумажном полотенце или на башню, где черный поршень не касается поверхностей.
   3. Прикрепите шприц к выходному отверстию, вдавливая выходное отверстие в шприц и поворачивая его на 90°.
4. Обработайте образец почковой древесины.
   ВНИМАНИЕ: Заушная ушка имеет высокоскоростные движущиеся части. Все операции должны происходить внутри вытяжного шкафа. Все пользователи должны использовать защитные очки, наушники (беруши) и все другие средства индивидуальной защиты (СИЗ), такие как перчатки и лабораторные халаты.
   1. Нажмите верхнюю черную кнопку, чтобы запустить машину. Нажмите второй раз, чтобы остановить двигатель в любой момент во время обработки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коробка имеет датчик скорости и температуры, чтобы обеспечить ее правильную работу.
   2. Возьмите одну палочку почки через пакет и проденьте ее через верхнюю часть заушной насадки.
   3. Возьмитесь другой рукой за палку с другой стороны камеры и медленно погрузитесь в лезвие. Прислушайтесь к тихому жужжащему звуку, указывающему на то, что с почки сдирают кору. Медленно перемещайте почки вперед и назад, вращая их.
      1. Если слышен громкий, агрессивный рубящий звук, быстро переместите ветку наверх и/или нажмите верхнюю кнопку, чтобы остановить двигатель. Чтобы остановить двигатель, используйте правый переключатель для завершения обработки (см. шаг 4.4.3.2).
      2. Если при резке материал не выходит из выхода, значит, камера засорена. Выключите двигатель, снимите крышку ползуна плунжера и используйте пластик тампона, чтобы вытолкнуть засор из выхода машины. Используйте правый переключатель, чтобы закончить обработку: Вверх = Прямая резка; Средний = двигатель выключен; Вниз = обратная резка.
   4. Повторите шаги 4.4.2 и 4.4.3 для остальных ветвей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общим признаком того, что кора почек была очищена, является то, что 25% шприца заполнено растительной тканью. Привитые возбудители цитрусовых могут быть распределены по дереву неравномерно. Поэтому три-четыре образца почек собирают вокруг кроны цитрусового дерева. Важно, чтобы каждый образец почки, находящийся в сумке для переноски заушной почки, вносил свой вклад в окончательный образец измельченной ткани, чтобы гарантировать, что полный репрезентативный образец дерева будет проверен на наличие патогенов.
   5. Нажмите верхнюю черную кнопку, чтобы остановить обработку. Подождите, пока индикатор снова не начнет мигать желтым.
5. Проверьте вес образца.
   1. Поверните шприц на 90° и потяните его вниз, чтобы отсоединить. Установите поршень обратно на шприц и поместите шприц на башню.
   2. Подождите, пока весы автоматически определят образец, и определите, находится ли он в правильном диапазоне веса (0,25 ± 0,05 г). Если масса образца слишком мала (<0,20 г), повторите шаг 4.4; красный светодиод начнет мигать. Если вес образца слишком велик (>0,30 г), удалите часть материала образца; желтый светодиод начнет мигать медленнее. Если образец находится в пределах диапазона, зеленый светодиод начнет мигать.
6. Гомогенизация образца почки
   1. Снимите поршень со шприца с образцом, протолкните жидкость в шприц с образцом и снова добавьте поршень. Поршень проталкивает буфер и сок растений через сетчатый фильтр (удерживая крупные кусочки ткани коры) и через резиновую трубку в пустой шприц.
   2. Перемешайте образец, перемещая буфер и растительный сок взад и вперед из одного шприца в другой. Повторяйте ~3x-4x до тех пор, пока образец не превратится в однородную зеленую жидкую смесь.
   3. После хорошей гомогенизации протолкните образец растительного сока в шприц без сетчатого фильтра и отсоедините резиновую трубку и шприц с фильтром от шприца с образцом.
   4. Извлеките образец сока растения из шприца в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл и храните при температуре −20 °C до дальнейшего использования. Используйте перманентный маркер, чтобы пометить образец номером пакета.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образец растительного сока из этапа 4.6.5 теперь может быть обработан любой из доступных нуклеиновых кислот, РНК или ДНК, методами экстракции на основе фенол-хлороформа, кремнеземной колонки или магнитных шариков 9,25,26,27 для экстракции и очистки нуклеиновых кислот (см. шаг 7) и последующего обнаружения трансплантативных патогенов цитрусовых (см. шаг 8).

5. Дезинфекция съемной камеры заушки

ВНИМАНИЕ: Если буфер из набора шприцев попал в камеру или предметное стекло, промойте и соблюдайте все правила безопасности лаборатории перед очисткой. Набор шприцев содержит гуанидина тиоцианат. Если буфер из набора шприцев вступает в контакт с отбеливателем, образуется газообразный цианид.

1. После обработки 10-го образца в камере выполните следующие действия. Обратите внимание, что зеленый светодиод будет продолжать мигать, а не переходить к миганию синим.
2. Разберите забвенную камеру, чтобы очистить ее от всех возможных загрязнений; Снимите прозрачную пластиковую крышку, очистите затвор камеры и очистите отверстие засора на затворе камеры.
3. Поверните клапан выпуска воздуха в нижней части камеры в открытое положение (метка открытого навесного замка). Поместите компоненты камеры в установленный ультразвуковой очиститель (см. шаг 3.1). Поместите крышку под камеру, чтобы она не всплыла. Запустите ультразвуковой очиститель в течение 15 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ванна для ультразвуковой очистки (5 л) может вмещать до двух камер.
4. Промывайте компоненты камеры на водяной бане (шаг 3.4) не менее 30 с. Переместите компоненты камеры на сушильную станцию.
   ВНИМАНИЕ: Сушка приведет к быстрому движению деталей в камере, громким шумам (~85 децибел [дБ]) и возможному разбрызгиванию. Все пользователи должны использовать защитные очки, наушники (беруши), лабораторные халаты и все другие СИЗ в соответствии с правилами безопасности действующей лаборатории.
5. Высушите заушную камеру.
   1. Расположите пневматический пистолет на одной линии с канавкой верхнего отверстия патронника (где обычно находится затвор). Нажмите на спусковой крючок пистолета, чтобы выпустить воздух в течение ~30 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что отверстие находится вдали от пользователя по направлению к заднему плану. Это должно вращать набор лезвий, чтобы удалить жидкость, попавшую под него.
   2. Расположите пневматический пистолет по направлению к верхним соплам патронника. Нажмите на спусковой крючок пневматического пистолета и медленно проведите три полных круга каждого входа в сопло.
   3. Расположите пневматический пистолет в центре заушного пистолета. Начиная с самой внутренней точки, удерживайте спусковой крючок нажатым и двигайтесь до тех пор, пока пневматический пистолет не укажет туда, где должен быть затвор.
   4. Быстро пропустите воздух по всей камере, спереди и сзади, чтобы удалить поверхностную воду с внешней стороны.
6. Высушите заушное предметное стекло.
   1. Поместите пневматический пистолет в прорезь плунжера затвора и нажмите спусковой крючок, чтобы выпустить воду из выхода затвора.
   2. Проведите пневматическим пистолетом по внутренней поверхности затвора, чтобы высушить его.
   3. Проведите пневматическим пистолетом по канавке затвора, чтобы вытолкнуть воду.
   4. Быстро пропустите воздух по всей поверхности, чтобы удалить с нее поверхностную воду.
7. Высушите компоненты.
   1. Удерживая в руке крышку поршня и уплотнительные кольца, нажмите на спусковой крючок.
   2. Проведите пневматическим пистолетом по внутренней поверхности крышки.
   3. Поместите компоненты в камеру и сдвиньте, чтобы продолжить сушку или собрать их.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для среды с высокой интенсивностью обработки тканей с несколькими функциональными заушными заушками может быть предусмотрена система периодической дезинфекции, способная обеззараживать 10 камер одновременно.

6. Утилизация и дезинфекция

1. Утилизируйте шприцы и резиновые трубки в специальный контейнер для отходов гуанидина.
2. Утилизируйте любой растительный материал в контейнере для биологически опасных отходов.
3. Снимите заушную камеру с основания заушной заушки.
4. Разберите заушную камеру и приступайте к их обеззараживанию, как описано в шаге 5.

7. Оценка обработки тканей и качества РНК, выделенных из заушных экстрактов цитрусовых почек

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе мы использовали образцы почек с 255 цитрусовых деревьев, чтобы сравнить время, необходимое для обработки тканей цитрусовых бутонов, и качество РНК, очищенной из экстрактов тканей коры, приготовленных BTE (рис. 2, справа, шаг 1, шаг 5 и шаг 6), с РНК, приготовленной с использованием одобренного регулирующими органами метода обработки тканей цитрусовых почек с использованием ручной очистки и измельчения. сублимационная сушка, измельчение и центрифугирование тканей коры, как описано Dang et ^al.23 (Рисунок 2, слева, шаги 1-6).

1. Текущая лабораторная процедура: Подготовка образцов почки для обработки тканей в соответствии с утвержденным нормативными требованиями методом²³.
   1. Выполняйте ручное очищение и измельчение ткани коры, сублимационную сушку, измельчение, центрифугирование и перенос растительного сока в пробирку для экстракции РНК, как описано Dang et ^al.23 (рис. 2, слева, шаги 1-6).
   2. После ручной очистки трех-четырех образцов почек от каждого испытуемого дерева поместите все почки в совместимый с заушными пластиковыми пакетами контейнер и храните при температуре 4 °C до обработки заушных почек (шаг 7.2).
2. Заушная процедура: Начните заушную обработку тканей цитрусовых почек (раздел 4, шаги 4.1-4.6; Рисунок 2, справа, шаг 1, шаг 5 и шаг 6).
   1. Используйте образцы почек, хранящиеся в заушных пакетах, начиная с шага 7.1.2.
3. Экстрагируют и очищают РНК из сока растений, полученного с помощью текущей лабораторной процедуры (этап 7.1.1) и заушной процедуры (этап 7.2.2), используя одобренный регулирующими органами полуавтоматический метод^на основе магнитных шариков 8,23,28.
4. Оценивают качество РНК, измеряя ее концентрацию, чистоту и целостность 8,23,24,29,3 ^3,31.
   1. Для расчета концентрации используют спектрофотометрию и оптическую плотность (OD) на длине волны 260 нм.
   2. Для оценки чистоты используйте спектрофотометрическое соотношение наружного диаметра 260/280.
   3. Для проверки целостности используют реакцию количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР) с обратной транскрипцией (ОТ), нацеленную на мРНК гена цитрусовых НАДН-дегидрогеназы^{цитрусовых 24,32}.

8. Оценка перекрестной контаминации и детекция цитрусовых вирусов и вироидов с использованием РНК, очищенной из заушных экстрактов цитрусовых почек

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе мы использовали образцы почек из 72 неинфицированных цитрусовых деревьев и одной смеси деревьев, зараженных вирусами и вироидами, для оценки возможности перекрестного загрязнения между образцами при обработке BTE (рис. 2, справа, шаг 1, шаг 5 и шаг 6) и пригодности РНК, очищенной из экстрактов тканей коры, приготовленных BTE, для использования в качестве матрицы для обнаружения вирусов цитрусовых и вироидов методом ОТ-кПЦР.

1. Первая обработка заушных образцов: Проведите базовый эксперимент с 72 неинфицированными образцами.
   1. Подготовьте три камеры БТЭ (A-C) (шаг 4.1.1).
   2. Подготовьте все неинфицированные образцы цитрусовых почек (1-72) в заушные пакеты для переноски и такое же количество (72) в двухшприцевой системе забора проб для каждого образца (шаг 2.4).
   3. Разделите пакеты для переноски проб и шприцы для сбора проб на шесть партий (I-VI) по 12 образцов в каждой.
   4. Начните заушную обработку тканей цитрусовых почек (шаг 4) в соответствии с приведенной ниже последовательностью (шаги 8.1.4.1-8.1.4.6) (см. Таблицу 1, Обработка первого заушного образца).
      1. Для партий I/образцов 1-12 обработайте 12 образцов с помощью камеры A. Продезинфицируйте камеру A после образца 12 (шаг 5).
      2. Для партии II/образцов 13-24 обработайте 12 образцов с помощью камеры B. Продезинфицируйте камеру B после образца 24 (шаг 5).
      3. Для партии III/Образцы 25-36 обработайте 12 образцов в камере C. Продезинфицируйте камеру C после образца 36 (шаг 5).
      4. Для партии IV/образцов 37-48 обработайте 12 образцов в продезинфицированной камере A (шаг 8.1.4.1).
      5. Для партии V/образцов 49--60 обработайте 12 образцов в продезинфицированной камере B (шаг 8.1.4.2).
      6. Для партии VI/образцов 60-72 обработайте 12 образцов в продезинфицированной камере C (шаг 8.1.4.3).
   5. Храните заушные пакеты со всеми образцами при температуре 4 °C до использования на шаге 8.2.
   6. Экстрагируйте и очищайте РНК из 72 образцов сока растений, полученных на этапах 8.1.4.1-8.1.4.6, используя одобренный регулирующими органами полуавтоматический метод^на основе магнитных шариков ^8,23,28.
   7. Выполняют ОТ-кПЦР для выявления цитрусовых вирусов и вироидов, как описано ранее ^8,33.
2. Для обработки второй заушной пробы проведите эксперимент по перекрестному загрязнению 70 неинфицированных образцов и двух смешанных инфицированных образцов.
   1. Подготовьте три камеры БТЭ (A-C) (шаг 4.1.1).
   2. Подготовьте смешанный образец цитрусовых почек (73) в двух заушных пакетах для переноски (шаг 1.3) для получения в общей сложности двух инфицированных образцов.
   3. Соберите заушные пакеты с неинфицированными образцами цитрусовых почек из шага 8.1.5, за исключением образца 3-Партия I и Образец 51-Партия V (см. замену образца на шаге 8.2.4), чтобы общее количество неинфицированных образцов составило 70.
   4. Включите первый заушный пакет с зараженным смесью образцом 73 вместо образца 3 в Партию I и второй вместо Образца 51 в Партию V, чтобы общее количество образцов составило 72.
   5. Подготовьте равное количество (72) в двухшприцевой системе забора проб для каждого образца (шаг 2.4).
   6. Разделите 72 пакета для переноски образцов и шприцы для отбора проб на шесть партий (I-VI) по 12 образцов в каждой.
   7. Начните заушную обработку тканей цитрусовых почек (шаг 4), следуя той же последовательности, что и в шагах 8.1.4.1-8.1.4.6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Единственное отличие заключается в замене образца 3 в партии I и образца 51 в партии V на инфицированный образец 73 (шаг 8.2.4) (Таблица 1, Обработка второй заушной пробы).
   8. Извлеките и очистите РНК из 72 образцов сока растений, полученных на этапе 8.2.7, как на этапе 8.1.6.
   9. Выполните ОТ-кПЦР для обнаружения цитрусовых вирусов и вироидов, как показано на шаге 8.1.7.

Результаты

Экстракция, очистка и качество РНК с использованием тканей цитрусовых, обработанных заушными бутонами, и оценка времени обработки тканей
Для этого теста мы использовали образцы почковой древесины из 255 репрезентативных цитрусовых деревьев, чтобы сравнить качество РНК из за...

Обсуждение

С появлением ГЛБ цитрусовых для сокращения потерь цитрусовая промышленность, регулирующие органы и диагностические лаборатории были призваны полагаться на высокопроизводительные методы экстракции нуклеиновых кислот в сочетании с малопроизводительной ручной обработкой образцов и ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.08" Hex Trimmer line	PowerCare	FPRO07065	Needed to replace blades.
1 Hp, 8 gal air compressor	California Air Tools	8010	Quickly dry chambers after rinsed
1.5 mL microcentrifuge tube	Globe Scientific	111558B	Store sample in after swishing with syinges
10 mL Syringe Set	Technology Evolving Solutions	TE006-F1-10A-G1000-E1	Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING - contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required - do not mix with bleach
12" Ruler	Westcott	‎16012	To measure trimmer line before cutting
12% Sodium Hypochlorite	Hasa	1041	Disinfects chambers after processing
-20 C Freezer	Insignia	NS-CZ70WH0	Store sample after processing
4" x 12" plastic bags	Plymor	FP20-4x12-10	Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal
6" Cotton Swab	Puritan	806-PCL	Swab to remove clogs
7 Gallon Storage Tote	HDX	206152	Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers
Air blow gun	JASTIND	‎JTABG103A	Directs air into the chambers at high pressure
Black Sharpie	Sharpie	S-19421	Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later
Bottle Top Dispensor	Brand	Z627569	Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe
BTE Chamber	Technology Evolving Solutions	TE002BB-A05-E1	Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool
Dish Soap	Dawn	57445CT	Surfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber
Fume hood with hepa filter	Air Science	P5-36XT-A	Fume hood with hepa filter (ASTS-030)  to limit possible contamination and protect against chemical spills
Insulated foam shipping container	PolarTech	261/J50C	Insulated shipping container to ship samples on ice after they are collected
Lab coat	Red Kap	KP14WH LN 46	Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills
Laptop	Microsoft	Surface	Wifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base
NFC Capable Phone	Samsung	Galaxy S9	Phone to download and use TES phone app
NFC clip tag	Technology Evolving Solutions	TE005-Clip-E1	Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app
NFC Collar Tag	Technology Evolving Solutions	TE005-Collar-E1	Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app
Nitrile Gloves	Usa Scientific	3915-4400	Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills
Noise-Reducing Earmuff	3M	90565-4DC-PS	Protect ears while operating air compressor and tissue processing base
Polyurethane Recoil Air Hose	FYPower	‎510019	Attaches air gun to compressor
Saftey glasses	Solidwork	SW8329-US	Protect eyes for chemical and physical hazards
Spray bottle	JohnBee	B08QM81BJV	Spray bleach to deconatinate surfaces
Tissue Extractor Base	Technology Evolving Solutions	TE001-A-E1	System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench
Tissue Processing Base Weight Scale	Technology Evolving Solutions	TE003-A05-200g-01-E1	200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield
Vermiculite	EasyGoProducts	B07WQDZGRP	Needed to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service
Wire Cutter	Boenfu	‎BOWC-06002-US	Wire cutters to cut trimmer line