小鼠肠隐窝和单个干细胞的类器官的3D培养用于类器官研究

摘要

我们描述了一种从隐窝中分离小鼠小肠隐窝和培养肠道3D类器官的方案。此外，我们描述了一种在没有上皮下细胞生态位的情况下从单个肠道干细胞生成类器官的方法。

摘要

目前，类器官培养是 体外 研究不同生物学方面和不同器官疾病的重要工具。小鼠小肠隐窝在3D细胞外基质中培养时可以形成类器官，模仿肠上皮。类器官由实现各种肠道稳态功能的所有细胞类型组成。这些包括潘氏细胞、肠内分泌细胞、肠细胞、杯状细胞和簇状细胞。将表征良好的分子添加到培养基中以富集含有G蛋白偶联受体5的富含亮氨酸的重复标记的肠道干细胞（ISC），并用于驱动特定谱系的分化;这些分子包括表皮生长因子，Noggin（一种骨形态发生蛋白）和R-spondin 1。此外，还详细介绍了从单个产生促红细胞生成素的肝细胞受体 B2 （EphB2） 阳性 ISC 生成类器官的方案。在这种方法的文章中，描述了从组织中分离小肠隐窝和单个ISC并确保类器官有效建立的技术。

引言

肠道类器官于2009年首次建立，鉴于其与成熟组织的形态和功能相似性，已成为研究肠道生物学的强大体外工具。最近，源自成体组织干细胞的培养类器官的技术进步使得具有自我更新和分化潜力的肠道干细胞（ISC）的长期培养成为可能。这些类器官已被广泛用于胃肠道生理学和病理^{生理学的基础}和转化研究1，²，³，⁴，^5，6。Clevers小组开发的3D类器官为研究肠上皮提供了强大的工具，提高了生理相关性⁷。由于肠道类器官来源于组织干细胞，由多种细胞类型组成，因此它们概括了肠上皮的功能。值得注意的是，单分选富含亮氨酸的重复序列含有G蛋白偶联受体5阳性（Lgr5⁺）的干细胞也可以产生没有任何Paneth细胞或ISC生态位（例如上皮生态位或基质生态位）的3D类器官⁷。然而，与隐窝和ISC-Paneth细胞双联8相比，单分选Lgr5⁺细胞的类器官形成能力^较低。

越来越多的研究表明，乙二胺四乙酸（EDTA）孵育或胶原酶解离的方法会导致上皮松动和隐窝释放。由于酶解离可能对隐窝的细胞状态有影响，因此通常使用机械分离方法来解离组织。虽然机械消化是一种快速技术，但这种方法可能与不一致的隐窝产量或细胞活力差有关⁹。因此，EDTA处理和机械解离可以结合起来，产生更好的隐窝产量。本文所示方法的一个特点是在EDTA螯合¹⁰后对组织碎片进行剧烈摇动。剧烈摇动允许从小肠中的隐窝绒毛复合物中有效地分离隐窝。手动摇晃的程度决定了分离。因此，从复合体中获得隐窝对于该领域的实验者很重要。此外，适当的技能可以将绒毛污染减少到最低限度，并增加隐窝的数量。

因此，该实验方案采用小鼠来源的小肠类器官，可以在用EDTA处理后更好地分离具有物理力的隐窝进行解离。已知产促红细胞生成素肝细胞受体B2（EphB2）的表达模式部分反映了隐窝环境。例如，EphB2阳性细胞从下到上¹¹个组织。基于EphB2表达进行荧光激活细胞分选（FACS），将获得的细胞分为4组：EphB2高、EphB2^中、EphB2^低和EphB2^阴性。然后，证明了野生型（WT）小鼠中单分选EphB2^高细胞的类器官生长。

研究方案

所有小鼠实验均由三得利动物伦理委员会（APRV000561）批准，所有动物均按照委员会关于实验动物护理和使用指南进行维护。使用 肌肉肌肉的标准 WT菌株（C57BL6 / J）。使用10周至20周龄的雄性和雌性小鼠。用CO₂ 窒息对小鼠实施安乐死。

1.小肠隔离

1. 用实验室剪刀切除小肠，包括十二指肠和空肠近半部分。
2. 将组织转移到培养皿中，并在5mL注射器中用5mL冷PBS-ABx（PBS +青霉素 - 链霉素[1%] + 庆大霉素[0.5%]）冲洗小肠以清除管腔内容物。
3. 用实验室剪刀纵向切开组织，并在摇晃时用冷PBS-ABx手动清洗。
   注意：通过用载玻片刮掉绒毛，可以减少绒毛污染¹².
4. 使用实验室剪刀收集大约 5 mm x 5 mm 的肠段碎片。将片段转移到带镊子的 50 mL 管中，并加入 25 mL 冷 PBS-ABx。
5. 用 25 mL 冷 PBS-ABx 来回搅拌 10 次以去除 50 mL 管中的肠道内容物，从而洗涤碎片。

2. 隐窝隔离

1. 将碎片在含有2mM EDTA的PBS-ABx中在冰上孵育30分钟，不摇晃。
2. 为了便于细胞外基质（ECM）固化，事先在37°C组织培养箱中孵育24孔板。
3. 用真空泵从细胞培养系统中吸出EDTA溶液，加入25mL新鲜，冷的PBS-ABx，然后用手用力上下摇动30x-40x以释放隐窝绒毛复合物。
   注意：分离的隐窝和绒毛可以通过在4倍放大镜下对悬浮液中的25μL液滴进行显微镜观察来检查。
4. 接下来，通过70μm过滤器过滤悬浮液一次。
5. 在4°C下以390× g 离心悬浮液3分钟。
6. 用移液将隐窝沉淀重悬于20 mL山梨醇DMEM（高级DMEM / F12 +青霉素 - 链霉素[1%]+庆大霉素[0.5%]+胎牛血清[1%]+山梨糖醇[2%]）中，并将隐窝悬浮液转移到两个新的15 mL管中，分成两个10 mL溶液以低速离心。
   注意：可以使用低速离心分离大细胞团和细胞/碎片。大细胞团在沉淀中，细胞/碎片在上清液中。
7. 在4°C下以80× g 离心两个隐窝悬浮液3分钟，然后轻轻吸出上清液。
   注意：由于颗粒形成较弱，因此不要吸气太多。在每个试管中留下 2 mL 上清液。
8. 再次向每个试管中加入 10 mL 山梨糖醇 DMEM。将悬浮液在4°C下以80× g 离心3分钟。
9. 吸出上清液后，在每个管中留下2mL上清液，加入10mL山梨醇DMEM用于重悬，并在4°C下以80× g 离心隐窝悬浮液最后3分钟。
10. 吸出上清液后，在每个管中留下2mL上清液，加入10mL完全DMEM（高级DMEM / F12 +青霉素 - 链霉素[1%]+庆大霉素[0.5%] +胎牛血清[1%]）通过上下移液重悬沉淀，并放置1分钟。
    注意：等待1分钟以有效地获得浮动地穴。
11. 1分钟后，收集每个10mL悬浮液，总共20mL，并用70μm细胞过滤器过滤一次以纯化隐窝。
12. 在接种基本上纯的隐窝之前，计算过滤后的完全DMEM中的隐窝数量，然后在4°C下以290× g 离心3分钟。
    1. 将 25 μL 液滴滴入 6 cm 培养皿中的三个点。在显微镜下以 4 倍放大倍率计算隐窝的数量，并计算每 25 μL 液滴的隐窝浓度。
13. 用每孔 40 μL ECM 悬浮 100 个隐窝。上下移液5x-10x以获得ECM中隐窝的均匀悬浮液，然后在37°C预热的24孔板中接种。
    注意：始终将ECM放在冰上以避免聚合。小心移液以避免在ECM中产生气泡。
14. 将24孔板在37°C，5%CO₂ 培养箱中孵育15分钟，用于ECM的聚合。
15. 最后，在室温下用含有小鼠表皮生长因子 （EGF）、重组小鼠 R-spondin 1 和重组小鼠 Noggin 的 500 μL 培养基覆盖 ECM。每孔材料的最终浓度如下：青霉素-链霉素（1%），每个50 U/mL;庆大霉素（0.5%），25微克/毫升;EGF， 20 纳克/毫升;诺金，100纳克/毫升;R-斯庞丁 1，500 纳克/毫升;L-谷氨酰胺，2毫米。
16. 在5%CO₂ 培养箱中于37°C开始地穴培养。
    注意：对于24孔板中类器官的培养基，请参见 表1。
17. 使用配备每3小时20倍物镜的记录延时图像显微镜进行长期实时成像以观察类器官形态发生，最长可达7天。以 1 μm（1 μm x 5 步）的 z 步长获取连续 z 堆叠图像。
18. 每隔一天更换一次培养基。

3. 荧光激活细胞分选 （FACS）

1. 从小鼠中分离隐窝（见第2节）。
2. 用2mL胰蛋白酶在37°C下处理分离的隐窝30分钟。
3. 用10mL PBS停止反应，然后通过20μm细胞过滤器。
4. 将溶液在4°C下以390× g 离心3分钟，并用100μL完全DMEM重悬。
5. 加入抗EphB2 APC偶联抗体（1/50），并在冰上孵育30分钟。
6. 用PBS洗涤细胞3次，最后加入7-氨基放线菌素D（7-AAD）（1/100）。
7. 通过 FACS 对 染色细胞进行分选。
   1. 调整面积比例因子，并根据像元大小（前向散射，FSC-A）与粒度（侧向散射，SSC-A）进行排序。
   2. 使用波长为 488 nm 和 50 mV 功率的激光对 7-AAD 阴性和阳性细胞进行活力分类。
   3. 划定门以对EphB2高（EphB2^高），EphB2中（EphB2^med），EphB2低（EphB2低）和EphB2阴性（EphB2^负）细胞进行分类，激光设置为640 nm波长和100 mV功率。
8. 在5%CO₂培养箱中于37°C开始EphB2^高细胞培养。

4. 单细胞培养类器官

1. 根据分级的EphB2表面水平¹¹进行细胞分离方法，然后获得四个不同的群体（高，中，低和阴性）。
2. 收集，在4°C下以390× g 离心3分钟沉淀，并通过移液将单分选的EphB2^高 细胞嵌入ECM中，然后接种在24孔板上（100单线管/ 40μLECM /孔）。
3. 如步骤2.14所示，让ECM聚合，并在前2天用含有Rho相关激酶（ROCK）抑制剂（10μM）的培养基覆盖ECM，以维持EphB2^高 细胞。
   注意：ROCK抑制剂对肛门虫有效。
4. 使用倒置显微镜在40倍放大倍率下手动检查细胞，并观察具有球状体形成和隐窝突出的活类器官。

讨论

该协议描述了一种一致分离小肠隐窝和随后培养3D类器官的方法。为提高隐窝释放速率，建立了EDTA处理后剧烈摇晃的机械分离方法。培养基组成与Sato等人的原始方案^不同7。原始介质相对昂贵。因此，含有药理抑制剂、重组生长因子和/或条件培养基的小鼠小肠类器官的培养基和定制培养基如 表1所示。Wnt3A和 N-乙酰半胱氨酸不包括在本协议的培养基中。当Paneth细胞表达Wnt3时，细胞产生Wnt3并支持ISC维持。此外，在隐窝隔离过程中，不使用条件培养基。类器官模型是动态的，具有细胞和结构异质性（潘氏细胞、肠细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞、簇状细胞和 ISC）。因此，这些类器官可以大规模用于研究类器官生物学的基本问题。

EphB2梯度维持成人小肠中沿隐窝绒毛轴的ISC干性和增殖¹⁸。与分离的隐窝相比，从单个EphB2细胞制造类器官的优势与了解小鼠ISC的生物学有关，因为ISC在各种人类肠道疾病中起着关键作用。单个EphB2高表达ISC可以培养以形成类器官，其方式类似于从单个表达Lgr5的ISC开发类器官。最重要的一步是使用FACS根据隐窝中的EphB2表达将细胞精确地分为四组（EphB2^高，EphB2中^，EphB2^低和EphB2^阴性）。前向散射与侧向散射（FSC 与 SSC）图通常用于根据其大小和粒度识别感兴趣的细胞。FSC 表示单元大小，SSC 与 P0 门中单元的复杂性或粒度相关（图 2A）。在这项工作中，随后分析了落在定义门（P0）内的细胞的活力。接下来，根据7-AAD荧光信号的阴性和阳性群体确定其活力。严格决定7-AAD阴性和阳性细胞之间的边界，以获得阴性细胞，并将阳性细胞污染降至最低。EphB2门大致基于EphB2分级表达式设置。

为了确认这四个组被精确划分，分析了所选基因的mRNA表达。ISC标志物的mRNA水平在EphB2^高细胞²⁰中很高。此外，祖细胞特异性标记物的mRNA水平在EphB2^医学细胞²⁰中相对较高。然而，与EphB2^高和EphB2^医疗细胞2相比，EphB2^低和EphB2^阴性细胞中的EphB2抑制较低或为负²⁰。应采取上述措施，以确保在铺板前富集EphB2^高细胞群。然而，EphB2^高细胞的类器官生长小于6%可能是由于培养过程中干细胞的死亡，而不是隐窝分离期间的剧烈摇晃。已经表明，将选择性Rho相关激酶（ROCK）抑制剂应用于人类胚胎干细胞可显着减少解离诱导的细胞凋亡²²。因此，作为技术变化，值得尝试以更高的浓度和更长的孵育时间添加ROCK抑制剂以提高活性。

ISC旁边的Wnt3A分泌Paneth细胞为ISC提供必要的支持⁸。事实上，与单个ISC相比，ISC-Paneth细胞双联体显示出强烈增加的类器官形成能力8。此外，在培养的前 3 天添加浓度为 100 ng/mL 的 Wnt3A 已被证明可以增加类器官形成能力⁸。因此，作为另一项技术变化，添加外源性Wnt3A可以提高单个EphB2^高表达ISC的类器官形成能力。

与 体内 方法相比，类器官可以很容易地用于遗传操作、恶性肿瘤表型分析和药物筛选^20，23。EDTA螯合法和机械分离方法的组合对于从隐窝中创建小肠类器官是有效、可重复和省时的，并且没有任何高级经验的实验室工作人员可以很容易地遵循。因此，在EDTA处理后加入剧烈振荡的机械分离可以有效地在 体外建立 小鼠小肠类器官，并为其他成人上皮组织的类器官培养和疾病建模提供潜在的工具。

肠上皮细胞极化并定向，顶端侧朝向管腔。然而，面向3D类器官腔的顶端一侧位于其内部。因此，这种组织阻止了对顶端的访问，这在研究管腔成分（如营养物质、微生物和代谢物）对上皮细胞的影响时是一个问题。为了规避这一缺点，已经开发出将类器官细胞培养为2D单层²⁴。就未来的应用而言，将利用类器官细胞单层的培养，因为这代表了最有效和最容易处理的系统。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Eppendorf tube	Eppendorf	0030 125.215
5 mL syringe	TERUMO	SS-05SZ
15 mL Falcon tube	Iwaki	2325-015
20 μm cell strainer	Sysmex	04-004-2325
24-well plate	Iwaki	3820-024
50 mL Falcon tube	Iwaki	2345-050
60 mm tissue culture dish	FALCON	353002
70 μm cell strainer	Falcon	352350
100 mm Petri dish	Iwaki	3020-100
7-AAD	BD Biosciences	559925
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A-11004
Anti-EphB2 APC-conjugated antibody	BD Biosciences	564699
C57BL6/J mice	Japan SLC, Inc.
Clean bench	HITACHI	CCV-1306E
Confocal laser scanning microscope	Olympus	FV3000
EDTA (0.5 mol/L)	Nacalai Tesque	06894-14	2 mM
FACSMelody	BD Life Sciences-Biosciences	661762
Fetal bovine serum	Sigma	173012	1% (v/v)
Fiji (software)	https://fiji.sc/
Gentamicin (10 mg/mL)	Nacalai Tesque	16672-04	25 μg/mL
Hammacher laboratory scissor	SANSYO	91-1538
Incubator	Panasonic	MCO-170-PJ
Laboratory tweezer	AS-ONE	7-164-04
L-Glutamine 200 mM	Gibco	25030081	2 mM
Matrigel	BD Biosciences	354230	ECM for 3D organoids
Mouse Anti-Human Lysozyme	LSBio	LS-B8704-100
Murine EGF (20 μg/mL stock solution)	PeproTech	315-09	20 ng/mL
PBS 1x	Gibco	10010-023
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122	50 U/mL
Pipetman (10 μL, 20 μL, 200 μL, and 1,000 μL)	GILSON	1-6855-12, -13, -15, and -16
Recombinant murine Noggin (20 μg/mL stock solution	R&D Systems	1967-NG-025	100 ng/mL
Recombinant murine R-Spondin 1 (250 μg/mL stock solution)	R&D Systems	3474-RS-050	500 ng/mL
Sorbitol	Nacalai Tesque	32021-95	2% (w/v)
TE2000-S (inverted microscope)	Nikon	24131
Time-lapse image microscope	Olympus	LCV100
TrypLE Express 1x	Gibco	12605-010
ULVAC	ULVAC KIKO Inc.	100073
Y-27632	Fujifilm	331752-47-7	10 μM