Ein katheterbezogenes Candida albicans-Infektionsmodell in der Maus

Zusammenfassung

Wir etablieren ein Mausmodell der C.albicans-assoziierten katheterassoziierten Infektion (CRI), in dem sich Biofilm auf dem Katheter bildet und die Interaktion zwischen C.albicans und Wirt gut mit der klinischen CRI korreliert. Dieses Modell hilft beim Screening von Therapien für C.albicans-Biofilm-assoziierte CRI und legt damit den Grundstein für die klinische Transformation.

Zusammenfassung

Die katheterassoziierte Infektion (CRI) ist eine häufige nosokomiale Infektion, die durch Candida albicans während der Katheterimplantation verursacht wird. Typischerweise bilden sich Biofilme auf der Außenfläche des Katheters und führen zu disseminierten Infektionen, die für die Patienten tödlich verlaufen. In Kliniken gibt es kein effektives Präventions- und Behandlungsmanagement. Daher ist es dringend erforderlich, ein Tiermodell für CRI für das präklinische Screening neuer Strategien zur Prävention und Behandlung zu etablieren. In dieser Studie wurde ein Polyethylen-Katheter, ein weit verbreiteter medizinischer Katheter, nach der Haarentfernung in den Rücken der BALB/c-Mäuse eingeführt. Candida albicans ATCC MYA-2876 (SC5314), das ein verstärktes grün fluoreszierendes Protein exprimiert, wurde anschließend entlang des Katheters auf der Hautoberfläche inokuliert. 3 Tage später wurde unter einem Fluoreszenzmikroskop eine intensive Fluoreszenz auf der Oberfläche des Katheters beobachtet. Mittels Rasterelektronenmikroskopie wurden reife und dicke Biofilme auf der Oberfläche des Katheters gefunden. Diese Ergebnisse deuten auf die Adhäsion, Besiedlung und Biofilmbildung von Candida albicans auf der Katheteroberfläche hin. Die Hyperplasie der Epidermis und die Infiltration von Entzündungszellen in die Hautproben deuteten auf die histopathologischen Veränderungen der CRI-assoziierten Haut hin. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es gelungen ist, ein Maus-CRI-Modell zu etablieren. Es wird erwartet, dass dieses Modell bei der Erforschung und Entwicklung des therapeutischen Managements für Candida albicans-assoziierte CRI hilfreich sein wird.

Einleitung

In den letzten Jahren haben sich mit der Entwicklung und Anwendung biomedizinischer Materialien implantatbedingte Infektionen als schwierige klinische Probleme herauskristallisiert ^1,2. Mit der breiten Anwendung von medizinischen Kathetern in Kliniken ist die Zahl der damit verbundenen Infektionen und Todesfälle jedes Jahr enorm ^3,4. Zu den häufigsten Infektionswegen einer katheterbedingten Infektion (CRI) gehören: (1) Krankheitserreger auf der Hautoberfläche infiltrieren in den Körper und haften an der Außenfläche des Katheters ^5,6,7; (2) unsachgemäße aseptische Krankheitserreger dringen in den Katheter ein, haften an ihm und besiedeln ihn; (3) Krankheitserreger im Blutkreislauf haften am Katheter und siedeln sich an; (4) Arzneimittel, die mit pathogenen Mikroorganismen kontaminiert sind.

Candida ist der dritthäufigste Grund für CRI ^8,9. Es ist sehr wahrscheinlich, dass es zu einer Blutstrominfektion und anderen lebensbedrohlichen invasiven Candidiasis kommt, nachdem sich Biofilme auf der Oberfläche des Implantats gebildet haben. Die Prognose ist schlecht und die Sterblichkeitsrate hoch². Es wird berichtet, dass sich innerhalb von 2 Wochen nach dem Einführen der Zentralvenen Biofilme auf der Oberfläche des Katheters und einige Wochen später im Lumen des Katheters bilden^10,11.

Candida albicans (C. albicans) Biofilme, die auf medizinischen Kathetern gebildet werden, weisen ein doppelschichtiges Netzwerk aus Hefe, Stroma und Myzel auf^12,13. Die Bildung von Biofilmen von C. albicans ist nicht nur ein Schlüssel für Arzneimittelresistenz und Immunevasion¹³, sondern auch entscheidend für die Produktion von disseminierten Sporen, was zu einer weiteren hämatogenen Infektion^{führt 2,12} und zu schwerwiegenderen und sogar lebensbedrohlichen Folgen führt. C. albicans-assoziierte CRI ist eine der Hauptursachen für klinische Pilzinfektionen^im Blutkreislauf ^7,14, und mehr als 40 % der Patienten mit C. albicans-Infektion im zentralen Venenkatheter entwickeln sich zu einer Bakteriämie¹⁵.

Nach Angaben der Infectious Disease Society of America umfasst die empfohlene Behandlung von Candida CRI (1) die Entfernung des infizierten Katheters; (2) die Patienten einer 14-tägigen systemischen antimykotischen Therapie^{zu unterziehen 8}; (3) Reimplantation eines neuen Katheters⁴. In der klinischen Anwendung können Katheter jedoch manchmal nicht vollständig entfernt werden. Einige Patienten können nur mit systemischen Antibiotika und einer antimikrobiellen Lock-Therapie behandelt werden, die mit starken Nebenwirkungen einhergeht^16,17.

Bestehende Tiermodelle von C. albicans, wie z. B. das oropharyngeale Candidiasis-Modell, das vaginale Candidiasis-Modell und das invasive systemische Infektionsmodell, das durch Candidiasis verursacht wird^18,19, können nicht gut mit dem klinischen CRI korrelieren. Daher wurde in dieser Studie ein C. albicans-assoziiertes CRI-Modell in Mäusen etabliert. Als subkutane Implantate wurden klinisch häufig verwendete Polyethylenkatheter verwendet^20,21, und C. albicans wurden auf die Hautoberfläche inokuliert, um die Adhäsion von C. albicans an den medizinischen Kathetern und die Bildung von Biofilmen zu simulieren.

Dieses Modell wurde in unserem Labor erfolgreich eingesetzt, um die Anti-Biofilm-Wirkung verschiedener Therapeutika zu untersuchen²². Darüber hinaus wurde aufgrund der verzögerten Detektion von C. albicans nach Katheterinfektion ein C. albicans-Stamm mit verstärktem grün fluoreszierendem Protein (EGFP) konstruiert und in Mäusen inokuliert, um die intuitive Beobachtung der Kolonien und Biofilme von C. albicans auf dem implantierten Katheter zu erleichtern.

Protokoll

Die Versuchstiere, männliche BALB/c-Mäuse (12-16 g), wurden vom Laboratory Animal Center des Xi'an Jiaotong University Health Science Center gekauft. Alle Verfahren wurden vom Institutional Animal Ethics Committee der Xi'an Jiaotong University mit der Lizenznummer SCXK (Shaanxi) 2021-103 genehmigt.

1. Vorbereitung des Puffers und der Ausrüstung

1. Transfect C. albicans-Stämme mit einem hochexprimierten Plasmid pCaExp.
   1. Kaufen Sie C. albicans (SC5314) von ATCC. Man erhält den EGFP-Hochexpressions-Fluoreszenzstamm²² durch Transfizierung von C. albicans mit einem Hochexpressionsplasmid pCaExp, das den vollständigen offenen Leserahmen des EGFP-Gens enthält (die Plasmidkarte ist in Abbildung 1 dargestellt), und verwendet diese für nachfolgende Experimente.
2. Kultivierung der transfizierten C. albicans-Stämme .
   1. Wählen Sie monoklonale Kolonien des fluoreszierenden Stamms von C. albicans aus der Platte des Hefeextrakts Pepton-Dextrose-Medium (YPD) aus und kultivieren Sie sie über Nacht (30 °C und 220 U/min) in 5 ml YPD-Flüssigmedium (YPD + 50 μg/ml Carbenicillin).
   2. Resuspendieren Sie die C. albicans in normaler Kochsalzlösung nach Zentrifugation bei 400 x g für 5 min bei RT.
   3. Die Konzentration der C. albicans-Suspension wird auf 1 x 10⁸ Zellen/ml eingestellt, indem die Trübung mit dem McFarland-Standard von 0,5 verglichen wird.
3. Bereiten Sie die chirurgischen Instrumente vor.
   1. Stellen Sie sicher, dass alle chirurgischen Instrumente (Schere, Pinzette, hämostatische Pinzette, Nadelhalter, Nahtnadeln) 30 Minuten lang bei 121 °C autoklaviert werden. Zum Einsatz kommen sterile Polyethylen-Katheter (Innendurchmesser: 0,28 mm; Außendurchmesser: 0,63 mm).
      HINWEIS: Die in dieser Studie verwendeten Katheter wurden mit Ethylenoxidgas sterilisiert und die Verpackung wurde auf einem ultrareinen Tisch geöffnet, der mehr als 30 Minuten lang UV-Strahlen ausgesetzt war. Vor der Implantation in Mäuse wurden die Katheter in 75%iges Ethanol getaucht, um eine Kontamination zu verhindern.

2. Etablierung eines Maus-CRI-Modells

HINWEIS: Das chirurgische Verfahren ist in Abbildung 2 dargestellt.

1. Akklimatisieren Sie 30 BALB/c-Mäuse (12-16 g, männlich) unter spezifisch pathogenfreien (SPF) Bedingungen mit freiem Zugang zu Wasser und Futter und 12 h-12 h abwechselndem Hell- und Dunkelzyklus.
2. 30 BALB/c-Mäuse werden nach dem Zufallsprinzip in drei Gruppen eingeteilt (n = 10 Mäuse/Gruppe): (A) normale Kontrollgruppe; (B) Kathetergruppe (Katheter, die ohne C. albicans implantiert wurden); (C) Modellgruppe (Katheter, die mit C. albicans implantiert wurden).
3. Betäuben Sie die Mäuse mit 1-4% Isofluran und legen Sie die Mäuse in Bauchlage auf einen Operationstisch. Der Verlust des Aufrichtungsreflexes und das Ausbleiben einer Reaktion auf die Zehenstimulation bestätigen die erfolgreiche Anästhesie. Entfernen Sie die Haare und sterilisieren Sie die Operationsstelle mit drei abwechselnden Runden Jodophor- oder Chlorhexidin- und Alkoholpeelings.
4. Lassen Sie die Mäuse ohne Behandlung in der normalen Kontrollgruppe und gewähren Sie freien Zugang zu Futter und Wasser.
5. Bei den Mäusen in der Katheter- und Modellgruppe sollte die Anästhesie bei 3 % Isofluran beibehalten werden. Bestätigen Sie eine ausreichende Anästhesietiefe, indem Sie nicht auf das Einklemmen der Zehen reagieren, und passen Sie die Isoflurankonzentration nach Bedarf an.
6. Bei den Mäusen in der Kathetergruppe wird eine sterile 1-ml-Spritzennadel intradermal in den rückenenthaarten Bereich eingeführt, um ein Loch zu bohren. Führen Sie einen Katheter (ca. 1 cm lang) in das Loch ein, nachdem Sie die Spritzennadel entfernt haben.
7. Bei den Mäusen in der Modellgruppe werden 20 μl C. albicans-Suspension auf den Rückenthaarungsbereich pipettiert, um die kommensale C. albicans auf der Haut zu simulieren.
8. Nachdem die Lösung von der Haut absorbiert wurde, führen Sie einen Katheter in den rückenenthaarten Bereich ein, wobei die gleichen Verfahren wie in Schritt 2.5 beschrieben sind.
9. Pipettieren Sie weitere 20 μl C. albicans-Suspension entlang des Katheters in das Gewebe, um C. albicans in der äußeren Umgebung zu simulieren.
10. Befestigen Sie die Katheter mit Klebeband und Gaze und setzen Sie die Mäuse zur Fütterung in die Käfige zurück. Am Ende der Behandlung injizieren Sie den Mäusen an drei aufeinanderfolgenden Tagen Meloxicam (4 mg/kg) als Analgesie.
    HINWEIS: Nach der Operation wurden die Mäuse vorsichtig mit Wasser und Futter gefüttert. Die Mäuse wurden zweimal täglich überwacht. Mäuse wurden mit einer von der IACUC zugelassenen Methode euthanasiert, wenn sie Schwierigkeiten bei der Fütterung, einen signifikanten Gewichtsverlust (10-20%) und Unterkühlung hatten.

3. Evaluierung des CRI-Modells

1. Nach 3 Tagen werden die Mäuse mit 3% Isofluran betäubt und durch Zervixluxation geopfert. Entnehmen Sie die Katheter und Hautgewebeproben von der Rückseite der Mäuse.
2. Beobachten Sie C. albicans und Biofilme auf dem Katheter mittels Rasterelektronenmikroskopie.
   1. Die Katheter werden 48 h lang bei 4 °C in eine 2,5%ige Glutaraldehydlösung getaucht. Spülen Sie die Katheter dreimal mit sterilem PBS.
   2. Fixieren Sie die Katheter 3 h lang mit 1%iger Osmsäure und spülen Sie sie dreimal mit sterilem PBS.
   3. Dehydrieren Sie die Zellen auf den Kathetern in Gradienten-Ethanollösung mit aufsteigenden Konzentrationen (50 %, 70 %, 80 %, 90 % und 100 %, 15 min/Gradient).
   4. Die Katheter werden dreimal (jeweils 30 min) in tert-Butylalkohol getaucht.
   5. Frieren Sie die Katheter schnell in flüssigem Stickstoff ein und gefriertrocknen Sie die Probe gemäß den Anweisungen des Herstellers in einem Gefriertrockner.
   6. Die Katheterproben werden durch eine Ionenstrahlabscheidung mit einem 10-nm-Gold bestrichen.
   7. Beobachten Sie das Vorhandensein von C. albicans und seinem Biofilm auf der Katheteroberfläche jeder Gruppe unter einem Rasterelektronenmikroskop (unter Hochvakuum, 1,5 kV-Bedingungen) und zeichnen Sie die Bilder in jeder Gruppe auf.
3. Beobachten Sie C. albicans am Katheter mittels Fluoreszenzmikroskopie.
   1. Die Katheter werden 48 Stunden lang bei 4 °C in 4%ige Paraformaldehydlösung zur Fixierung getaucht.
   2. Beobachten Sie das Vorhandensein von C. albicans und seinem Biofilm auf der Katheteroberfläche jeder Gruppe mit einem Fluoreszenzmikroskop unter 484 nm Anregung und zeichnen Sie die Bilder in jeder Gruppe auf.
      HINWEIS: Die Vergrößerung beträgt 400x. Die Fluoreszenz von Candida albicans kann mit Anregung bei 490 nm und Emission bei 510 nm beobachtet werden.
4. Beobachten Sie C. albicans , die sich in der Haut der Maus befinden.
   1. Das dorsale Hautgewebe von Mäusen wird zur Fixierung bei 4 °C 48 h lang in 4%ige Paraformaldehydlösung getaucht.
   2. Dehydrieren Sie das dorsale Hautgewebe in einer Gradienten-Ethanollösung mit aufsteigenden Konzentrationen (50 %, 70 %, 80 %, 90 % und 100 %, 15 min/Gradient).
   3. Betten Sie das dehydrierte dorsale Hautgewebe bei 55-60 °C in Paraffin ein. Achten Sie auf die Temperatur, um sprödes Gewebe zu vermeiden. Um so viele Verunreinigungen wie möglich zu entfernen, wiederholen Sie diesen Schritt dreimal (jeweils 30 min).
   4. Das dorsale Hautgewebe (Dicke = 5 μm) wird mit einem Mikrotom geschnitten.
   5. Entwachsen Sie die Paraffinabschnitte, indem Sie die Objektträger zweimal für 20 Minuten in Xylol tauchen.
   6. Rehydrieren Sie die Abschnitte durch Eluieren mit Gradientenethanol (absolutes Ethanol, 90 % Ethanol, 75 % Ethanol, Wasser) für jeweils 5 Minuten.
   7. Färben Sie die Abschnitte mit Periodensäure, indem Sie die Schnitte 15 Minuten lang in die Periodensäurelösung tauchen, bevor Sie sie einmal mit fließendem Wasser und zweimal mit destilliertem Wasser waschen.
   8. Färben Sie die Abschnitte mit einer Chevron-Färbelösung (gemäß Herstelleranweisung) 30 Minuten lang im Dunkeln und spülen Sie die Abschnitte 5 Minuten lang unter fließendem Wasser ab.
   9. Tauchen Sie die Abschnitte 3-5 Minuten lang in Hämatoxylinlösung, bevor Sie sie mit fließendem Wasser (2-3 Minuten), differenzierter Lösung (5-10 Minuten) bzw. fließendem Wasser waschen.
   10. Tauchen Sie die Abschnitte dreimal (je 5 Minuten) in Ethanol und zweimal (je 5 Minuten) in Xylol, bevor Sie den Abschnitt mit neutralem Gummi versiegeln.
   11. Betrachten Sie die Bilder der Probe mit einem Mikroskop und analysieren Sie die Rückstände von C. albicans in der Haut der Maus.
       HINWEIS: Die Vergrößerung beträgt 10x für das Okular und 4x oder 10x für die Objektivlinse.
5. Beobachten Sie die histopathologischen Veränderungen im dorsalen Hautgewebe.
   1. Das dorsale Hautgewebe wird 48 Stunden lang bei 4 °C in 4%ige Paraformaldehydlösung zur Fixierung getaucht. Dehydrieren Sie das dorsale Hautgewebe in Gradienten-Ethanollösung mit aufsteigenden Konzentrationen (50 %, 70 %, 80 %, 90 % und 100 %, 15 min/Gradient).
   2. Betten Sie das dehydrierte Rückenhautgewebe in Paraffin ein, wie in Schritt 3.4.3 beschrieben.
   3. Das dorsale Hautgewebe (Dicke = 5 mm) wird mit einem Mikrotom durchtrennt.
   4. Entwachsen Sie die Paraffinabschnitte, indem Sie die Objektträger zweimal für 20 Minuten in Xylol tauchen.
   5. Rehydrieren Sie die Abschnitte durch Eluieren mit Gradientenethanol (absolutes Ethanol, 90 % Ethanol, 75 % Ethanol, Wasser) für jeweils 5 Minuten.
   6. Färben Sie die Abschnitte 4 Minuten lang mit Hämatoxylin, bevor Sie sie mit Leitungswasser abspülen, um die Farbe des Schwimmers zu entfernen.
   7. Differenzieren Sie die Probe mit 1%iger Salzsäure-Ethanol-Lösung, bevor Sie die Objektträger mit fließendem Wasser abspülen.
   8. Tauchen Sie die Probe 5 Minuten lang in 85%iges und 95%iges Ethanol und färben Sie sie 3 Minuten lang mit Eosinlösung.
   9. Dehydrieren Sie die Probe, indem Sie sie jeweils 2 Minuten lang in Gradientenethanol (70 %, 90 %, 95 % und 100 %) und Xylol eintauchen.
   10. Versiegeln Sie die Probe mit neutralem Harz.
   11. Betrachten Sie die Bilder der Probe mit einem Mikroskop und analysieren Sie die pathologischen Veränderungen.

Ergebnisse

Die C. albicans und Biofilme auf den Kathetern konnten vom REM beobachtet werden. Wie in Abbildung 3²² gezeigt, war die Oberfläche der Polyethylenkatheter in der Kathetergruppe glatt, und es wurden keine anhaftenden pathogenen Mikroorganismen beobachtet. Auf der Oberfläche der Polyethylenkatheter in der Modellgruppe waren jedoch reife und dichte C. albicans-Biofilme sichtbar, was darauf hindeutet, dass C. albicans unter den experimentellen...

Diskussion

CRI ist eine der häufigsten nosokomialen Infektionen in der klinischen Praxis²³. Krankheitserreger in den Hautanhangsgebilden, wie Epidermis, Talgdrüsen und Haarfollikeln, sind mögliche Ursachen für CRI^23,24. Candida ist der drittgrößte Erreger, der CRI verursacht, wobei Candida albicans die häufigste Form der Biofilminfektion war^25,26. Daher haben wir uns ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 Mactutrius turbidibris	Shanghai Lujing Technology Co., Ltd	5106063
2.5% glutaraldehyde fixative solution	Xingzhi Biotechnology Co., Ltd	DF015
4 °C refrigerator	Electrolux (China) Electric Co., Ltd	ESE6539TA
Agar	Beijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd	01-023
Analytical balances	Shimadzu	ATX124
Autoclaves Sterilizer	SANYO	MLS-3750
Butanol	Tianjin Chemio Reagent Co., Ltd	200-889-7
Carbenicillin	Amresco	C0885
Eclipse Ci Nikon upright optical microscope	Nikon	Eclipse Ts2-FL
Glucose	Macklin	D823520
Inoculation ring	Thermo Scientific	251586
Isoflurane	RWD	20210103
Paraformaldehyde	Beyotime Biotechnology	P0099
PAS dye kit	Servicebio	G1285
Peptone	Beijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd	01-001
Polyethylene catheter	Shining Plastic Mall	PE100
RWD R550 multi-channel small animal anesthesia machine	RWD	R550
SEM	Hitachi	TM-1000
Temperature incubator	Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd	ZQTY-50N
Ultrapure water water generator	Heal Force	NW20VF
Ultrasound machine	Do-Chrom	DS10260D
Xylene	Sinopharm  Chemical Reagent Co., Ltd	10023428
Yeast extract	Thermo Scientific Oxoid	LP0021B