小鼠导管相关 白色念珠菌 感染模型

摘要

我们建立了 白色念珠菌相关导管相关感染 （CRI） 的小鼠模型，其中在导管上形成生物膜，白色 念 珠菌与宿主之间的相互作用与临床 CRI 密切相关。该模型有助于筛选白色 念珠菌 生物膜相关CRI的治疗方法，为临床转化奠定基础。

摘要

导管相关感染 （CRI） 是导管植入过程中由 白色念珠菌 引起的常见院内感染。通常，在导管的外表面形成生物膜并导致播散性感染，这对患者来说是致命的。诊所没有有效的预防和治疗管理。因此，迫切需要建立CRI的动物模型，以期临床前筛选其预防和治疗的新策略。在这项研究中，将一根聚乙烯导管（一种广泛使用的医用导管）插入脱毛后 BALB/c 小鼠的背部。 白假丝酵母 随后将表达增强绿色荧光蛋白的ATCC MYA-2876（SC5314）沿导管接种在皮肤表面。3天后，在荧光显微镜下在导管表面观察到强烈的荧光。通过扫描电子显微镜在导管表面发现了成熟而厚的生物膜。这些结果表明白色 念珠菌 在导管表面的粘附、定植和生物膜形成。表皮增生和皮肤标本中炎症细胞浸润表明CRI相关皮肤的组织病理学变化。综上所述，成功建立了小鼠CRI模型。该模型有望有助于白色 念珠菌 相关CRI治疗管理的研究和开发。

引言

近年来，随着生物医学材料的发展和应用，种植体相关感染正在成为临床难题^1,2。随着医用导管在诊所的广泛应用^{，每年相关的}感染和死亡人数都很大^3,4。导管相关感染（CRI）的常见感染途径包括:（1）皮肤表面的病原体浸润到体内并粘附在导管的外表面^5,6,7;（2）无菌操作不当的病原体侵入、粘附和定植在导管上;（3）血液循环中的病原体粘附在导管上并定植;（4）被病原微生物污染的药物。

念珠菌是 CRI ^8,9 的第三大常见原因。在植入物表面形成生物膜后，极有可能引起血流感染和其他危及生命的侵袭性念珠菌病。预后较差，死亡率高²。据报道，在中心静脉插入后2周内在导管表面形成生物膜，几周后在导管腔内形成生物膜^10,11。

在医用导管上形成的白色念珠菌（白色念珠菌）生物膜表现出由酵母、基质和菌丝体组成的双层网络^12,13。 白色念珠菌生物膜的形成不仅是耐药性和免疫逃避^的关键13，而且对产生播散性孢子也至关重要，这会导致进一步的血源性感染^2,12，并导致更严重甚至危及生命的后果。白色念珠菌相关CRI是临床真菌血流感染的主要原因^7,14，^超过40%的中心静脉导管白色念珠菌感染患者会发展为菌血症¹⁵。

根据美国传染病学会的说法，念珠菌 CRI 的推荐治疗方法包括 （1） 拔除受感染的导管;（2）对患者进行14天全身抗真菌治疗⁸;（3） 重新植入新导管⁴.然而，在临床应用中，导管有时无法完全移除。一些患者只能用全身性抗生素和抗菌锁定疗法治疗，并伴有强烈的副作用^16,17。

现有的白色念珠菌动物模型，如口咽念珠菌病模型、阴道念珠菌病模型和念珠菌病引起的侵袭性全身感染模型^18,19 不能很好地与临床 CRI 相关。因此，在这项研究中，建立了小鼠白色念珠菌相关的CRI模型。临床常用的聚乙烯导管被用作皮下植入物^20,21，并将白色念珠菌接种在皮肤表面，以模拟白色念珠菌与医用导管的粘附和生物膜的形成。

该模型已成功用于我们的实验室，以筛选不同疗法的抗生物膜作用²²。此外，由于导管感染后对 白色念珠 菌的滞后检测，构建了一种含有增强绿色荧光蛋白（EGFP）的 白色念 珠菌菌株，并将其接种在小鼠体内，以利于直观观察植入导管上 白色念 珠菌的菌落和生物膜。

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研究方案

实验动物，雄性BALB / c小鼠（12-16g），购自习交通大学医学中心实验动物中心。所有程序均经习交通大学机构动物伦理委员会批准，许可证号为SCXK（陕西）2021-103。

1.缓冲液和设备准备

1. 用高表达质粒 pCaExp 转染 白色念珠菌 菌株。
   1. 从ATCC购买白色念珠菌（SC5314）。通过用含有EGFP基因完整开放阅读框的高表达质粒pCaExp转染白色念珠菌获得EGFP高表达荧光菌^株22（质粒图如图1所示），并将其用于后续实验。
2. 培养转染的 白色念珠菌 菌株。
   1. 从酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基（YPD）板中选择 白色念珠菌 荧光菌株的单克隆菌落，并在5mL YPD液体培养基（YPD + 50μg/ mL羧苄青霉素）中培养过夜（30°C和220rpm）。
   2. 在室温下以400×g离心5分钟后，将白色念珠菌重悬于生理盐水中。
   3. 通过将浊度与0.5McFarland标准品进行比较，将 白色念珠菌 悬浮液的浓度调整为1×10⁸ 个细胞/ mL。
3. 准备手术器械。
   1. 确保将所有手术器械（剪刀、镊子、止血钳、针架、缝合针）在 121°C 下高压灭菌 30 分钟。使用无菌聚乙烯导管（内径:0.28 mm;外径:0.63 mm）。
      注意:本研究中使用的导管用环氧乙烷气体灭菌，并在暴露于紫外线的超洁净台中打开包装超过 30 分钟。在植入小鼠之前，将导管浸入75%乙醇中以防止污染。

2. 小鼠CRI模型的建立

注意:手术过程如 图 2 所示。

1. 在无特定病原体（SPF）条件下使30只BALB / c小鼠（12-16g，雄性）适应，自由获得水和食物，12小时-12小时交替光暗循环。
2. 将30只BALB / c小鼠随机分为三组（n = 10只小鼠/组）:（A）正常对照组;（B）导管组（植入的导管没有 白色念珠菌）;（C） 模型组（植入 白色念珠菌的导管）。
3. 用1-4%异氟醚麻醉小鼠，并将小鼠俯卧位放在手术台上。矫正反射丧失和对脚趾刺激无反应证实了麻醉成功。去除毛发，用三轮交替的碘伏或氯己定和酒精磨砂膏对手术部位进行消毒。
4. 将小鼠留在正常对照组中，无需任何治疗，并免费提供食物和水。
5. 对于导管组和模型组中的小鼠，将麻醉维持在3%异氟醚。通过对脚趾捏合没有反应来确认足够的麻醉深度，并根据需要调整异氟烷浓度。
6. 对于导管组中的小鼠，皮内将1mL无菌注射器针头插入脱毛区域以打孔。取出注射器针头后，将导管（长约 1 厘米）插入孔中。
7. 对于模型组中的小鼠，将20μL 白色念珠 菌悬浮液到背部脱毛区域，以模拟皮肤上的共生 白色念珠菌 。
8. 溶液被皮肤吸收后，按照步骤2.5中描述的相同程序将导管插入脱毛区域。
9. 将另外 20 μL 白色念珠 菌沿导管悬浮液到组织中，以模拟外部环境中的 白色念珠 菌。
10. 用胶带和纱布固定导管，并将小鼠放回笼子中喂食。治疗结束时，连续三天皮下注射美洛昔康（4mg / kg）作为镇痛剂。
    注意:手术后，用水和食物仔细喂食小鼠。每天监测小鼠两次。如果小鼠出现喂养困难、体重显着减轻 （10-20%） 和体温过低，则通过 IACUC 批准的方法对小鼠实施安乐死。

3. CRI模型的评估

1. 3天后，用3%异氟醚麻醉小鼠，并通过宫颈脱位处死它们。从小鼠背部收集导管和皮肤组织样本。
2. 通过扫描电子显微镜观察导管上的白色念珠菌 和生物膜。
   1. 将导管浸入4°C的2.5%戊二醛溶液中48小时。用无菌PBS冲洗导管三次。
   2. 用1%锇酸固定导管3小时，并用无菌PBS冲洗三次。
   3. 在梯度乙醇溶液中以递增浓度（50%、70%、80%、90%和100%，15分钟/梯度）将导管上的细胞脱水。
   4. 将导管浸入叔丁醇中三次（每次30分钟）。
   5. 在液氮中快速冷冻导管，并按照制造商的说明在冷冻干燥机中冷冻干燥样品。
   6. 通过离子束沉积用 10 nm 金溅射涂覆导管样品。
   7. 在扫描电子显微镜下（在高真空，1.5kV条件下）观察每组导管表面存在 白色念珠菌 及其生物膜，并记录每组的图像。
3. 通过荧光显微镜观察导管上的 白色念珠菌 。
   1. 将导管浸入4%多聚甲醛溶液中，在4°C下固定48小时。
   2. 在484nm激发下，用荧光显微镜观察每组导管表面存在 白色念珠菌 及其生物膜，并记录每组的图像。
      注意:放大倍率为 400 倍。 白色念珠菌 的荧光可以在 490 nm 激发和 510 nm 发射时观察到。
4. 观察居住在小鼠皮肤中的 白色念珠菌 。
   1. 将小鼠的背侧皮肤组织浸入4%多聚甲醛溶液中，在4°C固定48小时。
   2. 在浓度递增（50%、70%、80%、90%和100%，15分钟/梯度）的梯度乙醇溶液中脱水背部皮肤组织。
   3. 将脱水的背侧皮肤组织在55-60°C的石蜡中包埋。 注意温度，避免组织变脆。要去除尽可能多的杂质，请重复此步骤三次（每次 30 分钟）。
   4. 用切片机切片背侧皮肤组织（厚度= 5μm）。
   5. 通过将载玻片浸入二甲苯中两次20分钟来对石蜡切片进行脱蜡。
   6. 通过梯度乙醇（无水乙醇，90%乙醇，75%乙醇，水）洗脱切片，每次5分钟。
   7. 将切片浸入高碘酸溶液中15分钟，然后用自来水洗涤一次，蒸馏水洗涤两次，用高碘酸染色切片。
   8. 用人字形染色溶液（根据制造商的说明）在黑暗中染色切片30分钟，然后在流水下冲洗切片5分钟。
   9. 将切片浸入苏木精溶液中3-5分钟，然后分别用流水（2-3分钟），差异化溶液（5-10分钟）和流水洗涤。
   10. 将切片浸入乙醇中三次（每次5分钟）和二甲苯两次（每次5分钟），然后用中性胶密封切片。
   11. 用显微镜观察标本的图像，并分析小鼠皮肤中的 白色念珠菌 残留物。
       注意: 目镜的放大倍率为 10 倍，物镜的放大倍率为 4 倍或 10 倍。
5. 观察背部皮肤组织的组织病理学变化。
   1. 将背侧皮肤组织浸入4%多聚甲醛溶液中，在4°C固定48小时。在梯度乙醇溶液中以递增浓度（50%、70%、80%、90%和100%，15分钟/梯度）对背侧皮肤组织进行脱水。
   2. 如步骤3.4.3所述，将脱水的背侧皮肤组织嵌入石蜡中。
   3. 用切片机切片背侧皮肤组织（厚度= 5mm）。
   4. 通过将载玻片浸入二甲苯中两次20分钟来对石蜡切片进行脱蜡。
   5. 通过梯度乙醇（无水乙醇，90%乙醇，75%乙醇，水）洗脱切片，每次5分钟。
   6. 用苏木精染色切片 4 分钟，然后用自来水冲洗以去除浮色。
   7. 在用流水冲洗载玻片之前，用1%盐酸 - 乙醇溶液区分标本。
   8. 将标本浸入85%和95%乙醇中5分钟，并用曙红溶液染色3分钟。
   9. 将样品浸入梯度乙醇（70%、90%、95%和100%）和二甲苯中各2分钟，使试样脱水。
   10. 用中性树脂密封试样。
   11. 用显微镜观察标本的图像并分析病理变化。

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结果

扫描电镜可以观察到导管上的 白色念珠菌 和生物膜。如 图3²²所示，导管组聚乙烯导管表面光滑，未观察到粘附的病原微生物。然而，在模型组的聚乙烯导管表面可见成熟致密的 白色念 珠菌生物膜，表明在实验条件下， 白色念 珠菌能够在小鼠的导管表面成功定植并形成生物膜。此外，荧光显微镜结果进一步验证了上述结论（

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讨论

CRI 是临床实践中最常见的院内感染之一²³.皮肤附属物中的病原体，如表皮、皮脂腺和毛囊，都是 CRI^23,24 的可能原因。念珠菌是引起CRI的第三大病原体，其中白色念珠菌是最常见的生物膜感染类型^25,26。因此，我们旨在建立白色念珠菌生物膜相关CRI的相关动物模型，以支?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 Mactutrius turbidibris	Shanghai Lujing Technology Co., Ltd	5106063
2.5% glutaraldehyde fixative solution	Xingzhi Biotechnology Co., Ltd	DF015
4 °C refrigerator	Electrolux (China) Electric Co., Ltd	ESE6539TA
Agar	Beijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd	01-023
Analytical balances	Shimadzu	ATX124
Autoclaves Sterilizer	SANYO	MLS-3750
Butanol	Tianjin Chemio Reagent Co., Ltd	200-889-7
Carbenicillin	Amresco	C0885
Eclipse Ci Nikon upright optical microscope	Nikon	Eclipse Ts2-FL
Glucose	Macklin	D823520
Inoculation ring	Thermo Scientific	251586
Isoflurane	RWD	20210103
Paraformaldehyde	Beyotime Biotechnology	P0099
PAS dye kit	Servicebio	G1285
Peptone	Beijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd	01-001
Polyethylene catheter	Shining Plastic Mall	PE100
RWD R550 multi-channel small animal anesthesia machine	RWD	R550
SEM	Hitachi	TM-1000
Temperature incubator	Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd	ZQTY-50N
Ultrapure water water generator	Heal Force	NW20VF
Ultrasound machine	Do-Chrom	DS10260D
Xylene	Sinopharm  Chemical Reagent Co., Ltd	10023428
Yeast extract	Thermo Scientific Oxoid	LP0021B