使用 Lifespan 机器进行高通量行为老化和寿命检测

摘要

成像平台“The Lifespan Machine”可自动对大量人群进行终生观察。我们展示了进行寿命、抗逆性、发病机制和行为衰老测定所需的步骤。数据的质量和范围使研究人员能够研究衰老干预措施，尽管存在生物和环境差异。

摘要

在恒定环境中饲养的基因相同的动物显示出广泛的寿命分布，反映了所有研究的生物体中保守的衰老的巨大非遗传，随机方面。这种随机成分意味着，为了了解衰老并确定延长寿命或改善健康的成功干预措施，研究人员必须同时监测大量实验动物。传统的手动死亡评分限制了大规模假设检验所需的通量和规模，从而开发了用于高通量寿命测定的自动化方法。Lifespan Machine （LSM） 是一个高通量成像平台，它将改进的平板扫描仪与定制的图像处理和数据验证软件相结合，用于线虫的终身跟踪。该平台以前所未有的规模，以与经验丰富的研究人员进行的手动分析相当的统计精度和准确性，从大量动物种群中生成高度时间分辨率的寿命数据，这是一项重大的技术进步。最近，LSM得到了进一步发展，以量化衰老过程中观察到的行为和形态变化，并将其与寿命联系起来。在这里，我们将介绍如何使用 LSM 计划、运行和分析自动化生命周期实验。我们进一步强调了成功收集行为数据和高质量生存曲线所需的关键步骤。

引言

衰老是一个复杂的、多方面的过程，其特征是生物体的生理功能下降，随着时间的推移，导致疾病和死亡的风险增加¹.寿命，以从出生或成年开始到死亡的时间来衡量，提供了衰老的明确结果² ，并为衡量人口之间的相对衰老速度提供了一个间接但严格的定量代理³。衰老研究通常依赖于对寿命的准确测量，类似于临床试验，以比较暴露于干预的人群和未暴露的对照组之间的结果。不幸的是，可重复性问题充斥着老化研究，有时是由于统计学上功效不足的实验⁴ ，通常是因为寿命测定对环境细微变化的固有敏感性⁵。稳健的实验需要对大量群体进行多次重复，而这一过程尤其受益于自动化⁶ 提供的实验可扩展性。

寿命测定的严格要求源于老化过程本身的不可预测性。居住在相同环境中的同基因个体表现出不同的死亡时间和生理衰退率⁷，这表明寿命涉及高度的随机性^7,8。因此，需要大量人口来衡量衰老过程中的定量变化，例如平均或最长寿命的变化，并克服因个体变异而产生的偏差。此外，高通量寿命测定的能力对于支持生存曲线形状和衰老动态模型的研究至关重要⁹.

线虫秀丽隐杆线虫因其寿命短、遗传可处理性和快速生成时间而成为衰老研究的宝贵模型，这突显了其适用于高通量衰老和寿命测定。传统上，C.线虫的测量方法是在固体培养基上跟踪大约50-100只动物的同步小种群，并记下个体死亡的时间。随着动物年龄的增长和行动能力的丧失，手动计算死亡时间需要单独刺激动物并检查头部或尾巴的微小运动。这通常是一个繁琐而费力的过程，尽管已经努力加速它10,11,12。重要的是，缓慢的实验管道阻碍了我们对衰老的理解和经过测试的干预措施的有效性的进展。

为了满足老化研究对定量数据的需求，已经开发了许多用于自动化数据收集的技术，包括从微流控室到平板扫描仪的一系列方法13,14,15,16,17,18。LSM 与其他方法的不同之处在于，它对收集高精度和准确的寿命数据进行了广泛的优化，这是通过开发仔细的设备校准协议和广泛的软件套件来实现的，该软件套件允许用户验证、校正和完善自动分析¹³。虽然该软件原则上可以应用于不同的成像模式，但在实践中，大多数用户使用经过修改的平板扫描仪，以便对环境温度和湿度进行微调控制，这些因素因其对寿命的重大影响而至关重要¹⁹。LSM 每 20 分钟拍摄一次线虫图像，间隔从几天到几个月不等，具体取决于环境条件和基因型。与手动测定的数据相比，产生的数据具有更高的时间分辨率，并且收集的图像提供了线虫在整个生命周期中位置的永久视觉记录。使用机器学习方法，死亡时间会自动分配给每个人。这些结果可以使用称为“蠕虫浏览器”的客户端软件快速手动验证。由于其硬件和软件，LSM 可以生成生存曲线，这些曲线在统计学上与经验丰富的研究人员手中的手动死亡评分没有区别，具有减少工作量和提高可扩展性的额外优势¹³。

最新版本的LSM还允许通过收集线虫一生中的形态和行为数据以及每个人的寿命来研究行为衰老。特别是，LSM捕捉了每只动物剧烈运动停止（VMC）的时间，这是一个里程碑，通常用于量化个体的“健康寿命”，而不是其寿命。通过同时收集寿命和行为衰老数据，LSM 支持研究可能对²⁰ 岁衰老的不同表型结果产生不同影响的干预措施。各种宏观上可观察到的表型可用于研究行为衰老，例如身体运动或咽部泵送²¹、组织完整性²² 以及运动速度或刺激诱导的转弯¹⁷。不同衰老表型之间的比较可以支持对衰老过程因果结构的分析。例如，VMC和寿命之间的比较最近被用来表征秀丽隐杆线虫的两种不同的衰老过程²³。

虽然最初是为了测量秀丽隐杆线虫的寿命而开发的，但LSM支持从一系列线虫物种（包括C）收集生存和行为数据。布里格萨，C.热带，C.粳稻，C.brenneri 和 P.太平洋²³.该技术有助于研究生物和环境干预对寿命、抗逆性和病原体抗性的影响，并且可以与实验工具相结合，例如RNA干扰的靶向测定或生长素诱导的蛋白质降解系统。迄今为止，它已在科学文献中广泛用于6,24,25,26,27,28,29,30的广泛应用。

在这里，我们概述了使用琼脂平板进行Lifespan Machine实验的分步方案，从实验设置的初始阶段到结果生存曲线的输出。LSM的一个显着特点是这项工作是高度前置的，这意味着研究人员的大部分时间都花在实验设置上，在很小的程度上，花在图像采集后。在整个实验过程中，数据收集是完全自动化的，使研究人员能够获得“免提”体验。这里描述的步骤在许多不同类型的生存测定中是通用的 - 对寿命、耐热性、氧化应激和发病机制测定执行相同的实验设置。在代表性结果部分，我们讨论了最近发表的手稿中的数据子集，以说明分析管道的有效性，并强调图像分析过程中最重要的步骤²³。

研究方案

1. 软硬件要求

1. 平板扫描仪：原则上，LSM可以使用各种成像设备来实现。有关扫描仪修改和对焦的详细说明，请参见其他网站¹³.LSM 硬件如 补充图 1 所示。
2. 数据分析工具：LSM 软件具有三个交互组件：基于 Linux 的扫描仪控制软件包、基于 Web 浏览器的元数据管理软件包以及 Windows 和 Linux 客户端图像分析软件包。请参阅安装 GitHub 存储库 （https://github.com/nstroustrup/lifespan） 上发布的软件工具的说明。
3. 数据可视化和验证软件：使用客户端程序蠕虫浏览器来安排实验，验证图像分析，对线虫运动进行手动注释，并输出存活数据。为 Windows 7、Windows 8 和 Windows 10 上的蠕虫浏览器提供了二进制可执行文件，蠕虫浏览器是从 Linux 或 Apple iOS 上的源代码编译而来的。上面提到的 GitHub 存储库上提供了安装指南。

补充图 1：Lifespan Machine 硬件。 一个带有打开盖子的平板扫描仪单元，用于显示加载的板，这些板面朝下放置在橡胶垫上切割的 16 个开口中。橡胶垫放置在玻璃扫描仪的表面上。条件的标签写在板的侧面，以避免在图像分析过程中出现问题。在胶带上标记设备编号（“1”）和/或名称（“Jabba”）有助于以后在使用多个扫描仪设备时验证样品位置。有关 LSM 硬件组件的更多详细信息，请参见其他部分¹³。 请点击此处下载此文件。

2. 在实验日之前进行设置

1. 培养箱温度校准：环境温度是 C的主要决定因素。 线虫 寿命¹⁹.为了产生准确的结果，请在仔细校准的温度下进行图像采集，并在整个实验过程中保持恒定。为此，在实验开始前几天，在操作过程中测量和校准每个扫描仪表面的温度。使用高精度热电偶，如其他地方^{所述 31} （参见 材料表）。
2. 扫描板布局：在实验开始之前，为每个扫描仪规划培养板的最佳布局。
   注意：这样做的目的是避免引入因扫描仪之间和每个扫描仪表面的温度变化而导致的混杂因素。扫描仪的平均表面温度略有不同，此外，其表面也表现出细微的温度偏差³¹。
   1. 扫描板位置：为了在随后的数据分析中控制这些热效应，请随机化有关扫描仪位置的任何生物协变量，并标准化所有扫描仪的板位置。
   2. 扫描仪上的样品数量：使用 16 个橡胶垫布局（参见 材料表）时，每个扫描仪中每个条件放置四个板，总共至少四个扫描仪。这确保了每个条件分布在多个扫描仪上，从而可以在数据分析过程中识别和消除扫描仪温度的混杂效应¹³。为了使这种分析更简单，在每个扫描仪上都包括一个共享的参考条件（例如，野生型样品）。
      注意： 一般来说，由于扫描仪风扇的位置，橡胶垫右上角的板更容易干燥。如果需要，请将此位置留空。
3. 板和样品制备
   1. 培养板的倾倒：为了使扫描仪培养板达到最佳干燥状态（参见 材料表），在加载线虫前 4 天倒入琼脂培养基。虽然扫描仪的焦距是可调节的，以允许将不同体积的琼脂添加到平板中，但标准平板体积为 8 mL。
      注意：用蠕动泵倒入板可能会有所帮助，特别是对于大型实验。
   2. 培养皿的播种：在实验开始前至少2天用所需的细菌培养物播种培养皿，以使细菌草坪适当干燥和生长。通常，200 μL 细菌培养物足以形成一个草坪，该草坪将喂养 40 条线虫数周。
      注意：通常用于成像的板比标准培养皿密封得更严密;因此，建议在实验室罩内播种和干燥板，通常约1小时或直到适当干燥。
4. 线虫处理
   1. 种群规模：可以在单个平板上可靠成像的线虫数量取决于基因型、线虫铺板的年龄以及添加到每个平板中的食物量。对于从成年早期开始的寿命实验，每个盘子装载大约 40 只动物。这个数字确保了充足的食物并避免了拥挤。
   2. 不断增长的大量种群：要为种群扩张和同步做准备，请从适合所选同步方法的线虫种群开始（见下文）。目标是在最大产蛋年龄对动物进行同步，对于野生型 N2 动物来说，这是成年^{期 32} 的第 2 天。
      注意：在成年后的第二天使用动物来同步种群的另一个原因是消除母体年龄作为种群异质性的一个促成因素。 C中的产妇年龄。 秀丽隐杆线虫 已被证明会影响后代的多种适应性状，第 2 天野生型动物产生“最优质”的后代³³。
   3. 进行年龄同步：为了获得准确的结果，请尽可能精确地同步动物的年龄。在该方案中，使用改良的次氯酸盐处理³⁴进行年龄同步。其他方法可能包括通过产卵、L1 幼虫停滞或手动挑选 L4 幼虫进行同步。
      注意：对于通过次氯酸盐处理的年龄同步，期望从每个成年雌雄同体中获得三到四个卵。
   4. 维持无后代种群：通过将 L4 晚期的线虫暴露于 5-氟-2'-脱氧尿苷 （FUdR） ³⁵ 来维持无后代种群。
      注意：在低剂量下，FuDR对发育中的胚胎是致命的，而不会对生殖系产生宏观可见的变化或改变卵母细胞的产生速率。其他方法包括使用温度无菌突变体，使用灭菌RNAi构建体，或者只是等到生殖后衰老将线虫转移到平板上进行成像。
   5. 转移种群：当在板之间转移数千只动物时，涉及铂/铱线的标准协议变得费力。涉及线虫液体悬浮液的方法促进了转移并使其更有效率。用M9 + Mg缓冲液（Na₂HPO₄ 42.27 mM，KH₂PO₄ 22.05 mM，NaCl 85.56 mM，MgSO₄ 1 mM）收集线虫，一旦线虫在重力作用下沉降，减少总体积，然后快速将线虫转移到用于成像的平板上。
      注意：通过液体悬浮液转移线虫可能会导致转移到每个平板的动物数量发生变化。尽量与每个平板上的线虫数量保持一致，以避免实验变异。
   6. 应用干预措施：在实验期间停止和重新启动图像采集会使图像分析复杂化（参见讨论）。因此，只有在完成所有必要的线虫处理后才开始LSM实验。
5. 对橡胶垫进行消毒：通过用铝箔单独包裹大量橡胶垫，同时对大量垫子进行高压灭菌。
   注意： 橡胶垫应在两次使用之间消毒，以避免真菌或细菌污染物的积聚。通常使用的大多数类型的橡胶都经过激进的乙醇处理降解。

3.实验当天设置

1. 印版支撑和扫描仪玻璃制备：为了简化印版处理，不要将培养皿直接装载到扫描仪表面上，而是使用由玻璃板支撑的橡胶垫将它们固定到位（参见 材料表）。通过这种玻璃对种群进行成像，因此请保持玻璃清洁并用防雾、疏水和消毒涂层处理（参见 材料表）。
   1. 在将板装入培养箱之前，请用防雾玻璃清洁剂清洁板支撑玻璃两侧的表面。
   2. 在将板装载到其支撑玻璃上之前，请进行保护性疏水玻璃处理（参见 材料表），以尽量减少玻璃侧面将与橡胶垫接触的雾化。将这种处理充分传播，并将其放在玻璃上5-10分钟，然后再进行下一步。使用后用力清洁以去除任何残留物。
   3. 涂抹 70% 乙醇对将与橡胶毡接触的玻璃表面进行消毒。静置 1 分钟或 2 分钟，然后用布或纸巾擦拭。
2. 将印版装载到扫描仪上
   1. 首先，将高压灭菌的橡胶垫放在处理过的板支撑玻璃的顶部。
   2. 从用于对加载线虫进行成像的板上取下盖子，并将它们放在面向玻璃表面的橡胶垫位置。确保橡胶垫在所有板周围紧密密封，例如，在顶部添加另一块玻璃板并确保其平放或敲击每个板的顶部（松动的板会轻微移动并撞击玻璃，发出声音，而紧紧固定的板在敲击时不会移动）。
      注意：用标记胶带单独标记每片板支撑玻璃并提供有关板内容和预期扫描仪的信息是很有用的。这些数据可以在实验后用于解决有关板位置的任何潜在歧义。
   3. 在将孔板装入扫描仪之前，请拔下扫描仪风扇的插头，以在装孔板过程中保护实验者的手指。
   4. 轻轻地将印版和支撑它们的玻璃板滑到扫描仪的表面上。
      注意： 避免直接对橡胶垫施加压力，因为这会导致垫子滑过板支撑玻璃。当垫子滑动时，板通常会从垫子上松动。
   5. 重新激活扫描仪风扇，并目视确认正面和侧面风扇已通电。如果扫描仪已关闭电源，请此时将其打开。

4. 预图像采集

注： 图 1 描述了一个全面的流程图，总结了图像采集过程中所有基于软件的步骤。

图 1：Lifespan Machine 映像分析管道的图形概述。 图像采集前、中和后图像采集步骤主要在 Web 界面（WI，红色）和 Worm Browser（WB，绿色）上执行。某些步骤在其他平台（O，蓝色）中执行，例如步骤 3a 中的 TXT 文档、步骤 4b 中的 Photoshop 或等效文档以及步骤 13 中的 JMP 或等效步骤。 请点击这里查看此图的较大版本.

1. 图像采集设置：生成一个文件，指定实验时间表和每个扫描仪上孔板的位置，以配置图像采集。
   注意：此文件包含重要的元数据，例如实验标题、图像捕获频率和实验的总持续时间。通常，不会生成此文件 de novo 但对于每个实验，而是将以前实验中的实验文件重用为模板。对于用户的第一个实验，将提供模板文件 （补充文件1).
   1. 请求预览捕获：提供每台扫描仪上所有板的位置。提供了几种工具来加快此过程。首先，使用扫描仪获取整个扫描仪表面的图像，称为“预览捕获”。确保预览捕获图像清楚地显示要成像的每个板的整个表面（图2A），没有条纹或板边缘的裁剪。
      1. 使用 Web 界面，找到主页的“图像采集”部分，然后点击名为“捕获设备和图像服务器”的链接。在该页面上，单击“图像捕获和处理服务器”框中标有“搜索新设备（即扫描仪）”的按钮。通过单击服务器旁边的 [log] 链接来监控服务器检测扫描仪的进度。
         注意：在执行此步骤之前，请确保所需的扫描仪已“打开”并插入服务器。
      2. 在 Web 界面的同一页面上，确保连接到服务器的每个扫描仪都显示在“ 图像捕获设备 ”框中。如果成功检测到设备，则不再显示“当前状态”下的“缺失”标签。选中与包含新加载板的每个扫描仪相对应的复选框。
      3. 在 “图像捕获设备 ”部分的底部，单击 “请求预览捕获 ”按钮。在 1 分钟或 2 分钟内，扫描仪应亮起并开始扫描。
         注意： 必须经常调整玻璃支撑板的初始位置，以使所有板进入可视范围。可以通过检查预览捕获图像并调整板位置并重新获取新的预览捕获图像来校正位置。如果扫描进行得非常缓慢（一次捕获扫描需要几分钟），或者预览捕获图像包含长长的白色条纹，则表明印版、橡胶垫或其他物体阻挡了扫描仪校准区域内的光线（由扫描仪表面上的白色箭头表示）。所有物体都应重新定位，以便只有玻璃支撑玻璃占据该区域。
   2. 定义扫描区域：按照蠕虫浏览器上的后续步骤分析预览捕获图像，并将它们组合成单个复合图像，该图像用于指定数据分析的每个板的位置。确保生成的图像与 图 2B 类似。
      1. 首先，使用蠕虫浏览器，通过选择 菜单选项“文件”>“打开图像”打开每个预览捕获图像，然后选择所需的图像。
      2. 在每张图像上，单击以选择带有板的区域的列（如果橡胶垫有 16 个板位置，请选择 4 列）。
         注意：扫描区域应指定为高列（而不是宽行），因为扫描仪捕获较宽区域的速度较慢，导致线虫移动导致图像模糊。
      3. 定义所有图像后，通过选择 菜单项“图像采集”>“定义扫描区域”>“将所选扫描区域保存到磁盘 ”并选择所需位置，将区域规格导出到磁盘。
   3. 生成实验计划：
      1. 按照 补充文件 1 的格式，组装一个包含实验名称、扫描仪上每列的物理位置（从步骤 4.1.2.3 中生成的扫描区域文件复制）、实验的总持续时间和图像捕获频率的文件，并将其保存为 TXT 和 XML 文件。
      2. 然后，在蠕虫浏览器上，单击“ 图像采集”>“提交实验计划”，然后选择生成的 XML 文件。蠕虫浏览器将询问是输出计划摘要还是运行实验。单击 “生成摘要文件”。
   4. 验证摘要文件：提交实验计划后，蠕虫浏览器将输出计划的摘要。此摘要显示在屏幕上并写入磁盘。阅读它，并验证计划捕获的日期，以及扫描仪的位置、名称和数量。
   5. 提交实验计划：对摘要文件感到满意后，通过选择 菜单选项“图像采集”>“提交实验计划”，再次将实验计划的 XML 文件加载到 Worm 浏览器中。蠕虫浏览器将再次提示是输出计划摘要还是运行实验。这一次，点击 “运行！
      注意：提交实验几分钟后，明智的做法是使用 Web 界面确认实验已成功提交，并且所有扫描仪正在收集扫描。通常会错过前几次扫描，尤其是在大型实验中。
   6. 在 Web 界面上组织实验：繁忙的扫描仪集群可以生成由许多不同用户收集的数百个实验数据集。若要组织此列表，请将实验分配给单独的组，例如，与负责实验的用户的名称相对应。
      1. 创建新组或修改现有组：在 Web 界面上，单击名为“图像采集”框下的“管理实验组”，创建新组。在将出现的新页面上，在“创建新组”上添加所需的名称，然后单击“创建”。若要修改现有组的名称，请在同一框中，选择“修改现有组”旁边的所需组，然后选择“修改”。
      2. 将实验分配给组：要将新实验分配给特定组，请转到 Web 界面，然后找到所需的实验，默认情况下，该实验将分配给实验列表底部的 “无组 ”组。点击实验部分右侧显示 “编辑”的链接，然后使用下拉列表选择要使用的组的名称。然后，选择 “保存”。
   7. 取消实验：
      注意：LSM 将继续自主工作，直到在实验计划中指定最终扫描。默认情况下，实验计划完成后，LSM 将继续收集扫描，但会立即丢弃图像数据，这个过程称为 自动扫描。执行这些自动扫描是为了防止扫描仪关闭和冷却，并保持标准温度曲线，以便在同一空间（但来自不同实验）中运行的任何其他实验不受其他扫描仪关闭的影响。
      1. 停止自动扫描：要在 Web 界面上停止正在进行的实验的自动扫描，请单击所需实验旁边的 “编辑 ”，然后单击“ 取消待处理的扫描”，然后选择 “取消计划捕获”。

图 2：预览捕获图像和扫描区域选择。 （A） 对于实验中的每个扫描仪，都会生成一个预览捕获图像。 （B） 一次选择一排板（红框），这提高了扫描速度，并防止了由于扫描区域太宽而导致的蠕虫运动模糊。 请点击这里查看此图的较大版本.

5. 图像采集

注意：以下步骤可以在实验运行期间或实验完成后执行。

1. 输出实验的掩码文件：来自扫描仪的原始图像数据包含许多不需要处理的区域（板外的区域）。为了将分析重点放在每个扫描板上，需要创建一个“掩模”，指定每个扫描仪上每个板所占的区域。通过将每个印版的位置绘制为扫描仪收集的图像的叠加层来生成此掩模。
   1. 使用蠕虫浏览器，通过选择 “文件”>“选择当前实验”来选择所需的实验，然后单击实验名称。
   2. 再次在蠕虫浏览器上，选择 “图像采集”>“定义样品掩码”>“生成实验掩码复合”，然后将掩码保存在所需位置。确保生成的文件与 图 3A 类似。

图 3：使用样品掩模的每台扫描仪的孔板位置规格。 为确保 对图1所示色谱柱选择中的板进行独立分析，必须通过生成图像掩模复合来识别单个板。（A） 使用图像处理软件打开扫描仪扫描的捕获（注意扫描选择上方的扫描仪名称“han”，“a-d”表示每列）。（B） 在掩模合成中标记每个印版位置的蒙版生成各个步骤需要将背景设置为黑色，（C） 通过扩大和缩小背景来去除未选定印版的锯齿状边缘和边缘，以及 （D） 选择前景印版并用白色像素完全填充区域。 （E为了使 LSM 识别扫描行中的单个板，行中的每个白色区域都填充了不同深浅的灰色，通常亮度增加。（F） 在此阶段，将保存蒙版（如果在 Photoshop 中生成，则不指定图层的 LZW 压缩）。然后，蠕虫浏览器扫描掩码，并由软件生成掩码的可视化。正确的蒙版可视化应为每个板显示一个定义的正方形，中间有一个小十字，每行的颜色不同。 请点击这里查看此图的较大版本.

2. 注释实验的蒙版：使用图像处理程序（如 Photoshop 或 GIMP）打开在上一步中生成的文件，以标记图像中每个印版的位置。下面概述了使用 Photoshop 进行的所有蒙版编辑步骤。
   1. 在 Photoshop 中，选择“ 填充 ”工具，其中容差设置为零，选择连续选项，取消选择抗锯齿。单击灰色背景将其完全设置为黑色。确保生成的图像与 图 3B 类似。
   2. 使用魔棒工具选择黑色背景，将锯齿设置为关闭，将容差设置为零，并选择连续选项。要平滑边缘，请单击 “选择”>“修改”>“展开”，将所选背景扩展 30 像素。然后，在 “选择”>“修改合同”上将选择缩小 20 像素>。确保生成的图像与 图 3C 类似。
   3. 使用黑色像素完全填充平滑背景，例如，通过将 填充 工具容差设置为 255 并填充所选区域。然后，单击 “选择>反 转”以反转选择，然后选择前景。完全用白色像素填充新区域，例如，将填充工具公差设置为 255 并用白色填充该区域。确保生成的图像与 图 3D 相似。
   4. 要将每个板分隔在一个区域内，请用不同的灰色渐变填充每行，以增加亮度。这可以通过“填充”工具完成，然后通过选择所需的颜色，公差设置为 0。确保生成的图像与 图 3E 类似。将其保存在未指定“层”的 LZW 压缩中。
      注意： 印版的顺序由指定区域的颜色设置。要按从上到下的顺序命名铭牌 1-4，请指定每行亮度递增的颜色。
   5. 在蠕虫浏览器上，选择 “图像采集”>“定义样品掩模”>分析在实验掩模复合材料上绘制的孔板位置，然后选择在上一步中生成的文件。该软件现在需要一些时间来分析提交的掩码。
   6. 蠕虫浏览器将显示一个蒙版可视化。检查掩码中是否存在文件中的潜在错误。确保每行板都填充不同的颜色，并用彩色矩形勾勒轮廓。确保生成的图像与 图 3F 类似。
      注意：如果一个板显示两个或更多圆圈，或者如果两个圆圈共享相同的颜色，请返回步骤 5.2 更正掩码文件，然后再次将其加载到 Worm 浏览器中。
   7. 验证掩模可视化是否正确后，在蠕虫浏览器上，选择 “图像采集”>“定义样品掩码”>“将分析的实验掩码复合提交到聚类”。图像分析服务器现在将分析实验中所有板的位置。
3. 应用掩模：LSM 使用掩模将原始图像数据拆分为单独的印版。若要启动此过程，请使用 Web 界面计划掩码应用程序作业。
   1. 在提交作业之前，请验证所有扫描仪是否都已识别出掩码中的区域。转到 Web 界面的主页，找到实验的名称和名为 “图像分析”的列，然后单击 “运行分析”。验证 “实验示例 ”下的所有设备是否都标识了区域。
   2. 要应用掩码，请在同一界面上单击“ 所有样本的新作业”。在名为 “为单个图像计划作业”的框中，选中 “应用蒙版”框，然后选择 “保存作业”框。
      注意：蒙版将应用于所有已捕获的图像，以及将来捕获的任何图像。
4. 执行孔板质量控制：
   注意：在图像分析的这个阶段，遭受污染、干燥或起雾的印版会被删失。 图 4 显示了污染、干燥、雾化和最佳板的示例。审查的其他原因包括饥饿、空盘子或不育种群中的幼虫。无效的板通常包含复杂的形状，机器旨在将其解释为线虫。在此步骤中排除无效的板非常重要，以防止在图像分析的后续步骤中处理时间过长。
   1. 使用 Web 界面，通过查找所需的实验和名为 “注释板信息 ”的列并选择 “按图像”来排除要删失的板。
   2. 要检查印版，请单击 显示图像。
      注意：如果显示图像的步骤无法正常工作，则 Linux 服务器可能未正确配置。有关如何执行此操作的说明，请参阅上述 GitHub 存储库中的软件安装指南。
   3. 要排除印版，请选中标记 “审查员”框，在名为 “原因审查”的下拉框中选择一个选项，然后单击 “保存”为每个页面。
5. 添加元数据信息：元数据描述实验中每个板的内容。然后，该信息将包含在随后生成的所有统计数据文件中。
   1. 要添加与菌株、基因型、温度、食物等相关的元数据信息，请转到 Web 界面的主页，找到所需的实验和名为 “注释板信息”的列，然后选择 “按位置”。
   2. 输入标签，然后单击左下角的 “保存到设备 ”，选择要保存元数据的扫描仪。
   3. 要在不同扫描仪之间重复使用元数据而无需再次重新输入所有标签，请转到右上角的 “从设备加载 ”，选择要从中重复使用元数据的扫描仪，然后单击 “从设备加载”。
6. 指定“零年龄”时间：默认情况下，LSM 测量与 UNIX 纪元开始相关的时间。这很少方便，因此需要指定参考时间（例如，所有个体孵化或成年的日期）。
   1. 要指定零年龄时间信息，请转到 Web 界面的主页，找到所需的实验和名为 “图像分析”的列，然后选择 “运行分析”。
   2. 在显示的新页面上，选择 “所有区域的新作业”。在名为 “更新区域信息”的框中，选择“ 动物年龄为 0 的时间”，添加信息，然后单击 “更新所选字段”。
      注意：如果所有动物的零年龄时间不同，请改为 选择“特定动物类型的新作业”，然后对每个组重复上述步骤。
7. 安排蠕虫检测：LSM 可以根据每个线虫在板上的位置自动检测。
   1. 要开始自动检测每个图像的线虫，请转到 Web 界面的主页，找到所需的实验和名为 “图像分析”的列，然后选择 “运行分析”。
   2. 在将显示的新页面上，单击“ 所有区域的新作业”，然后单击名为 “为单个映像计划作业”的框，然后选中“ 中值筛选器”>“阈值”>“蠕虫检测”>“保存作业”框。这些作业将应用于所有过去和未来捕获的图像。
      注意：要仅针对特定菌株或病症安排作业，请改为单击 “特定动物类型的作业”。对象分类是使用 SVM 模型执行的，这些模型被指定为存储在 LSM 长期存储目录的 Models 子文件夹中的文件。LSM 的 V2.0 线虫检测参数集可以从 GitHub 存储库下载。

图 4：使用 Web 界面进行孔板质量控制。 在蜗杆运动分析之前，在 Web 界面上对次优板进行删失对于加快图像处理流程至关重要。需要移除的板的示例包括 （A） 干燥、（B） 污染或 （C） 雾化的情况，如对立。（D） 进一步分析中应包括的最佳板。10 mm 的比例尺叠加到预览捕获图像上。 请点击这里查看此图的较大版本.

6. 图像采集

注意：蠕虫检测完成后，必须随着时间的推移汇总从实验中收集的所有数据，以跟踪每个人的整个生命周期并确定所有个体的死亡时间。等到实验中的所有动物都死亡，并且所有蠕虫检测作业都完成，然后执行以下步骤：

1. 安排运动分析：
   1. 运动分析整合了随时间推移的所有实验数据，以估计死亡时间。要开始此作业，请转到 Web 界面的主页，然后在名为 “图像分析”的列中找到所需的实验。选择 链接“运行分析”。
   2. 在显示的新页面上，单击“ 所有区域的新作业”链接，然后从下拉菜单“ 为整个区域计划作业”中，选择 “分析蠕虫移动”，然后单击 “保存作业”按钮。
   3. LSM 图像采集服务器将自动开始分析所有板的运动。
      注意：运动分析是最大的一项工作。在现代多核处理器上，从长达 1 个月的寿命实验中分析每个板可能需要 20 分钟或更长时间。
2. 生成故事板：运动分析完成后，LSM 故事板允许用户手动验证自动结果，并确保软件对线虫形态和行为做出正确的假设。
   1. 在 Web 界面的主页上，找到所需的实验和名为 “图像分析”的列，然后选择 “运行分析”。在显示的新页面上，单击“ 新建实验作业”。然后，在 “为整个区域计划作业”部分中，选择 “生成动物情节提要”，然后单击 “保存作业”。
   2. LSM 生成完情节提要后，转到 Worm Browser，然后选择所需的实验。返回主菜单，选择 “验证”>“浏览整个实验”>“在每只蠕虫死亡后立即进行。
3. 在 Worm 浏览器上注释情节提要：Worm 浏览器上的典型情节提要应如下所示 图5.
   1. 注释“非蠕虫”对象
      注意：在移动过程中检测到的每个物体都会显示在情节提要上，按估计的死亡时间排序。除非用户另有说明，否则每个对象都将包含在生成的生存曲线中。LSM 对象分类经过有意校准为具有较高的假阳性率，作为最大程度地减少未检测到的线虫数量的权衡。排除非蠕虫对象对于获得高质量的存活曲线很重要（见代表性结果）。在情节提要的第一页和最后一页上通常会找到大量非蠕虫对象，这些对象可以快速手动批量排除。
      1. 要排除情节提要上的非蠕虫对象，请在对象的图像上单击鼠标右键一次。排除的对象现在将由一个白框勾勒出轮廓。要同时排除多个对象，请按住 Control 键，然后右键单击任何对象一次，情节提要页面上的所有对象都将被排除。
      2. 从分析中排除对象后，可以通过再次右键单击两次来重新包含该对象。
      3. 要保存在情节提要注释期间所做的注释，请单击“ 保存 ”按钮。建议在注释时经常保存进度。
   2. 注释死亡时间：
      注意：在没有用户干预的情况下，LSM可以准确估计大多数人群的死亡时间。但是，建议通过手动验证每个实验中的随机个体子集来定期确认自动结果的准确性。应格外注意寿命最短和最长寿的个体，因为自动分析中的任何错误都倾向于聚集在这些群体中。
      1. 在情节提要的任何对象上单击鼠标左键一次，即可打开一个新窗口，该窗口显示有关该对象的详细时间序列信息。该窗口允许检查在整个实验过程中收集的物体的所有图像，以及对物体的运动动力学和形态进行量化。使用相同的界面，手动注释死亡时间。死亡时间注释的界面如 图 6 所示。
      2. 要手动注释死亡时间，请左键单击与死亡时间对应的点的底部栏。使用空格键和键盘的向右或向左箭头在时间范围内移动，或在所需的时间范围内直接单击该按钮。
         注意：可视化表示动物随时间推移的运动状态，就像带有 x 轴标记时间的水平条形图一样。粉色/紫色部分表示物体剧烈移动的时间段，黄色表示微弱运动，红色表示不移动的动物，绿色表示与死亡相关的膨胀期。线虫表现出与死亡相关的特征性形态事件：通常在死亡前逐渐发生身体收缩，然后在死亡期间或死亡后立即快速扩张（图6B）。非蠕虫物体（如灰尘或阴影）在体型上不会显示这些动态，相反，通常随着时间的推移，尺寸和强度会线性、逐渐变化。这些不同的体型动态为快速分类和手动排除提供了一种快速直接的方法。
      3. 根据分析方法的不同，死亡时间可以被视为运动停止的时间（运动可视化中红色条的开始）或与死亡相关的扩展时间（运动可视化中的绿色条）。要手动注释收缩和膨胀事件，请在所需时间范围内右键单击底部栏。
   3. 一些基本的死亡率数据可视化是在 Worm Browser 客户端中原生提供的。故事板中显示了每个人群的生存曲线和死亡时间诊断（图7）。请参阅左侧的生存曲线和散点图，将剧烈运动停止 （VMC） 的时间与故事板右侧的每个人的死亡时间进行比较。
      注意：可以通过在底部栏上针对特定菌株、扫描仪或板等条件进行子设置，根据不同的实验参数对这些结果进行分组。通过左键单击 VMC 与死亡时间图中的各个点，可以根据其死亡时间选择单个蠕虫。
4. 将死亡率数据写入磁盘：LSM 以 CSV 文件的形式生成死亡率数据。绘制输出的生存曲线，并在任何统计软件（如 R、SAS、STATA 或 JMP）上进行分析。
   1. 要生成这些文件，请在 Worm Browser 上选择实验，然后在菜单上选择 Data Files、Death Times，然后单击 Generate Death Times for Current Experiment。LSM 将生成一个包含实验生存数据的输出文件，该文件将保存在结果目录中。
   2. 如果在情节提要上执行了手动注释，则 Worm 浏览器上将出现一个提示，询问如何处理手动注释。单击“立即”以在输出的死亡时间文件上包含手动注释。
      注意：死亡率数据文件将写入imageserver.ini文件中指定的结果目录。编写了各种文件，但最常用的版本是“survival_simple/survival=machine_hand”，其中包括使用情节提要制作的所有手动注释。
   3. 在选择的统计软件中分析死亡率数据。

图 5：蠕虫浏览器上的动物故事板。 （A） 所有静止的蠕虫都按机器注释的死亡时间的时间顺序显示。要浏览情节提要，请按右下角的 （B） 按钮，然后 （C） 经常保存注释。（D） 非灰色背景的图像描绘了两次蠕虫死亡事件（早期死亡为绿色，后来死亡为红色），这些事件可能发生在两条蠕虫彼此靠近死亡时，或者当死蠕虫被经过的蠕虫移动并因此被检测为死亡两次时。 （E） 图像下角的红色标签标识了检测到死亡时间的蠕虫;（F） 绿色标签表示物体没有保持静止足够长的时间以记录死亡时间。 （G） 可以通过按 shift 键和左键单击来标记同一帧中的多个蠕虫。（H） 通过右键单击将非蠕虫对象排除在分析之外。（I） 通过单击相应的图像（打开手动注释窗口）并按 shift 键并右键单击直到出现“动物爆炸”消息，从分析中删去爆炸的蠕虫。 0.5 mm 的比例尺和标签叠加在 Worm Browser 窗口的屏幕截图上。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 6：在 Worm 浏览器上检查对象和注释死亡时间。 左键单击 Worm Browser 情节提要上的任何对象将打开一个新界面，并允许用户检查对象的运动动态。右侧显示（A）运动分数，量化物体运动;这是通过连续观测之间的像素强度变化来估计的。此外，在右侧，（B）显示总物体强度的变化，它量化了物体大小的变化。在左侧，上栏显示 （C） 机器对死亡时间的估计，而底部栏是 （D） 人类手动注释。单击条形图的任意点并按空格键允许用户在蠕虫成像的时间范围内移动。在这些条形图上，粉红色代表剧烈运动所花费的时间，红色代表死亡所花费的时间，黄色代表介于两者之间的一切。死亡时间后扩张和收缩所花费的时间以绿色显示。标签叠加在“蠕虫浏览器”窗口的屏幕截图上。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 7：蠕虫浏览器上的总体汇总统计信息。 扫描仪设备“obiwan”的人口统计数据，包括生存图（左图）和剧烈运动停止 （VMC） 时间与死亡时间（右图）的散点图。图是 （A） 一种情况的详细信息，从 （B） 通过首先选择 （C） 按菌株进行生存分组而实现的一台扫描仪获得。（D） 散点图中的方形表示手工注释的事件，而 （E） 圆形表示机器注释的事件。（F） 对于早期发生的死亡事件或 （G） 剧烈运动停止时间与死亡时间重合的事件，通常需要手动注释。标签叠加在“蠕虫浏览器”窗口的屏幕截图上。 请点击这里查看此图的较大版本.

结果

寿命测定的实验重现性具有挑战性，需要严格控制的实验条件和大量人群才能达到足够的统计分辨率 ^4,36。LSM特别适用于在恒定环境中以高时间分辨率调查大量动物。为了展示LSM的能力，突出分析的关键步骤，并帮助研究人员确定其劳动工作的优先级，我们提出了来自先前发表的最佳实验²³的数据子集。由于该实验作为剂量反应测定的?...

讨论

在这里，我们提供了一个详细的、可访问的协议，用于使用最新版本的 Lifespan Machine 执行实验。我们已经证明，实现良好分辨率的生存曲线的关键步骤是在图像采集后手动排除非蠕虫物体。手动死亡时间注释对生存曲线的整体形状影响很小，这表明即使没有手动注释，全自动死亡时间估计也是有效的（图8）。相反，获取高质量的行为衰老数据需要更仔细地注释死亡时间，尤...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Naphtaleneacetic  acid (Auxin)	Sigma	N0640	Solubilize Auxin in 1M potassium hydroxide and add into molten agar
5-fluoro-2-deoxyuridine (FUDR)	Sigma	F0503	27.5 μg/mL of FUDR was used to eliminate progeny from populations on UV-inactivated bacteria
Glass cleaner	Kristal-M	QB-KRISTAL-M125ml
Hydrophobic anti-fog glass treatment	Rain-X Scheibenreiniger	C. 059140
Rubber matt	Local crafstman		Cut on a high-strength EPDM rubber sheet stock
Scanner glass	Local hardware supplier		9" x 11.5" inch glass sheet
Scanner plates	Life Sciences	351006	50 mm x 9 mm, polystyrene petri dish
USB Reference Thermometer	USB Brando	ULIFE055500	For calibrating temperature of scanners