Automatização do processamento de brotos cítricos para detecção de patógenos a jusante por meio de engenharia de instrumentos

Resumo

Nós projetamos, fabricamos e validamos um instrumento que processa rapidamente tecidos de brotos cítricos ricos em floema. Em comparação com os métodos atuais, o extrator de tecido de budwood (BTE) aumentou o rendimento da amostra e diminuiu os custos de mão de obra e equipamentos necessários.

Resumo

Patógenos de citros transmissíveis por enxerto e limitados por floema, como vírus, viróides e bactérias, são responsáveis por epidemias devastadoras e graves perdas econômicas em todo o mundo. Por exemplo, o vírus da tristeza dos citros matou mais de 100 milhões de árvores cítricas em todo o mundo, enquanto o "Candidatus Liberibacter asiaticus" custou à Flórida US$ 9 bilhões. O uso de brotos de citros testados por patógenos para propagação de árvores é fundamental para o manejo desses patógenos. O Programa de Proteção Clonal de Citros (CCPP) da Universidade da Califórnia, Riverside, usa ensaios de reação em cadeia da polimerase (PCR) para testar milhares de amostras de árvores fontes de brotos cítricos todos os anos para proteger os citros da Califórnia e fornecer unidades de propagação limpas para a National Clean Plant Network. Um gargalo severo na detecção molecular de alto rendimento de vírus e viróides cítricos é a etapa de processamento de tecidos vegetais.

A preparação adequada dos tecidos é crítica para a extração de ácidos nucleicos de qualidade e uso a jusante em ensaios de PCR. O corte, pesagem, liofilização, moagem e centrifugação de tecidos vegetais a baixas temperaturas para evitar a degradação do ácido nucleico consome muito tempo e trabalho e requer equipamentos laboratoriais caros e especializados. Este trabalho apresenta a validação de um instrumento especializado projetado para processar rapidamente tecidos de casca ricos em floema de brotos cítricos, denominado extrator de tecido de madeira de brotação (BTE). O BTE aumenta o rendimento da amostra em 100% em comparação com os métodos atuais. Além disso, diminui a mão de obra e o custo dos equipamentos. Neste trabalho, as amostras de BTE apresentaram um rendimento de DNA (80,25 ng/μL) comparável ao protocolo de corte manual do CCPP (77,84 ng/μL). Este instrumento e o protocolo de processamento rápido de tecidos vegetais podem beneficiar vários laboratórios e programas de diagnóstico de citros na Califórnia e se tornar um sistema modelo para o processamento de tecidos para outras culturas lenhosas perenes em todo o mundo.

Introdução

Patógenos de citros transmissíveis por enxerto, como viróides, vírus e bactérias, têm causado epidemias devastadoras e sérias perdas econômicas em todas as áreas produtoras de citros do mundo. Os viróides dos citros são fatores limitantes de produção devido às exocortices e caquexias que causam em tipos de citros de importância econômica, como trifoliados, híbridos trifoliados, tangerinas, clementinas e tangerinas ^1,2,3. Na Califórnia, esses tipos de citros sensíveis a viróides são a base do crescente e lucrativo mercado de "easy-peelers", seguindo a tendência de mudança na preferência dos consumidores por frutas fáceis de descascar, segmentadas e sem sementes ^4,5,6. Assim, os viróides dos citros são regulamentados pelo Departamento de Alimentação e Agricultura da Califórnia (CDFA) "Citrus Nursery Stock Pest Cleanliness Program-Senado Bill 140", e os laboratórios do Plant Pest Diagnostics Branch da CDFA realizam milhares de testes de viróides dos citros anualmente 7,8,9,10 . O vírus da tristeza dos citros (CTV) foi responsável pela morte de mais de 100 milhões de citros desde o início da epidemia mundial na década de 1930 3,9,10,11. Na Califórnia, isolados do vírus representam uma séria ameaça para a indústria de citros californiana de US$ 3,6 bilhões^12,13,14. Consequentemente, a CDFA classifica o CTV como uma praga de planta de classe A regulamentada, e o laboratório da Central California Tristeza Eradication Agency (CCTEA) realiza extensas pesquisas de campo e milhares de testes de vírus todos os anos^15,16. Estima-se que a bactéria "Candidatus Liberibacter asiaticus" (CLas) e a doença huanglongbing (HLB) tenham causado cerca de US$ 9 bilhões de danos econômicos à Flórida como resultado de uma redução de 40% da área cultivada com citros, uma diminuição de 57% nas operações de citros e uma perda de quase 8.000 empregos^17,18. Na Califórnia, uma hipotética redução de 20% na área cultivada com citros devido ao HLB foi prevista para resultar em mais de 8.200 perdas de empregos e uma redução de mais de meio bilhão de dólares no produto interno bruto do estado. Portanto, o Programa de Prevenção de Pragas e Doenças dos Citros gasta mais de US$ 40 milhões anualmente em pesquisas para testar, detectar e erradicar CLas da Califórnia^14,17,19,20.

Um elemento-chave do manejo de viróides, vírus e bactérias dos citros é o uso de materiais propagativos testados por patógenos (ou seja, madeira de brota) para a produção de árvores. A brota cítrica testada por patógenos é produzida e mantida dentro de programas quarentenários abrangentes que empregam técnicas avançadas de eliminação e detecção de patógenos^10,21. O Citrus Clonal Protection Program (CCPP) da Universidade da Califórnia, Riverside, testa milhares de amostras de budwood todos os anos de variedades cítricas recém-importadas para o estado e os EUA, bem como árvores de origem de budwood cítrico, para proteger os citros da Califórnia e apoiar as funções da National Clean Plant Network for Citrus^10,17,22. Para lidar com o grande volume de testes de citros, ensaios de detecção de patógenos de alto rendimento, confiáveis e custo-efetivos são um componente fundamental para o sucesso de programas como o CCPP ^7,10,22.

Embora ensaios de detecção de patógenos de base molecular, como a reação em cadeia da polimerase (PCR), tenham permitido aumentos significativos no rendimento em laboratórios de diagnóstico de plantas, em nossa experiência, um dos gargalos mais críticos na implementação de protocolos de alto rendimento é a etapa de processamento de amostras de tecido vegetal. Isso é particularmente verdadeiro para os citros porque os protocolos atualmente disponíveis para o processamento de tecidos ricos em floema, como pecíolos foliares e cascas de brotas, são trabalhosos, demorados e requerem equipamentos laboratoriais caros e especializados. Esses protocolos requerem corte manual, pesagem, liofilização, moagem e centrifugação a baixas temperaturas para evitar a degradação do ácido nucleico 8,23,24. Por exemplo, no laboratório de diagnóstico CCPP, o processamento de amostras inclui (i) corte manual (6-9 amostras/h/operador), (ii) liofilização (16-24 h), (iii) pulverização (30-60 s) e (iv) centrifugação (1-2 h). O processo também requer suprimentos especializados (por exemplo, tubos de bloqueio de segurança para serviço pesado, bolas de moagem de aço inoxidável, adaptadores, lâminas, luvas) e várias peças de equipamentos de laboratório caros (por exemplo, freezer ultrabaixo, liofilizador, pulverizador de tecidos, crioestação de nitrogênio líquido, centrífuga refrigerada).

Como em qualquer indústria, a engenharia de equipamentos e a automação de processos são fundamentais para reduzir custos, aumentar o rendimento e fornecer produtos e serviços uniformes e de alta qualidade. A indústria de citros precisa de instrumentos de processamento de tecidos de baixo custo que exijam habilidade mínima para operar e, como tal, sejam fáceis de transferir para laboratórios de diagnóstico e operações de campo para permitir alta capacidade de processamento de amostras para detecção rápida de patógenos a jusante. A Technology Evolving Solutions (TES) e o CCPP desenvolveram (i.e., projetam e fabricam) e validaram (i.e., testados com amostras de citros e comparados com procedimentos laboratoriais padrão) um instrumento de baixo custo (i.e., eliminou a necessidade de equipamentos laboratoriais especializados) para o processamento rápido de tecidos cítricos ricos em floema (i.e., budwood), denominado extrator de tecido de budwood (BTE). Como visto na Figura 1, o BTE inclui um componente base para alimentação e controles, além de uma câmara removível para o processamento de brotos cítricos. A câmara BTE é composta por um rebolo projetado especificamente para retirar os tecidos da casca ricos em floema do broto cítrico. O tecido da casca triturada é ejetado rapidamente através de uma porta deslizante para uma seringa contendo tampão de extração, filtrado e preparado para extração e purificação de ácido nucleico sem qualquer manuseio ou preparação adicional (Figura 1). O sistema BTE também inclui um aplicativo de rastreamento de amostras sem papel e um aplicativo de pesagem integrado, que registram as informações de processamento de amostras em um banco de dados on-line em tempo real.

O sistema BTE aumentou a capacidade de diagnóstico laboratorial do CCPP em mais de 100% e tem consistentemente produzido extratos de tecido cítrico adequados para a purificação de ácidos nucleicos de alta qualidade e a detecção a jusante de patógenos transmissíveis por enxerto de citros usando ensaios de PCR. Mais especificamente, o BTE reduziu o tempo de processamento de tecidos de mais de 24 h para ~3 min por amostra, substituiu instrumentos de laboratório que custavam mais de US$ 60.000 (Figura 2, etapas 2-4) e permitiu o processamento de amostras maiores.

Este artigo apresenta os dados de processamento de tecido de casca de citros de alto rendimento BTE, extração de ácido nucleico e validação de detecção de patógenos com amostras de brotos cítricos de árvores de origem, incluindo todos os controles positivos e negativos apropriados da Instalação de Quarentena CCPP Rubidoux e da Instalação da Fundação Lindcove, respectivamente. Também apresentamos as mudanças de produtividade e tempo de processamento em comparação com o procedimento laboratorial atual (Figura 2). Além disso, este trabalho fornece um protocolo detalhado e passo a passo para laboratórios de testes de patógenos cítricos e demonstra como o BTE pode apoiar as funções de estoque de viveiro limpo de patógenos, levantamento e programas de erradicação.

Figura 1: Extrator de tecido de budwood. O BTE inclui um componente base para alimentação e controles, além de uma câmara removível para o processamento de brotos cítricos. A câmara BTE é composta por um rebolo projetado especificamente para retirar os tecidos da casca ricos em floema da madeira de brotos cítricos. O tecido da casca triturada é ejetado rapidamente através de uma porta deslizante para uma seringa, filtrado e preparado para extração e purificação de ácido nucleico sem qualquer manuseio ou preparação adicional. Abreviação: BTE = extrator de tecido de budwood. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Comparação passo a passo entre o procedimento convencional de laboratório de corte manual e o processamento de BTE. O processamento de BTE envolve processamento de tecido de casca de citros de alto rendimento, extração de ácido nucleico e detecção de patógenos. O tempo para cada etapa é indicado entre parênteses. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

1. Coleta das amostras de brotos cítricos para envio

1. Envie à Technology Evolving Solutions uma planilha de informações de árvore para que eles carreguem em seu servidor web (eventualmente, o usuário criará novas árvores).
2. Use o rastreador TES do aplicativo de telefone para selecionar uma árvore e mantenha uma etiqueta de coleira de comunicação de campo próximo (NFC) no telefone para carregar as informações da árvore na tag.
3. Insira de três a quatro amostras de broto cítrico no porta-sacos plásticos compatível com BTE e feche com a tampa.
   1. Certifique-se de que o comprimento da gema não exceda 8 pol e não seja inferior a 5 pol.
      1. Se o comprimento for superior a 8 pol, use uma lâmina de barbear descartável estéril ou tesouras de poda descontaminadas com solução de água sanitária a 10% (hipoclorito de sódio a 1%) para torná-la mais curta.
      2. Se o comprimento for inferior a 5 pol, colete uma amostra diferente de madeira de broto para colocar no saco.
   2. Certifique-se de que qualquer crescimento axilar ou espinhos grandes sejam removidos à mão ou usando ferramentas de corte higienizadas com água sanitária a 10% (hipoclorito de sódio a 1%).
      OBS: Esta etapa é importante para que a gema seja mais fácil de manobrar na abertura da câmara.
   3. Certifique-se de que não há amostras de madeira de broto que tenham características curvas. Se o fizerem, retire-os com ferramentas de corte higienizadas a 10% (hipoclorito de sódio a 1%) e coloque nos sacos BTE apenas as porções retas da amostra.
      NOTA: O budwood curvo é muito difícil de manobrar no instrumento, resultando em listras irregulares da casca.
4. Use o rastreador TES do aplicativo de telefone para escanear a etiqueta de colar NFC da árvore e vinculá-la à tag de clipe NFC na bolsa de amostra.
5. Preste atenção à espessura da madeira de gema, pois isso determina como o operador irá retirar a casca de madeira de broto rica em floema dentro da câmara BTE.
   1. Se a madeira de gema tiver uma espessura abaixo de 0,20 pol, tenha cuidado ao descascar a madeira de gema, porque os fios de fiação de alta velocidade na câmara pulverizarão toda a madeira de gema até seu núcleo, além da camada de casca e nos tecidos não ricos em floema de madeira e medula.
   2. Selecione brotos mais espessos porque é mais fácil retirar os tecidos da casca, evitando os tecidos de madeira de broto não ricos em floema.
6. Coloque as amostras em um recipiente de transporte isolado com algumas bolsas de gelo.

2. Configuração no exaustor

OBS: É preferível operar o BTE dentro de um exaustor. Isso reduzirá o risco de contaminação cruzada de tecidos vegetais e contaminação de laboratório.

1. Desinfetar usando um borrifador de 10% (hipoclorito de sódio a 1%).
   1. Borrife a superfície do capuz e deixe a água sanitária descansar por cerca de 1 min antes de limpá-la com um papel toalha.
   2. Borrife um papel toalha com a solução de água sanitária. Limpe a base TE, os componentes da balança de peso (balança, escudo de ar e torre) e uma caneta marcadora.
2. Desembrulhe uma seringa definida para o número de amostras a serem processadas e coloque-as dentro de uma caixa de papelão coberta.
3. Tenha um pacote de cotonetes disponíveis fora do capô, caso sejam necessários.
4. Prepare a balança de peso.
   1. Remova a torre de peso da balança e mantenha pressionado o botão liga/desliga para ligá-la. Coloque a torre no centro da escala depois que a escala exibir 0.
   2. Deslize a proteção de ar da balança de peso sobre a frente da balança.
5. Prepare a base do extrator de tecido acionando o interruptor na parte de trás. Certifique-se de que o interruptor no lado esquerdo da caixa está pressionado para baixo na parte superior. Aguarde um LED verde piscando, que indica que a câmara está pronta.

3. Montagem das estações de limpeza (Figura Suplementar S1).

1. Coloque 1 L de água no limpador ultra-sônico.
2. Embrulhe dois sacos de lixo por cima do limpador ultrassônico.
3. Despeje ~5 L de água sanitária a 10% (solução de hipoclorito de sódio a 1%) no limpador ultrassônico.
4. Encha a banheira de água com água suficiente para submergir uma câmara.
5. Ligue o compressor de ar e abra a válvula.
6. Monte um pano de fundo para pegar o líquido enquanto a câmara está secando.

4. Processamento do material para o BTE para a decapagem da casca da brota cítrica

1. Carregue a câmara na Base BTE.
   1. Preparar a Câmara BTE.
      1. Anexe um saco de amostra vazio à parte de trás da câmara. Use dois O-rings para prender o saco vazio ao bocal traseiro da câmara BTE.
      2. Inspecione a lâmina em busca de sinais de desgaste ou danos, como cortes que se formam na lâmina onde ela continua no plástico ou cortes que se formam na ponta. Certifique-se de que a seta na lâmina esteja alinhada com o símbolo de bloqueio único.
      3. Certifique-se de que a liberação de ar na parte inferior da câmara esteja voltada para o símbolo O . Coloque a tampa transparente sobre a abertura da câmara e deslize a corrediça BTE transparente para a câmara usando a pista à direita da câmara. Empurre a trava na parte inferior da câmara até onde ela puder ir para o slide. Verifique se a tampa do êmbolo está montada na parte superior da corrediça.
   2. Coloque a câmara na base BTE com o bocal da base BTE saliente na parte de trás da câmara. Aguarde até que o LED azul pisque, indicando que o posicionamento foi bem-sucedido.
2. Carregue a amostra na base do BTE movendo o adesivo branco na etiqueta do clipe NFC para um Z no lado direito da caixa. Mova a tag em um movimento circular lento em Z até que a luz amarela comece a piscar. Fixar a amostra à base BTE e certificar-se de que o saco de amostra não tem furos; Se houver um furo, remarque-o com fita adesiva. Coloque o O-ring sobre o saco de amostra para prendê-lo à frente do bico BTE.
3. Carregue o conjunto de seringas não utilizado.
   1. Tara o conjunto de seringas. Coloque a seringa não utilizada colocada na torre da balança. Remova o conjunto de seringas quando uma luz vermelha começar a piscar ou a escala exibir 0.
   2. Retire o êmbolo da seringa com o filtro. Certifique-se de que o fluido está na seringa inferior (não filtrante). Coloque o êmbolo de lado sobre um papel toalha ou sobre a torre onde o êmbolo preto não está tocando nenhuma superfície.
   3. Conecte a seringa à porta de saída deslizante pressionando a porta de saída na seringa e girando 90°.
4. Processar a amostra de madeira de gema.
   ATENÇÃO: O BTE possui partes móveis de alta velocidade. Toda a operação precisa ocorrer dentro de um exaustor. Todos os usuários devem usar óculos de proteção, protetores auriculares e todos os outros equipamentos de proteção individual (EPIs), como luvas e jalecos.
   1. Pressione o botão preto superior para iniciar a máquina. Pressione uma segunda vez para parar o motor a qualquer momento durante o processamento.
      NOTA: A caixa tem sensor de velocidade e temperatura para garantir que funcione corretamente.
   2. Pegue um palito de madeira no saco e coloque-o na parte superior do bico BTE.
   3. Pegue o palito de madeira do outro lado da câmara com a outra mão e lentamente desça na lâmina. Ouça um zumbido suave indicando que o budwood está sendo descascado. Mova lentamente a madeira de botão para frente e para trás enquanto a gira.
      1. Se for ouvido um som alto e agressivo de corte, mova rapidamente o ramo para a parte superior e/ou pressione o botão superior para parar o motor. Para parar o motor, utilize o interruptor do lado direito para concluir o processamento (ver passo 4.4.3.2).
      2. Se nenhum material estiver saindo da saída ao cortar, a câmara tem um entupimento. Desligue o motor, remova a tampa do êmbolo deslizante e use o plástico do cotonete para empurrar o entupimento para fora da saída da máquina. Use o interruptor do lado direito para concluir o processamento: Up = Forward cutting; Meio = Motor desligado; Down = Corte Reverso.
   4. Repita as etapas 4.4.2 e 4.4.3 para as ramificações restantes.
      NOTA: Um indicador geral de que a casca de broto suficiente foi removida é quando 25% da seringa foi preenchida com tecido vegetal. Patógenos transmissíveis por enxertos de citros podem estar distribuídos de forma desigual na árvore. Portanto, três a quatro amostras de madeira de brota são coletadas ao redor da copa dos citros. É importante que cada amostra de madeira de gema no saco de transporte BTE contribua para a amostra final de tecido moído para garantir que uma amostra representativa de árvore completa será testada para agentes patogénicos.
   5. Pressione o botão preto superior para interromper o processamento. Aguarde até que a luz comece a piscar amarela novamente.
5. Verifique o peso da amostra.
   1. Gire a seringa 90° e puxe-a para baixo para se desprender. Coloque o êmbolo de volta na seringa e coloque a seringa na torre.
   2. Aguarde até que a balança detecte automaticamente a amostra e determine se ela está dentro da faixa de peso adequada (0,25 ± 0,05 g). Se o peso da amostra for demasiado baixo (<0,20 g), repetir o passo 4.4; o LED vermelho começará a piscar. Se o peso da amostra for demasiado elevado (>0,30 g), retirar parte do material da amostra; o LED amarelo começará a piscar mais lentamente. Se a amostra estiver dentro do intervalo, o LED verde começará a piscar.
6. Homogeneização da amostra de gemas
   1. Retire o êmbolo da seringa com a amostra, empurre o líquido para dentro da seringa com a amostra e adicione novamente o êmbolo. O êmbolo empurra o tampão e a seiva da planta através do filtro de malha (retendo quaisquer pedaços grandes de tecido da casca) e através do tubo de borracha para a seringa vazia.
   2. Misture a amostra empurrando o tampão e a seiva da planta de um para o outro de uma seringa para a outra. Repita ~3x-4x e até que a amostra se torne uma mistura líquida verde homogênea.
   3. Uma vez bem homogeneizada, empurre a amostra de seiva vegetal para dentro da seringa sem o filtro de malha e retire o tubo de borracha e a seringa com o filtro da seringa com a amostra.
   4. Expulsar a amostra de seiva vegetal da seringa para um tubo de microcentrífuga estéril de 2 ml e conservar a -20 °C até nova utilização. Use um marcador permanente para rotular a amostra com o número do saco.
      NOTA: A seiva da amostra vegetal da etapa 4.6.5 pode agora ser processada com qualquer um dos ácidos nucleicos, RNA ou ADN disponíveis, métodos de extracção baseados em fenol-clorofórmio, coluna de sílica ou esferas magnéticas 9,25,26,27 para extracção e purificação de ácidos nucleicos (ver passo 7) e detecção a jusante de agentes patogénicos transmissíveis por enxertos de citrinos (ver passo 8).

5. Higienização da câmara removível do BTE

CUIDADO: Se o tampão do conjunto de seringas entrar na câmara ou deslizar, enxágue e siga todas as regras de segurança do laboratório antes da limpeza. O conjunto de seringas contém tiocianato de guanidina. Se o tampão do conjunto de seringas entrar em contato com a água sanitária, ele criará gás cianeto.

1. Execute as etapas a seguir após o processamento da 10ª amostra na câmara. Observe que o LED verde continuará piscando em vez de passar para o azul piscando.
2. Desmontar a câmara BTE para limpar todos os possíveis contaminantes; Remova a tampa de plástico transparente, limpe a corrediça da câmara e limpe a porta de entupimento na corrediça da câmara.
3. Gire a válvula de liberação de ar na parte inferior da câmara para a posição aberta (marca de cadeado aberto). Coloque os componentes da câmara no limpador ultrassónico de configuração (ver passo 3.1). Coloque a tampa sob a câmara para evitar que flutue. Execute o limpador ultra-sônico por 15 min.
   NOTA: O banho de limpeza ultra-sônica (5 L) pode conter até duas câmaras.
4. Enxaguar os componentes da câmara em banho-maria (passo 3.4) durante, pelo menos, 30 s. Mova os componentes da câmara para a estação de secagem.
   CUIDADO: A secagem causará movimentos rápidos nas partes dentro da câmara, ruídos altos (~85 decibéis [dB]) e possíveis respingos. Todos os usuários devem usar óculos de proteção, protetores auriculares, jalecos e todos os outros EPIs, conforme exigido pelas normas de segurança do laboratório operacional.
5. Secar a câmara BTE.
   1. Posicione a pistola de ar em linha com o sulco da abertura superior da câmara (onde normalmente estaria a corrediça). Pressione o gatilho da arma para distribuir ar por ~30 s.
      Observação : verifique se a abertura está longe do usuário em direção ao pano de fundo. Isso deve girar o conjunto de lâminas para remover o líquido preso embaixo dela.
   2. Posicione a pistola de ar em direção aos bicos superiores da câmara. Pressione o gatilho da pistola de ar e trace lentamente três círculos completos de cada entrada do bico.
   3. Posicione a pistola de ar no centro do BTE. A partir do ponto mais interno, segure o gatilho para baixo e mova-se até que a pistola de ar aponte para onde o escorregador estaria.
   4. Passe rapidamente o ar por toda a câmara, frente e verso, para tirar a água da superfície do exterior.
6. Seque a lâmina do BTE.
   1. Posicione a pistola de ar na ranhura do êmbolo da corrediça e pressione o gatilho para ejetar água para fora da saída da corrediça.
   2. Passe uma pistola de ar ao longo da superfície interna da corrediça para secá-la.
   3. Execute uma pistola de ar ao longo do sulco do escorregador para empurrar a água.
   4. Passe rapidamente o ar por todo o exterior para tirar água da superfície.
7. Seque os componentes.
   1. Segure a tampa do êmbolo deslizante e os O-rings na mão e pressione o gatilho.
   2. Passe uma pistola de ar sobre a superfície interna da tampa.
   3. Coloque os componentes na câmara e deslize para continuar secando ou remontá-los.
      NOTA: Para um ambiente de alto processamento de tecidos com vários BTEs funcionais, pode ser fornecido um sistema de higienização em lote capaz de descontaminar 10 câmaras simultaneamente.

6. Descarte e higienização

1. Descarte as seringas e tubos de borracha no recipiente de resíduos de guanidina designado.
2. Descarte qualquer material vegetal no recipiente de resíduos bioperigosos.
3. Remova a câmara BTE da base BTE.
4. Desmontar a câmara BTE e proceder à sua descontaminação, conforme descrito na etapa 5.

7. Avaliação do processamento tecidual e da qualidade do RNA purificado dos extratos de brotos de citros BTE

NOTA: Neste protocolo, foram utilizadas amostras de budwood de 255 citros para comparar o tempo necessário para o processamento do tecido da brota cítrica e a qualidade do RNA purificado a partir de extratos de tecido da casca preparados por BTE (Figura 2, lado direito, passo 1, passo 5 e passo 6) versus aquele preparado seguindo o método de processamento de tecido de budwood de citros aprovado regulamentadamente utilizando descascamento e corte manual, liofilização, pulverização e centrifugação do tecido da casca, conforme descrito por Dang et ^al.23 (Figura 2, lado esquerdo, passos 1-6).

1. Procedimento laboratorial atual: Preparar amostras de budwood para processamento de tecidos de acordo com o método aprovado regulamentarmente²³.
   1. Realizar descascamento e corte manual do tecido da casca, liofilização, pulverização, centrifugação e transferência da seiva da planta para o tubo de extração de RNA, conforme descrito por Dang et ^al.23 (Figura 2, lado esquerdo, passos 1-6).
   2. Depois de descascar manualmente as três a quatro amostras de gema de cada árvore testada, colocar toda a gema dentro de um porta-sacos plásticos compatível com BTE e armazenar a 4 °C até ao processamento do BTE (passo 7.2).
2. Procedimento BTE: Iniciar o processamento do tecido da brota cítrica BTE (secção 4, passos 4.1-4.6; Figura 2, lado direito, passo 1, passo 5 e passo 6).
   1. Utilizar as amostras de madeira de gema armazenadas dentro dos sacos de transporte BTE do passo 7.1.2.
3. Extrair e purificar o RNA da seiva vegetal obtida a partir do procedimento laboratorial atual (etapa 7.1.1) e do procedimento BTE (etapa 7.2.2) utilizando o método semi-automatizado baseado em esferas magnéticas aprovado regulamentarmente 8,23,28.
4. Avaliar a qualidade do RNA medindo sua concentração, pureza e integridade 8,23,24,29,3 ^3,31.
   1. Para calcular a concentração, use espectrofotometria e densidade óptica (DO) no comprimento de onda de 260 nm.
   2. Para avaliar a pureza, use uma razão OD espectrofotométrica de 260/280.
   3. Para verificar a integridade, utiliza-se a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) de transcrição reversa (RT) visando o RNAm do gene dos citros NADH desidrogenase^24,32.

8. Avaliação da contaminação cruzada e detecção de vírus e viróides dos citros utilizando RNA purificado de extratos de brotos de citros BTE

NOTA: Neste protocolo, foram utilizadas amostras de brotos de 72 citros não infectados e uma mistura de árvores infectadas com vírus e viróides para avaliar o potencial de contaminação cruzada entre amostras quando processadas por BTE (Figura 2, lado direito, passo 1, passo 5 e passo 6) e a adequação do RNA purificado de extratos de tecido da casca preparados por BTE para ser usado como molde para a detecção RT-qPCR de vírus e viróides dos citros.

1. Primeiro processamento de amostra BTE: Realizar um experimento de linha de base com 72 amostras não infectadas.
   1. Preparar três câmaras (A-C) BTE (PASSO 4.1.1).
   2. Preparar todas as amostras de brotos de citrinos não infectadas (1-72) em sacos BTE e preparar um número igual (72) no sistema de recolha de amostras BTE com duas seringas, com um sistema de seringas para cada amostra (passo 2.4).
   3. Separe os sacos de coleta de amostras e as seringas de coleta de amostras em seis lotes (I-VI) de 12 amostras cada.
   4. Iniciar o processamento do tecido de broto cítrico BTE (etapa 4) seguindo a sequência abaixo (etapas 8.1.4.1-8.1.4.6) (Ver Tabela 1, Primeiro Processamento de Amostra BTE).
      1. Para o lote I/amostras 1-12, processar 12 amostras usando a câmara A. Higienizar a câmara A após a amostra 12 (etapa 5).
      2. Para o Lote II/Amostras 13-24, processar 12 amostras usando a câmara B. Sanitizar a câmara B após a amostra 24 (etapa 5).
      3. Para o lote III/amostras 25-36, processar 12 amostras usando a câmara C. Higienizar a câmara C após a amostra 36 (etapa 5).
      4. Para o lote IV/amostras 37-48, processar 12 amostras utilizando a câmara A higienizada (passo 8.1.4.1).
      5. Para o lote V/amostras 49--60, processar 12 amostras utilizando a câmara B higienizada (passo 8.1.4.2).
      6. Para o lote VI/amostras 60-72, processar 12 amostras utilizando a câmara C higienizada (passo 8.1.4.3).
   5. Conservar os sacos BTE com todas as amostras a 4 °C até à utilização no passo 8.2.
   6. Extrair e purificar o RNA das 72 amostras de seiva vegetal geradas nas etapas 8.1.4.1-8.1.4.6 usando o método semi-automatizado baseado em esferas magnéticas aprovado regulamentarmente 8,23,28.
   7. Realizar RT-qPCR para detecção de vírus e viróides dos citros, conforme descrito anteriormente ^8,33.
2. Para o segundo processamento de amostras de BTE, realizar um experimento de contaminação cruzada com 70 amostras não infectadas e duas amostras infectadas misturadas.
   1. Preparar três câmaras (A-C) BTE (PASSO 4.1.1).
   2. Preparar a amostra de brotos de citrinos infectados com mistura (73) em dois sacos de BTE (passo 1.3) para um número total de duas amostras infectadas.
   3. Recolher os sacos BTE com as amostras de brotos de citrinos não infectadas do passo 8.1.5, excepto a amostra 3-Lote I e a amostra 51-Lote V (ver substituição da amostra no ponto 8.2.4), para um número total de 70 amostras não infectadas.
   4. Incluir o primeiro saco BTE com a amostra infectada com a mistura 73 em vez da amostra 3 no lote I e o segundo no lugar da amostra 51 no lote V para um número total de 72 amostras.
   5. Preparar um número igual (72) no sistema de recolha de amostras BTE com duas seringas, com um sistema de seringas duplas para cada amostra (passo 2.4).
   6. Separe os 72 sacos de amostra e seringas de coleta de amostras em seis lotes (I-VI) de 12 amostras cada.
   7. Iniciar o processamento do tecido da brota dos citros BTE (etapa 4), seguindo a mesma sequência das etapas 8.1.4.1-8.1.4.6.
      NOTA: A única diferença é a substituição da Amostra 3 no Lote I e da Amostra 51 no Lote V pela amostra infectada 73 (etapa 8.2.4) (Tabela 1, Segundo Processamento de Amostra BTE).
   8. Extrair e purificar o ARN das 72 amostras de seiva vegetal geradas na etapa 8.2.7 como na etapa 8.1.6.
   9. Realizar RT-qPCR para a detecção de vírus cítricos e viróides, como na etapa 8.1.7.

Resultados

Extração, purificação e qualidade de RNA utilizando tecido cítrico de broto processado por BTE e avaliação do tempo de processamento tecidual
Foram utilizadas amostras de gema de 255 citros representativos para este teste para comparar a qualidade do RNA do BTE versus o procedimento padrão. As amostras foram processadas pelo extrator de tecido de budwood (BTE) (etapas do protocolo 4.1-4.6 e Figura 2, lado direito, passo 1, passo 5 e passo 6) ou preparadas seguindo o método de processamento de...

Discussão

Com o advento da doença dos citros do HLB, para reduzir as perdas, a indústria citrícola, as agências reguladoras e os laboratórios de diagnóstico têm sido instados a confiar em métodos de extração de ácido nucleico de alto rendimento combinados com processamento manual de amostras de baixo rendimento e ensaios de detecção de patógenos, como o qPCR³⁴ , para o teste de árvores individuais, em combinação com práticas de manejo de doenças³⁵. A taxa de positi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.08" Hex Trimmer line	PowerCare	FPRO07065	Needed to replace blades.
1 Hp, 8 gal air compressor	California Air Tools	8010	Quickly dry chambers after rinsed
1.5 mL microcentrifuge tube	Globe Scientific	111558B	Store sample in after swishing with syinges
10 mL Syringe Set	Technology Evolving Solutions	TE006-F1-10A-G1000-E1	Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING - contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required - do not mix with bleach
12" Ruler	Westcott	‎16012	To measure trimmer line before cutting
12% Sodium Hypochlorite	Hasa	1041	Disinfects chambers after processing
-20 C Freezer	Insignia	NS-CZ70WH0	Store sample after processing
4" x 12" plastic bags	Plymor	FP20-4x12-10	Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal
6" Cotton Swab	Puritan	806-PCL	Swab to remove clogs
7 Gallon Storage Tote	HDX	206152	Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers
Air blow gun	JASTIND	‎JTABG103A	Directs air into the chambers at high pressure
Black Sharpie	Sharpie	S-19421	Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later
Bottle Top Dispensor	Brand	Z627569	Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe
BTE Chamber	Technology Evolving Solutions	TE002BB-A05-E1	Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool
Dish Soap	Dawn	57445CT	Surfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber
Fume hood with hepa filter	Air Science	P5-36XT-A	Fume hood with hepa filter (ASTS-030)  to limit possible contamination and protect against chemical spills
Insulated foam shipping container	PolarTech	261/J50C	Insulated shipping container to ship samples on ice after they are collected
Lab coat	Red Kap	KP14WH LN 46	Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills
Laptop	Microsoft	Surface	Wifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base
NFC Capable Phone	Samsung	Galaxy S9	Phone to download and use TES phone app
NFC clip tag	Technology Evolving Solutions	TE005-Clip-E1	Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app
NFC Collar Tag	Technology Evolving Solutions	TE005-Collar-E1	Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app
Nitrile Gloves	Usa Scientific	3915-4400	Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills
Noise-Reducing Earmuff	3M	90565-4DC-PS	Protect ears while operating air compressor and tissue processing base
Polyurethane Recoil Air Hose	FYPower	‎510019	Attaches air gun to compressor
Saftey glasses	Solidwork	SW8329-US	Protect eyes for chemical and physical hazards
Spray bottle	JohnBee	B08QM81BJV	Spray bleach to deconatinate surfaces
Tissue Extractor Base	Technology Evolving Solutions	TE001-A-E1	System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench
Tissue Processing Base Weight Scale	Technology Evolving Solutions	TE003-A05-200g-01-E1	200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield
Vermiculite	EasyGoProducts	B07WQDZGRP	Needed to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service
Wire Cutter	Boenfu	‎BOWC-06002-US	Wire cutters to cut trimmer line