Modelo de Infecção por Candida albicans Relacionada a Cateter em Camundongos

Resumo

Estabelecemos um modelo murino de infecção relacionada ao cateter (IRC) associada a C.albicans, no qual o biofilme se forma no cateter, e a interação entre C.albicans e hospedeiro correlaciona-se bem com a IRC clínica. Esse modelo ajuda a selecionar terapias para IRC associada ao biofilme de C.albicans , estabelecendo uma base para a transformação clínica.

Resumo

A infecção relacionada ao cateter (IRC) é uma infecção nosocomial comum causada por candida albicans durante o implante do cateter. Tipicamente, biofilmes são formados na superfície externa do cateter e levam a infecções disseminadas, que são fatais para os pacientes. Não há prevenção e manejo de tratamento efetivos nas clínicas. Portanto, é urgente o estabelecimento de um modelo animal de IRC para a triagem pré-clínica de novas estratégias para sua prevenção e tratamento. Neste estudo, um cateter de polietileno, um cateter médico amplamente utilizado, foi inserido no dorso dos camundongos BALB/c após a depilação. Candida albicans ATCC MYA-2876 (SC5314) expressando proteína fluorescente verde reforçada foi subsequentemente inoculado na superfície da pele ao longo do cateter. Intensa fluorescência foi observada na superfície do cateter sob microscópio fluorescente 3 dias depois. Biofilmes maduros e espessos foram encontrados na superfície do cateter por microscopia eletrônica de varredura. Esses resultados indicaram a adesão, colonização e formação de biofilme de candida albicans na superfície do cateter. A hiperplasia da epiderme e a infiltração de células inflamatórias nos espécimes cutâneos indicaram as alterações histopatológicas da pele associada à IRC. Em resumo, um modelo de CRI de camundongo foi estabelecido com sucesso. Espera-se que esse modelo seja útil na pesquisa e desenvolvimento do manejo terapêutico da IRC associada a candida albicans .

Introdução

Nos últimos anos, com o desenvolvimento e aplicação de materiais biomédicos, infecções relacionadas a implantes vêm emergindo como problemas clínicos difíceis ^1,2. Com a ampla aplicação de cateteres médicos em clínicas, o número de infecções e mortes relacionadas é enorme a cada ano ^3,4. As vias de infecção comuns de uma infecção relacionada ao cateter (IRC) incluem: (1) patógenos na superfície da pele infiltram-se no corpo e aderem à superfície externa do cateter ^5,6,7; (2) patógenos derivados de operações assépticas inadequadas invadem, aderem e colonizam o cateter; (3) patógenos na circulação sanguínea aderem e colonizam no cateter; (4) drogas contaminadas por microrganismos patogênicos.

A Candida é a terceira causa mais comum de IRC ^8,9. É muito provável que cause infecção da corrente sanguínea e outras candidíase invasiva com risco de vida depois que biofilmes são formados na superfície do implante. O prognóstico é ruim e a taxa de mortalidade é alta². Relata-se que biofilmes são formados na superfície do cateter dentro de 2 semanas após a inserção venosa central e no lúmen do cateter algumas semanas depois^10,11.

Biofilmes de Candida albicans (C. albicans) formados em cateteres médicos exibem uma rede de dupla camada composta por levedura, estroma e micélio^12,13. A formação de biofilmes de C. albicans não é apenas uma chave para a resistência a drogas e evasão imune¹³, mas também vital para a produção de esporos disseminados, o que leva a uma maior infecção hematogênica ^2,12 e resulta em consequências mais graves e até fatais. A IRC associada a C. albicans é uma importante causa^{de infecções} fúngicas clínicas da corrente ^{sanguínea7,14}, e mais de 40% dos pacientes com infecção por C. albicans no cateter venoso central evoluirão para bacteremia¹⁵.

De acordo com a Infectious Disease Society of America, o tratamento recomendado da Candida CRI inclui (1) remoção do cateter infectado; (2) submeter os pacientes a uma terapia antifúngica sistêmica de 14 dias⁸; (3) reimplante de novo cateter⁴. No entanto, em aplicações clínicas, os cateteres não podem ser totalmente removidos às vezes. Alguns pacientes só podem ser tratados com antibióticos sistêmicos e terapia antimicrobiana de bloqueio, acompanhados de fortes efeitos colaterais^16,17.

Os modelos animais existentes de C. albicans, como o modelo de candidíase orofaríngea, o modelo de candidíase vaginal e o modelo de infecção sistêmica invasiva causada por candidíase18,19, não podem se correlacionar bem com a IRC clínica. Portanto, neste estudo, um modelo de IRC associado a C. albicans em camundongos foi estabelecido. Cateteres de polietileno de uso clínico comum foram utilizados como implantes subcutâneos^20,21, e C. albicans foi inoculado na superfície da pele para simular a adesão de C. albicans aos cateteres médicos e a formação de biofilmes.

Esse modelo tem sido utilizado com sucesso em nosso laboratório para rastrear o efeito anti-biofilme de diferentes^{terapêuticas22}. Além disso, devido à detecção de defasagem de C. albicans após infecção por cateter, uma cepa de C. albicans contendo proteína fluorescente verde reforçada (EGFP) foi construída e inoculada em camundongos para facilitar a observação intuitiva das colônias e biofilmes de C. albicans no cateter implantado.

Protocolo

Os animais experimentais, camundongos BALB/c machos (12-16 g), foram adquiridos no Laboratory Animal Center, Xi'an Jiaotong University Health Science Center. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Ética Animal da Universidade Xi'an Jiaotong com o número de licença SCXK (Shaanxi) 2021-103.

1. Preparação do tampão e do equipamento

1. Transfect cepas de C. albicans com plasmídeo de alta expressão pCaExp.
   1. Compre C. albicans (SC5314) da ATCC. Obter a cepa fluorescente de alta expressão^{EGFP 22} transfectando C. albicans com um plasmídeo de alta expressão pCaExp contendo o quadro completo de leitura aberta do gene EGFP (o mapa do plasmídeo é mostrado na Figura 1) e usá-lo para experimentos subsequentes.
2. Cultura de cepas transfectadas de C. albicans .
   1. Selecionar colônias monoclonais de cepa fluorescente de C. albicans a partir da placa de meio peptona dextrose (YPD) do extrato de levedura e cultura durante a noite (30 °C e 220 rpm) em 5 mL de meio líquido YPD (YPD + 50 μg/mL carbenicilina).
   2. Ressuspender C . albicans em solução salina normal após centrifugação a 400 x g por 5 min no TR.
   3. Ajustar a concentração da suspensão de C. albicans para 1 x 10⁸ células/mL comparando a turbidez ao padrão de McFarland de 0,5.
3. Preparar os instrumentos cirúrgicos.
   1. Certifique-se de autoclavar todos os instrumentos cirúrgicos (tesoura, pinça, pinça hemostática, porta-agulhas, agulhas de sutura) a 121°C por 30 min. São utilizados cateteres estéreis de polietileno (diâmetro interno: 0,28 mm; diâmetro externo: 0,63 mm).
      OBS: Os cateteres utilizados neste estudo foram esterilizados com gás óxido de etileno e a embalagem foi aberta em mesa ultralimpa exposta aos raios UV por mais de 30 min. Antes do implante em camundongos, os cateteres foram imersos em etanol 75% para evitar contaminação.

2. Estabelecimento de um modelo de CRI de rato

OBS: O procedimento cirúrgico é mostrado na Figura 2.

1. Aclimatar 30 camundongos BALB/c (12-16 g, machos) em condições específicas livres de patógenos (FPS) com livre acesso a água e alimento e 12 h-12 h alternando ciclo claro e escuro.
2. Divida aleatoriamente 30 camundongos BALB/c em três grupos (n = 10 camundongos/grupo): (A) grupo controle normal; (B) grupo cateter (cateteres implantados sem C. albicans); (C) Grupo modelo (cateteres implantados com C. albicans).
3. Anestesiar os camundongos com isoflurano a 1-4% e colocá-los em uma mesa cirúrgica em decúbito ventral. A perda do reflexo de retificação e a ausência de resposta à estimulação dos pododáctilos confirmam o sucesso da anestesia. Remover os cabelos e esterilizar o sítio cirúrgico com três rodadas alternadas de iodóforo ou clorexidina e esfoliação com álcool.
4. Deixe os ratos no grupo de controle normal sem qualquer tratamento e forneça acesso livre a comida e água.
5. Para os camundongos dos grupos cateter e modelo, manter a anestesia com isoflurano a 3%. Confirmar a profundidade anestésica adequada pela ausência de resposta ao pinçamento dos dedos e ajustar a concentração de isoflurano conforme necessário.
6. Para os camundongos do grupo cateter, insira por via intradérmica uma agulha de seringa estéril de 1 mL na área depilada de trás para fazer um furo. Insira um cateter (cerca de 1 cm de comprimento) no orifício depois de remover a agulha da seringa.
7. Para os camundongos do grupo modelo, pipetar 20 μL de suspensão de C. albicans na área de retrodepilação para simular o comensal de C. albicans na pele.
8. Após a absorção da solução pela pele, inserir um cateter na área retrodepilada com os mesmos procedimentos descritos no passo 2.5.
9. Pipetar mais 20 μL de suspensão de C. albicans ao longo do cateter para o tecido para simular C. albicans no meio externo.
10. Fixar os cateteres com fita adesiva e gaze e retornar os camundongos às gaiolas para alimentação. Ao final do tratamento, injetar meloxicam (4 mg/kg) por via subcutânea como analgesia por três dias consecutivos.
    NOTA: Após a cirurgia, os camundongos foram cuidadosamente alimentados com água e comida. Os camundongos foram monitorados duas vezes ao dia. Os camundongos foram eutanasiados por um método aprovado pela IACUC se apresentassem dificuldades alimentares, perda de peso significativa (10-20%) e hipotermia.

3. Avaliação do modelo CRI

1. Após 3 dias, anestesiar os camundongos com isoflurano a 3% e sacrificá-los por deslocamento cervical. Coletar os cateteres e amostras de tecido cutâneo da parte de trás dos camundongos.
2. Observar C. albicans e biofilmes no cateter por microscopia eletrônica de varredura.
   1. Imergir os cateteres em solução de glutaraldeído a 2,5% a 4 °C por 48 horas. Enxaguar os cateteres com PBS estéril três vezes.
   2. Fixar os cateteres com ácido ósmico a 1% por 3 h e enxaguar com PBS estéril três vezes.
   3. Desidratar as células dos cateteres em solução de etanol gradiente com concentrações crescentes (50%, 70%, 80%, 90% e 100%, 15 min/gradiente).
   4. Imergir os cateteres em álcool terc-butílico três vezes (30 min cada vez).
   5. Congele rapidamente os cateteres em nitrogênio líquido e liofilize a amostra em um liofilizador de acordo com as instruções do fabricante.
   6. Revestir as amostras do cateter com ouro de 10 nm por deposição de feixe de íons.
   7. Observar a presença de C. albicans e seu biofilme na superfície do cateter de cada grupo em microscópio eletrônico de varredura (em condições de alto vácuo, 1,5 kV) e registrar as imagens em cada grupo.
3. Observar C. albicans no cateter por microscopia de fluorescência.
   1. Imergir os cateteres em solução de paraformaldeído a 4% para fixação a 4 °C por 48 h.
   2. Observar a presença de C. albicans e seu biofilme na superfície do cateter de cada grupo por meio de um microscópio de fluorescência sob excitação de 484 nm e registrar as imagens em cada grupo.
      NOTA: A ampliação é de 400x. A fluorescência de Candida albicans pode ser observada com excitação a 490 nm e emissão a 510 nm.
4. Observar C. albicans residindo na pele de camundongos.
   1. Imergir os tecidos cutâneos dorsais de camundongos em solução de paraformaldeído a 4% para fixação a 4 °C por 48 h.
   2. Desidratar os tecidos dorsais da pele em solução de etanol gradiente com concentrações crescentes (50%, 70%, 80%, 90% e 100%, 15 min/gradiente).
   3. Incorporar os tecidos cutâneos dorsais desidratados em parafina a 55-60 °C. Preste atenção à temperatura para evitar tecidos quebradiços. Para remover o maior número possível de impurezas, repita este passo três vezes (30 min cada).
   4. Seccionar os tecidos dorsais da pele (espessura = 5 μm) com micrótomo.
   5. Desencenar as seções de parafina mergulhando as lâminas em xileno duas vezes por 20 min.
   6. Reidratar os trechos por eluição com etanol gradiente (etanol absoluto, etanol 90%, etanol 75%, água) por 5 min de cada vez.
   7. Manchar as secções com ácido periódico imergindo a secção na solução de ácido periódico durante 15 minutos antes de lavar com água corrente uma vez e água destilada duas vezes.
   8. Manchar as secções com uma solução corante de divisas (de acordo com as instruções do fabricante) durante 30 minutos no escuro e enxaguar as secções em água corrente durante 5 minutos.
   9. Imergir os cortes em solução de hematoxilina por 3-5 min antes de lavar com água corrente (2-3 min), solução diferenciada (5-10 min) e água corrente, respectivamente.
   10. Imergir as seções em etanol três vezes (5 min cada) e xileno duas vezes (5 min cada) antes de selar a seção com goma neutra.
   11. Observe as imagens do espécime com um microscópio e analise os resíduos de C. albicans na pele de camundongos.
       OBS: A ampliação é de 10x para a ocular e 4x ou 10x para a objetiva.
5. Observar as alterações histopatológicas nos tecidos cutâneos dorsais.
   1. Imergir os tecidos cutâneos dorsais em solução de paraformaldeído a 4% para fixação a 4 °C durante 48 horas. Desidratar os tecidos dorsais da pele em solução de etanol gradiente com concentrações crescentes (50%, 70%, 80%, 90% e 100%, 15 min/gradiente).
   2. Incorporar os tecidos cutâneos dorsais desidratados em parafina, conforme descrito no passo 3.4.3.
   3. Seccionar os tecidos dorsais da pele (espessura = 5 mm) com micrótomo.
   4. Desencenar as seções de parafina mergulhando as lâminas em xileno duas vezes por 20 min.
   5. Reidratar os trechos por eluição com etanol gradiente (etanol absoluto, etanol 90%, etanol 75%, água) por 5 min de cada vez.
   6. Manchar os cortes com hematoxilina por 4 min antes de enxaguar com água da torneira para remover a cor da boia.
   7. Diferenciar o espécime com solução de etanol de ácido clorídrico a 1% antes de enxaguar as lâminas com água corrente.
   8. Imergir o espécime em etanol 85% e 95% por 5 min e corá-los com solução de eosina por 3 min.
   9. Desidratar o espécime mergulhando-o em etanol gradiente (70%, 90%, 95% e 100%) e xileno por 2 min cada.
   10. Selar o espécime com resina neutra.
   11. Observe as imagens do espécime com um microscópio e analise as alterações patológicas.

Resultados

A C. albicans e os biofilmes nos cateteres puderam ser observados pela MEV. Como mostrado na Figura 3²², a superfície dos cateteres de polietileno do grupo de cateteres era lisa e nenhum microrganismo patogênico aderido foi observado. Entretanto, biofilmes maduros e densos de C. albicans foram visíveis na superfície dos cateteres de polietileno do grupo modelo, indicando que C. albicans foi capaz de colonizar e formar biofilmes na superf...

Discussão

A IRC é uma das infecções hospitalares mais comuns na prática^clínica23. Patógenos nos anexos cutâneos, como epiderme, glândulas sebáceas e folículos pilosos, são possíveis causas de IRC^23,24. A Candida é o terceiro maior patógeno causador da IRC, sendo a Candida albicans o tipo mais comum de infecção por biofilme^25,26. Portanto, nosso objetivo foi ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 Mactutrius turbidibris	Shanghai Lujing Technology Co., Ltd	5106063
2.5% glutaraldehyde fixative solution	Xingzhi Biotechnology Co., Ltd	DF015
4 °C refrigerator	Electrolux (China) Electric Co., Ltd	ESE6539TA
Agar	Beijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd	01-023
Analytical balances	Shimadzu	ATX124
Autoclaves Sterilizer	SANYO	MLS-3750
Butanol	Tianjin Chemio Reagent Co., Ltd	200-889-7
Carbenicillin	Amresco	C0885
Eclipse Ci Nikon upright optical microscope	Nikon	Eclipse Ts2-FL
Glucose	Macklin	D823520
Inoculation ring	Thermo Scientific	251586
Isoflurane	RWD	20210103
Paraformaldehyde	Beyotime Biotechnology	P0099
PAS dye kit	Servicebio	G1285
Peptone	Beijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd	01-001
Polyethylene catheter	Shining Plastic Mall	PE100
RWD R550 multi-channel small animal anesthesia machine	RWD	R550
SEM	Hitachi	TM-1000
Temperature incubator	Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd	ZQTY-50N
Ultrapure water water generator	Heal Force	NW20VF
Ultrasound machine	Do-Chrom	DS10260D
Xylene	Sinopharm  Chemical Reagent Co., Ltd	10023428
Yeast extract	Thermo Scientific Oxoid	LP0021B