Hochdurchsatz-Behavioralitäts- und Lifespan-Assays mit der Lifespan Machine

Zusammenfassung

Die Bildgebungsplattform "The Lifespan Machine" automatisiert die lebenslange Beobachtung großer Populationen. Wir zeigen die Schritte, die erforderlich sind, um Lebensdauer-, Stressresistenz-, Pathogenese- und Verhaltensalterungstests durchzuführen. Die Qualität und der Umfang der Daten ermöglichen es den Forschern, Interventionen beim Altern trotz des Vorhandenseins biologischer und umweltbedingter Variationen zu untersuchen.

Zusammenfassung

Genetisch identische Tiere, die in einer konstanten Umgebung gehalten werden, weisen eine breite Verteilung der Lebensspanne auf, was einen großen nicht-genetischen, stochastischen Aspekt des Alterns widerspiegelt, der in allen untersuchten Organismen konserviert ist. Diese stochastische Komponente bedeutet, dass Forscher große Populationen von Versuchstieren gleichzeitig überwachen müssen, um das Altern zu verstehen und erfolgreiche Interventionen zu identifizieren, die die Lebensdauer verlängern oder die Gesundheit verbessern. Die herkömmliche manuelle Sterbebewertung begrenzt den Durchsatz und die Skalierung, die für groß angelegte Hypothesentests erforderlich sind, was zur Entwicklung automatisierter Methoden für Hochdurchsatz-Lebensdauer-Assays führt. Die Lifespan Machine (LSM) ist eine Hochdurchsatz-Bildgebungsplattform, die modifizierte Flachbettscanner mit kundenspezifischer Bildverarbeitungs- und Datenvalidierungssoftware für die lebenslange Verfolgung von Nematoden kombiniert. Die Plattform stellt einen großen technischen Fortschritt dar, indem sie hochgradig zeitlich aufgelöste Lebensspannendaten von großen Tierpopulationen in einem noch nie dagewesenen Umfang und mit einer statistischen Präzision und Genauigkeit generiert, die manuellen Assays von erfahrenen Forschern entspricht. In jüngster Zeit wurde das LSM weiterentwickelt, um die während des Alterns beobachteten Verhaltens- und morphologischen Veränderungen zu quantifizieren und sie mit der Lebensspanne in Beziehung zu setzen. Hier beschreiben wir, wie ein automatisiertes Lebensdauerexperiment mit dem LSM geplant, durchgeführt und analysiert wird. Darüber hinaus heben wir die kritischen Schritte hervor, die für die erfolgreiche Erhebung von Verhaltensdaten und qualitativ hochwertigen Überlebenskurven erforderlich sind.

Einleitung

Das Altern ist ein komplexer, vielschichtiger Prozess, der durch eine Abnahme der physiologischen Funktion eines Organismus gekennzeichnet ist, was im Laufe der Zeit zu einem Anstieg des Krankheits- und Sterberisikos führt¹. Die Lebensspanne, gemessen als die Zeit von der Geburt oder dem Beginn des Erwachsenenalters bis zum Tod, liefert ein eindeutiges Ergebnis des Alterns² und einen indirekten, aber streng quantitativen Proxy für die Messung der relativen Alterungsrate zwischen Populationen³. Alternsstudien beruhen oft auf genauen Messungen der Lebensspanne, ähnlich wie bei klinischen Studien, um....

Protokoll

1. Software- und Hardwareanforderungen

1. Flachbettscanner: Prinzipiell kann der LSM mit einer Vielzahl von bildgebenden Geräten realisiert werden. Detaillierte Anweisungen für Scanner-Modifikationen und Fokussierung finden Sie an anderer Stelle¹³. Die LSM-Hardware ist in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt.
2. Datenanalyse-Tools: Die LSM-Software besteht aus drei interagierenden Komponenten: einem Linux-basierten Softwarepaket für die Scannersteuerung, einem Webbrowser-basierten Metadaten-Management-Paket und einem Windows- und Linux-Client-Bildanalyse-Softwarepaket. Weitere Informationen fin....

Diskussion

Hier stellen wir ein detailliertes, zugängliches Protokoll für die Durchführung eines Experiments mit der neuesten Version der Lifespan Machine zur Verfügung. Wir haben gezeigt, dass der entscheidende Schritt für das Erreichen gut aufgelöster Überlebenskurven der manuelle Ausschluss von Nicht-Wurm-Objekten während der Post-Bild-Aufnahme ist. Die manuelle Sterbezeit-Annotation hat einen geringen Einfluss auf die Gesamtform der Überlebenskurven und zeigt, dass die vollautomatische Sterbezeit-Schätzung auch ohne m.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Naphtaleneacetic  acid (Auxin)	Sigma	N0640	Solubilize Auxin in 1M potassium hydroxide and add into molten agar
5-fluoro-2-deoxyuridine (FUDR)	Sigma	F0503	27.5 μg/mL of FUDR was used to eliminate progeny from populations on UV-inactivated bacteria
Glass cleaner	Kristal-M	QB-KRISTAL-M125ml
Hydrophobic anti-fog glass treatment	Rain-X Scheibenreiniger	C. 059140
Rubber matt	Local crafstman		Cut on a high-strength EPDM rubber sheet stock
Scanner glass	Local hardware supplier		9" x 11.5" inch glass sheet
Scanner plates	Life Sciences	351006	50 mm x 9 mm, polystyrene petri dish
USB Reference Thermometer	USB Brando	ULIFE055500	For calibrating temperature of scanners