מבחני הזדקנות ותוחלת חיים התנהגותיים בעלי תפוקה גבוהה באמצעות מכונת תוחלת החיים

Summary

פלטפורמת ההדמיה "מכונת תוחלת החיים" הופכת את התצפית לכל החיים על אוכלוסיות גדולות לאוטומטית. אנו מראים את השלבים הנדרשים לביצוע בדיקות תוחלת חיים, עמידות ללחץ, פתוגנזה והזדקנות התנהגותית. איכות והיקף הנתונים מאפשרים לחוקרים לחקור התערבויות בהזדקנות למרות נוכחות שונות ביולוגית וסביבתית.

Abstract

בעלי חיים זהים גנטית המוחזקים בסביבה קבועה מציגים תפוצה רחבה של תוחלת חיים, המשקפת היבט גדול לא גנטי, סטוכסטי להזדקנות הנשמר בכל האורגניזמים שנחקרו. מרכיב סטוכסטי זה אומר שכדי להבין את ההזדקנות ולזהות התערבויות מוצלחות שמאריכות את תוחלת החיים או משפרות את הבריאות, החוקרים חייבים לעקוב אחר אוכלוסיות גדולות של חיות ניסוי בו זמנית. ניקוד מוות ידני מסורתי מגביל את התפוקה ואת קנה המידה הדרושים לבדיקת השערות בקנה מידה גדול, מה שמוביל לפיתוח שיטות אוטומטיות לבדיקות תוחלת חיים בעלות תפוקה גבוהה. מכונת תוחלת החיים (LSM) היא פלטפורמת הדמיה בעלת תפוקה גבוהה המשלבת סורקים שטוחים שעברו שינוי עם עיבוד תמונה מותאם אישית ותוכנת אימות נתונים למעקב לכל החיים אחר נמטודות. הפלטפורמה מהווה התקדמות טכנית משמעותית על ידי הפקת נתוני תוחלת חיים זמניים ביותר מאוכלוסיות גדולות של בעלי חיים בקנה מידה חסר תקדים ובדיוק סטטיסטי שווה ערך לבדיקות ידניות המבוצעות על ידי חוקרים מנוסים. לאחרונה, LSM פותח עוד יותר כדי לכמת את השינויים ההתנהגותיים והמורפולוגיים שנצפו במהלך ההזדקנות ולקשר אותם לתוחלת החיים. במאמר זה אנו מתארים כיצד לתכנן, להריץ ולנתח ניסוי אוטומטי של תוחלת חיים באמצעות ה-LSM. אנו מדגישים עוד יותר את השלבים הקריטיים הנדרשים לאיסוף מוצלח של נתונים התנהגותיים ועקומות הישרדות באיכות גבוהה.

Introduction

הזדקנות היא תהליך מורכב, רב פנים המאופיין בירידה בתפקוד הפיזיולוגי של אורגניזם, מה שמוביל לעלייה בסיכון למחלות ומוות לאורך זמן¹. תוחלת החיים, הנמדדת כזמן מהלידה או תחילת הבגרות ועד המוות, מספקת תוצאה חד משמעית של הזדקנות² וייצוג כמותי עקיף אך קפדני למדידת קצב ההזדקנות היחסי בין אוכלוסיות³. מחקרי הזדקנות מסתמכים לעתים קרובות על מדידות מדויקות של תוחלת החיים, בדומה לניסויים קליניים, כדי להשוות תוצאות בין אוכלוסייה אחת שנחשפה להתערבות לבין קבוצת ביקורת שלא נחשפה. לרוע המזל, בעיות של שכפול נפוצות בחקר ההזדקנות, לפעמים בגלל ניסויים^{סטטיסטיים 4} ולעתים קרובות בגלל הרגישות המובנית של מבחני תוחלת החיים לשינויים עדינים בסביבה⁵. ניסויים חזקים דורשים שכפולים מרובים של אוכלוסיות גדולות, ותהליך זה נהנה במיוחד מהמדרגיות הניסויית שמציעה אוטומציה⁶.

הדרישות המחמירות של מבחני תוחלת החיים נובעות מחוסר היכולת לחזות את תהליך ההזדקנות עצמו. אנשים איזוגניים השוכנים בסביבות זהות מציגים זמני תמותה שונים ושיעורי ירידה פיזיולוגית^{שונים 7}, דבר המצביע על כך שתוחלת החיים כרוכה ברמה גבוהה של סטוכסטיות ^7,8. לכן, אוכלוסיות גדולות נדרשות למדוד שינויים כמותיים בתהליך ההזדקנות, כגון שינויים בתוחלת החיים הממוצעת או המרבית, ולהתגבר על הטיות הנובעות משונות הפרט. בנוסף, יכולת למבחני תוחלת חיים בתפוקה גבוהה חיונית לתמיכה במחקרים של צורות עקומת הישרדות ומודלים של הדינמיקה של הזדקנות⁹.

הנמטודה Caenorhabditis elegans היא מודל רב ערך לחקר ההזדקנות בשל תוחלת החיים הקצרה שלה, הגמישות הגנטית וזמן הייצור המהיר שלה, המדגישים את התאמתו למבחני הזדקנות ותוחלת חיים בעלי תפוקה גבוהה. באופן מסורתי, תוחלת החיים ב-C. אלגנס נמדד על ידי מעקב אחר אוכלוסייה קטנה ומסונכרנת של כ-50-100 בעלי חיים לאורך זמן על מדיה מוצקה וכתיבת זמן המוות של יחידים. ככל שבעלי חיים מזדקנים ומאבדים ניידות, ניקוד ידני של זמני המוות דורש דרבון פרטני של בעלי החיים ובדיקת תנועות קטנות של הראש או הזנב. זהו בדרך כלל תהליך מייגע ומייגע, אם כי נעשו מאמצים להאיץ אותו 10,11,12. חשוב לציין, צינורות ניסיוניים איטיים מעכבים את ההתקדמות בהבנתנו את ההזדקנות ואת יעילותן של התערבויות בדוקות.

כדי לענות על הדרישות של מחקר הזדקנות לנתונים כמותיים, פותחו טכנולוגיות רבות לאוטומציה של איסוף נתונים, כולל מגוון יוצא דופן של גישות החל מתאים מיקרופלואידים לסורקים שטוחים 13,14,15,16,17,18. ה-LSM שונה משיטות אחרות באופטימיזציה הנרחבת שלו לאיסוף נתוני תוחלת חיים מדויקים ומדויקים ביותר, המושגת באמצעות פיתוח פרוטוקולי כיול ציוד זהירים בשילוב עם חבילת תוכנה נרחבת המאפשרת למשתמשים לאמת, לתקן ולשכלל ניתוחים אוטומטיים¹³. למרות שהתוכנה יכולה, באופן עקרוני, להיות מיושמת על שיטות הדמיה מגוונות, בפועל, רוב המשתמשים משתמשים בסורקים שטוחים שהותאמו כדי לאפשר שליטה מכווננת על הטמפרטורה והלחות הסביבתית - גורמים בעלי חשיבות קריטית בשל השפעתם העיקרית על תוחלת החיים¹⁹. ה-LSM מצלם תמונות של נמטודות כל 20 דקות במרווחי זמן הנעים בין ימים לחודשים, בהתאם לתנאי הסביבה והגנוטיפ. הנתונים המופקים הם ברזולוציה טמפורלית גבוהה בהרבה בהשוואה לנתונים מבדיקות ידניות, והתמונות שנאספו מספקות תיעוד חזותי קבוע של מיקום הנמטודות לאורך תוחלת החיים. באמצעות שיטות למידת מכונה, זמני המוות מוקצים באופן אוטומטי לכל אדם. תוצאות אלה ניתנות לאימות ידני מהיר באמצעות תוכנת לקוח בשם "דפדפן תולעת". כתוצאה מהחומרה והתוכנה שלו, ה-LSM יכול ליצור עקומות הישרדות שמבחינה סטטיסטית לא ניתן להבחין ביניהן לבין ניקוד מוות ידני בידי חוקרים מנוסים, עם יתרון נוסף של עומס עבודה מופחת ומדרגיות גבוהה יותר¹³.

הגרסה האחרונה של LSM מאפשרת גם לחקור הזדקנות התנהגותית על ידי איסוף נתונים מורפולוגיים והתנהגותיים לאורך חיי הנמטודה ודיווח עליהם יחד עם תוחלת החיים של כל אדם. בפרט, ה-LSM לוכד את הזמן של הפסקת התנועה הנמרצת של כל בעל חיים (VMC), ציון דרך המשמש לעתים קרובות לכימות "תוחלת הבריאות" של הפרט להבדיל מתוחלת החיים שלו. על ידי איסוף בו זמנית של נתוני תוחלת חיים והזדקנות התנהגותית, LSM תומך במחקר של התערבויות שעשויות להיות השפעות דיפרנציאליות על תוצאות פנוטיפיות שונות של הזדקנות²⁰. ניתן להשתמש במגוון פנוטיפים הניתנים לצפייה מקרוסקופית כדי לחקור הזדקנות התנהגותית, כגון תנועת גוף או שאיבת הלוע²¹, שלמות רקמות²², ומהירות תנועה או פנייה הנגרמת על ידי גירוי¹⁷. השוואות בין פנוטיפים שונים של הזדקנות יכולות לתמוך בניתוח המבנה הסיבתי של תהליכי הזדקנות. לדוגמה, ההשוואה בין VMC לבין תוחלת החיים שימשה לאחרונה כדי לאפיין שני תהליכי הזדקנות שונים ב- C. elegans²³.

בעוד שה-LSM פותח במקור כדי למדוד את תוחלת החיים של C. elegans, הוא תומך באיסוף נתוני הישרדות והתנהגות ממגוון מיני נמטודות, כולל C. בריגסה, ג. טרופיקליס, ג. japonica, C. ברנרי, ופ. פסיפיקוס²³. הטכנולוגיה מאפשרת לחקור את ההשפעה של התערבויות ביולוגיות וסביבתיות על תוחלת החיים, עמידות לעקה ועמידות לפתוגנים, וניתן להצמיד אותה לכלים ניסיוניים כגון בדיקות ממוקדות של הפרעות RNA או מערכות פירוק חלבונים המושרות על ידי אוקסין. עד כה, הוא שימש בספרות המדעית למגוון רחב של יישומים 6,24,25,26,27,28,29,30.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול שלב אחר שלב לביצוע ניסוי מכונת תוחלת חיים באמצעות לוחות אגר, מהשלבים הראשונים של מערך הניסוי ועד לפלט של עקומות ההישרדות המתקבלות. מאפיין ייחודי של ה-LSM הוא שהמאמץ הוא מאוד פרונטלי, כלומר רוב זמנו של החוקר מושקע במהלך הקמת הניסוי, ובמידה מועטה, במהלך רכישת התמונה שלאחר מכן. איסוף הנתונים הוא אוטומטי לחלוטין לכל אורך הניסוי ומאפשר לחוקר חוויה "ללא ידיים". השלבים המתוארים כאן משותפים בין סוגים רבים ושונים של מבחני הישרדות - אותו מערך ניסויי מבוצע עבור תוחלת חיים, סובלנות תרמית, עקה חמצונית ומבחני פתוגנזה. בחלק התוצאות המייצגות, אנו דנים בתת-קבוצה של נתונים מכתב יד שפורסם לאחרונה כדי להמחיש את האפקטיביות של צינור הניתוח ולהדגיש את השלבים החשובים ביותר במהלך ניתוח תמונה²³.

Protocol

1. דרישות תוכנה וחומרה

1. סורקים שטוחים: באופן עקרוני, ניתן ליישם את ה-LSM באמצעות מגוון מכשירי הדמיה. הוראות מפורטות לשינויים ומיקוד בסורק זמינות במקומות אחרים¹³. חומרת LSM מוצגת באיור משלים 1.
2. כלי ניתוח נתונים: תוכנת LSM כוללת שלושה רכיבים המקיימים אינטראקציה: חבילת תוכנת בקרת סורק מבוססת לינוקס, חבילת ניהול מטה-נתונים מבוססת דפדפן אינטרנט וחבילת תוכנה לניתוח תמונות לקוח Windows ו-Linux. עיין בהוראות להתקנת כלי תוכנה שפורסמו במאגר GitHub (https://github.com/nstroustrup/lifespan).
3. תוכנה להדמיית נתונים ותיקוף: השתמש בדפדפן התולעת, תוכנית לקוח, כדי לתזמן את הניסויים, לאמת את ניתוח התמונה, לבצע ביאור ידני של תנועת הנמטודות ולהפיק את נתוני ההישרדות. קבצי הפעלה בינאריים מסופקים עבור דפדפן התולעת ב- Windows 7, Windows 8 ו- Windows 10, ודפדפן התולעת מורכב מקוד המקור ב- Linux או ב- iOS של Apple. מדריך התקנה זמין במאגר GitHub שהוזכר לעיל.

איור משלים 1: חומרת Lifespan Machine. יחידת סורק שטוחה אחת עם מכסה פתוח כדי להראות את הלוחות הטעונים, אשר ממוקמים עם הפנים כלפי מטה לתוך 16 פתחים חתוכים על שטיחון גומי. שטיחון הגומי מונח על פני השטח של סורק זכוכית. תוויות עבור התנאים נכתבות בצידי הלוחות כדי למנוע בעיות במהלך ניתוח התמונה. סימון סרט עם המספר ("1") ו/או שם ההתקן ("Jabba") מאפשר אימות מאוחר יותר של מיקום הדגימה בעת עבודה עם התקני סורקים מרובים. פרטים נוספים על רכיבי החומרה של LSM נמצאים במקום אחר¹³. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

2. הכנה לפני יום הניסוי

1. כיול הטמפרטורה של האינקובטור: טמפרטורת הסביבה היא גורם מכריע עיקרי של C. תוחלת החיים של אלגנס ¹⁹. כדי להפיק תוצאות מדויקות, בצע רכישת תמונה בטמפרטורה מכויילת בקפידה, שתישמר קבועה לאורך כל הניסוי. כדי להשיג זאת, כמה ימים לפני תחילת הניסוי, למדוד ולכייל את הטמפרטורה של פני השטח של כל סורק במהלך הפעולה. השתמש בזוגות תרמיים בדיוק גבוה כמתואר במקום אחר³¹ (ראה טבלת חומרים).
2. פריסת לוחות סורק: לפני תחילת הניסוי, תכנן את הפריסה האופטימלית של לוחות התרבות עבור כל סורק.
   הערה: המטרה של זה היא למנוע הכנסת גורמים מבלבלים הנובעים משינויי טמפרטורה בין הסורקים ועל פני השטח של כל סורק. סורקים נבדלים זה מזה בעדינות בטמפרטורת פני השטח הממוצעת שלהם, ויתר על כן, מציגים הטיות טמפרטורה עדינות על פני השטח שלהם³¹.
   1. מיקום לוחית סורק: כדי לשלוט בהשפעות תרמיות אלה בניתוח הנתונים הבא, בצע אקראיות של כל משתנים ביולוגיים הנוגעים למיקום הסורק, ותקנן את מיקום הלוח בכל הסורקים.
   2. מספר הדגימות בכל הסורקים: בעת שימוש בפריסה של 16 שטיחוני גומי (ראה טבלת חומרים), מקם ארבע לוחות בכל מצב בכל סורק, ובסך הכל לפחות ארבעה סורקים. זה מבטיח שכל תנאי מפוזר על פני סורקים מרובים, כך שניתן לזהות ולהסיר את ההשפעות המבלבלות של טמפרטורת הסורק במהלך ניתוח נתונים¹³. כדי להפוך ניתוח זה לפשוט יותר, כלול תנאי ייחוס משותף (לדוגמה, דגימות מסוג פראי) בכל סורק.
      הערה: באופן כללי, בשל מיקום מאווררי הסורק, הלוחות בפינה הימנית העליונה של שטיחון הגומי מועדים יותר להתייבשות. השאר מיקום זה ריק במידת הצורך.
3. צלחות והכנת דוגמאות
   1. יציקת צלחות התרבית: לייבוש אופטימלי של צלחות תרבית הסורק (ראו טבלת החומרים), יוצקים אגר מדיום 4 ימים לפני העמסת הנמטודות. למרות שמוקד הסורק מתכוונן כדי לאפשר הוספת נפחים שונים של אגר לצלחות, נפח הצלחת הסטנדרטי הוא 8 מ"ל.
      הערה: זה עשוי להיות מועיל לשפוך את הצלחות עם משאבה פריסטלטית, במיוחד עבור ניסויים גדולים.
   2. זריעת הצלחות: זרעו את הצלחות בתרבית החיידקים הרצויה לפחות יומיים לפני תחילת הניסוי כדי לאפשר ייבוש וצמיחה תקינים של דשא החיידקים. בדרך כלל, 200 מיקרוליטר של תרבית חיידקים מספיקים כדי ליצור דשא שיאכיל 40 נמטודות במשך מספר שבועות.
      הערה: הצלחות המשמשות בדרך כלל להדמיה אטומות יותר מצלחות פטרי סטנדרטיות בתרבית; לכן, מומלץ לזרוע ולייבש את הצלחות בתוך מכסה מנוע מעבדה, בדרך כלל במשך כשעה או עד לייבוש כראוי.
4. טיפול בנמטודות
   1. גודל האוכלוסייה: מספר הנמטודות שניתן לצלם באופן אמין על צלחת אחת תלוי בגנוטיפ, בגיל שבו מצופים נמטודות ובכמות המזון שמתווספת לכל צלחת. לניסויים בתוחלת חיים שמתחילים בבגרות המוקדמת, יש להעמיס כ-40 בעלי חיים בכל צלחת. מספר זה מבטיח מספיק מזון ומונע צפיפות.
   2. גידול אוכלוסיות גדולות: כדי להיערך להתרחבות וסנכרון האוכלוסייה, יש להתחיל באוכלוסיית נמטודות המתאימה לשיטת הסנכרון שנבחרה (ראו להלן). המטרה היא לבצע סנכרון על בעלי החיים בגיל ייצור הביצים המקסימלי שלהם, אשר עבור חיות בר מסוג N2 הוא היום השני של הבגרות³².
      הערה: סיבה נוספת לסנכרן אוכלוסיות באמצעות בעלי חיים ביום השני לבגרותם היא להסיר את גיל האם כגורם תורם להטרוגניות האוכלוסייה. גיל האם ב-C. הוכח כי אלגנס משפיע על תכונות כושר מרובות אצל הצאצאים, כאשר חיות הבר ביום השני מייצרות את הצאצאים "האיכותיים ביותר"³³.
   3. ביצוע סנכרון גיל: כדי לקבל תוצאות מדויקות, סנכרן את גיל בעלי החיים בצורה מדויקת ככל האפשר. בפרוטוקול זה, סנכרון הגילאים מתבצע באמצעות טיפול היפוכלוריט שונה³⁴. שיטות אחרות עשויות לכלול סנכרון על ידי הטלת ביצים, על ידי דום זחל L1, או על ידי קטיף ידני של זחלי L4.
      הערה: עבור סנכרון גיל על ידי טיפול היפוכלוריט, צפו לקבל שלוש עד ארבע ביצים מכל הרמפרודיט בוגר.
   4. שמירה על אוכלוסיות נטולות צאצאים: שמירה על אוכלוסיות נטולות צאצאים על ידי חשיפת נמטודות בשלב L4 המאוחר שלהן ל-5-fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR)³⁵.
      הערה: במינונים נמוכים, FuDR קטלני לעוברים מתפתחים מבלי לייצר שינויים נראים לעין מקרוסקופיים בקו הנבט או לשנות את קצב ייצור הביציות. שיטות אחרות כוללות שימוש במוטציות סטריליות בטמפרטורה, שימוש במבני RNAi מעקרים, או פשוט המתנה עד להזדקנות שלאחר הרבייה כדי להעביר את הנמטודות על לוחות להדמיה.
   5. העברת אוכלוסיות: בעת העברת אלפי בעלי חיים בין לוחות, הפרוטוקול הסטנדרטי הכולל חוט פלטינה/אירידיום הופך למייגע. שיטות הכרוכות בתרחיף נוזלי של נמטודות מקלות על ההעברות והופכות אותן ליעילות יותר. לאסוף את הנמטודות עם M9 + Mg buffer (Na₂HPO₄ 42.27 mM, KH₂PO₄ 22.05 mM, NaCl 85.56 mM, MgSO₄ 1 mM), להפחית את הנפח הכולל ברגע הנמטודות להתיישב על ידי כוח הכבידה, ולאחר מכן במהירות להעביר את הנמטודות ללוחות המשמשים להדמיה.
      הערה: העברת הנמטודות באמצעות תרחיף נוזלי עלולה להוביל לשונות במספר בעלי החיים המועברים לכל לוחית. נסו להיות עקביים עם מספר הנמטודות בכל צלחת כדי למנוע שונות ניסיונית.
   6. יישום התערבויות: עצירה והפעלה מחדש של רכישת תמונה במהלך ניסוי מסבכת את ניתוח התמונה (ראה דיון). לכן, התחל את ניסויי LSM רק לאחר שכל הטיפול בנמטודות הדרוש הושלם.
5. עיקור שטיחוני הגומי: בצעו אוטוקלאבל מספר רב של מחצלות בו זמנית, על ידי עטיפתן בנפרד ברדיד אלומיניום.
   הערה: יש לעקר את שטיחוני הגומי בין השימושים כדי למנוע הצטברות של מזהמים פטרייתיים או חיידקיים. רוב סוגי הגומי המשמשים בדרך כלל מתפרקים על ידי טיפול אגרסיבי באתנול.

3. התקנה ביום הניסוי

1. תמיכה בפלטות והכנת זכוכית סורק: כדי לפשט את הטיפול בצלחות, אין להעמיס את צלחות הפטרי ישירות על משטח הסורק, אלא להחזיק אותן במקומן באמצעות שטיחוני גומי הנתמכים על ידי זגוגיות (ראו טבלת חומרים). אוכלוסיות מצולמות דרך זכוכית זו, לכן יש לשמור על הזכוכית נקייה ומטופלת בציפוי נגד ערפל, הידרופובי ומעקר (ראו טבלת חומרים).
   1. לפני העמסת הצלחות לאינקובטור, נקו את פני זכוכית התמיכה של הצלחת משני הצדדים עם חומר ניקוי זכוכית נגד ערפל.
   2. לפני העמסת הפלטות על זכוכית התמיכה שלהן, יש למרוח טיפול מגן הידרופובי בזכוכית (ראו טבלת חומרים) כדי למזער ערפול בצד הזכוכית שיהיה במגע עם שטיחון הגומי. מורחים את הטיפול היטב, ומשאירים אותו על הכוס למשך 5-10 דקות לפני שממשיכים לשלב הבא. יש לנקות במרץ לאחר היישום כדי להסיר שאריות.
   3. יש למרוח 70% אתנול לחיטוי פני השטח של הזכוכית שיהיו במגע עם מאט הגומי. להשאיר למשך דקה או 2 דקות, ולאחר מכן להסיר עם מטלית או מגבת נייר.
2. העמסת הצלחות על הסורקים
   1. ראשית, הניחו את שטיחוני הגומי האוטומטיים על גבי זכוכית התמיכה של הצלחת המטופלת.
   2. הסירו את המכסה מהלוחות המשמשים להדמיה עם נמטודות טעונות, והניחו אותם על משטחי גומי הפונים למשטח הזכוכית. ודאו ששטיחון הגומי אטום היטב סביב כל הצלחות, למשל, על ידי הוספת יריעת זכוכית נוספת מלמעלה והקפדה שהוא מונח שטוח או על ידי הקשה על החלק העליון של כל צלחת (צלחות רופפות יזוזו מעט ויפגעו בזכוכית, תוך השמעת קול, בעוד שצלחות מאובטחות היטב לא יזוזו כאשר מקישים עליהן).
      הערה: כדאי לתייג בנפרד כל גיליון של זכוכית תומכת צלחת עם סרט סימון עם מידע על תוכן הצלחת והסורק המיועד. ניתן להשתמש בנתונים אלה לאחר הניסוי כדי לפתור אי בהירות פוטנציאלית לגבי מיקומי הלוחות.
   3. לפני טעינת הצלחות לסורקים, נתק את מאווררי הסורק כדי להגן על אצבעות הנסיין במהלך טעינת הצלחות.
   4. החלק בעדינות את הלוחות ואת יריעת הזכוכית התומכת בהם על פני השטח של הסורק.
      הערה: הימנע מהפעלת לחץ ישירות על שטיחון הגומי, מכיוון שהדבר גורם לשטיחון להחליק על פני זכוכית התמיכה של הצלחת. כאשר המחצלות מחליקות, לעתים קרובות משחררים את הצלחות מהמחצלת.
   5. הפעל מחדש את מאווררי הסורק וודא באופן חזותי שהמאווררים הקדמיים והצדיים מופעלים. אם הסורקים כבויים, הפעל אותם בשלב זה.

4. רכישה מראש של תמונה

הערה: תרשים זרימה מקיף המסכם את כל השלבים מבוססי התוכנה במהלך רכישת תמונה מתואר באיור 1.

איור 1: סקירה גרפית של צינור ניתוח התמונות של Lifespan Machine. השלבים לפני, במהלך ואחרי רכישת התמונה מבוצעים בעיקר בממשק האינטרנט (WI, באדום) ובדפדפן התולעת (WB, בירוק). שלבים מסוימים מבוצעים בפלטפורמות אחרות (O, בכחול), כגון מסמכי TXT בשלב 3a, Photoshop או שווה ערך בשלב 4b ו- JMP או שווה ערך בשלב 13. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

1. הגדרת רכישת תמונה: צור קובץ המציין את לוח הזמנים של הניסוי ואת מיקום הלוחות בכל סורק כדי להגדיר את רכישת התמונה.
   הערה: קובץ זה כולל מטא-נתונים חשובים, כגון כותרת הניסוי, תדירות לכידת התמונות ומשך הזמן הכולל של הניסוי. בדרך כלל, קובץ זה אינו נוצר de novo עבור כל ניסוי, אך במקום זאת, נעשה שימוש חוזר בקובצי ניסוי מניסויים קודמים כתבניות. עבור הניסוי הראשון של המשתמש, מסופק קובץ תבנית (קובץ משלים 1).
   1. בקש לכידות תצוגה מקדימה: ספק את המיקום של כל הלוחות בכל סורק. מספר כלים מסופקים כדי להאיץ את התהליך הזה. ראשית, השתמש בסורק כדי לקבל תמונה של משטח הסורק כולו, הנקראת "לכידת תצוגה מקדימה". ודא שתמונות התצוגה המקדימה מציגות בבירור את כל פני השטח של כל לוח לצילום (איור 2A) ללא פסים או חיתוך קצות הלוחות.
      1. באמצעות ממשק האינטרנט, מצא את המקטע רכישת תמונות בדף הראשי, ופעל לפי הקישור שנקרא התקני לכידה ושרתי תמונות. בדף זה, לחץ על הלחצן המסומן חפש התקנים חדשים (כלומר, סורקים) בתיבה שרתי לכידת ועיבוד תמונות . עקוב אחר התקדמות השרת בזיהוי סורקים על ידי לחיצה על הקישור [יומן] לצד השרת.
         הערה: ודא שהסורקים הרצויים מופעלים ומחוברים לשרת לפני ביצוע שלב זה.
      2. באותו עמוד של ממשק האינטרנט, ודא שכל סורק המחובר לשרת מופיע בתיבה התקני לכידת תמונה . תווית "חסר" תחת "מצב נוכחי" אינה מוצגת עוד אם ההתקן זוהה בהצלחה. בחר בתיבת הסימון המתאימה לכל סורק המכיל לוחות חדשים שנטענו לאחרונה.
      3. בתחתית הקטע התקני לכידת תמונות , לחץ על בקש לכידת תצוגה מקדימה לחצן. תוך דקה או שתיים, הסורקים אמורים להידלק ולהתחיל בסריקה.
         הערה: לעתים קרובות יש להתאים את המיקום הראשוני של יריעות התמיכה מזכוכית כדי להביא את כל הלוחות לטווח הניתן לצפייה. ניתן לתקן מיקומים על-ידי בדיקת תמונות לכידת תצוגה מקדימה וביצוע התאמות במיקום הלוח וצילום מחדש של תמונות חדשות לצילום תצוגה מקדימה. אם הסריקות מתקדמות לאט מאוד (מספר דקות לצילום אחד) או אם תמונות ללכידה בתצוגה מקדימה מכילות פסים לבנים ארוכים, זהו סימן לכך שלוחית, שטיחון גומי או אובייקט אחר חוסמים אור באזור הכיול של הסורק (מסומן על-ידי חצים לבנים על משטח הסורק). יש למקם מחדש את כל החפצים כך שרק זכוכית התמיכה בזכוכית תופסת אזור זה.
   2. הגדרת אזורי הסריקה: בצע את השלבים הבאים בדפדפן התולעת כדי לנתח את תמונות לכידת התצוגה המקדימה, ולהרכיב אותן לתמונה מורכבת אחת, המשמשת לציון המיקום של כל לוח לניתוח הנתונים. ודא שהתמונה המתקבלת נראית דומה לאיור 2B.
      1. ראשית, באמצעות דפדפן התולעת, פתח כל תצוגה מקדימה של התמונה על ידי בחירה באפשרות התפריט File > Open Image, ובחר את התמונה הרצויה.
      2. בכל תמונה, לחצו לבחירת העמודות לאזורים עם לוחות (אם משטח הגומי כולל 16 מיקומי לוחות, בחרו 4 עמודות).
         הערה: יש לציין את אזורי הסריקה כעמודות גבוהות (לא שורות רחבות) מכיוון שצילום הסורק איטי יותר עבור אזורים רחבים יותר, והתוצאה היא תמונות מטושטשות עקב תנועת נמטודות.
      3. לאחר הגדרת כל התמונות, יצא את מפרטי האזור לדיסק על-ידי בחירת פריט התפריט Image Acquisition > הגדרת אזורי סריקה > שמירת אזורי סריקה שנבחרו בדיסק ובחירת המיקום הרצוי.
   3. צור את לוח הזמנים של הניסוי:
      1. בהתאם לתבנית של קובץ משלים 1, הרכיבו קובץ המכיל את שם הניסוי, המיקומים הפיזיים של כל עמודה בסורקים (שהועתקו מקובץ אזורי הסריקה שנוצר בשלב 4.1.2.3), משך הזמן הכולל של הניסוי ותדירות לכידת התמונה, ושמרו אותו הן כקובץ TXT והן כקובץ XML.
      2. לאחר מכן, בדפדפן תולעת, לחץ על Image Acquisition > Submit Experiment Schedule, ובחר את קובץ ה- XML שנוצר. דפדפן התולעת ישאל אם להפיק סיכום של לוח הזמנים או להפעיל את הניסוי. לחץ על צור קובץ סיכום.
   4. אמת את קובץ הסיכום: לאחר הגשת לוח הזמנים של הניסוי, דפדפן התולעת יפיק סיכום של לוח הזמנים. סיכום זה מוצג על המסך ונכתב לדיסק. קרא אותו ואמת את התאריכים של לכידות מתוזמנות, כמו גם את המיקום, השם ומספר הסורקים.
   5. שלח את לוח הזמנים של הניסוי: כאשר אתה מרוצה מקובץ הסיכום, טען שוב את קובץ XML עבור לוח הזמנים של הניסוי בדפדפן התולעת על-ידי בחירה באפשרות התפריט Image Acquisition > Submit Experiment Schedule. דפדפן התולעת ינחה פעם נוספת אם להפיק סיכום של לוח הזמנים או להפעיל את הניסוי. הפעם לחץ על הפעל! .
      הערה: מספר דקות לאחר הגשת הניסוי, כדאי להשתמש בממשק האינטרנט כדי לוודא שהניסוי הוגש בהצלחה וסריקות נאספות על ידי כל הסורקים. מקובל להחמיץ את הסריקות הראשונות, במיוחד בניסויים גדולים.
   6. ארגן ניסויים בממשק האינטרנט: אשכול סורק עמוס יכול להפיק מאות ערכות נתונים ניסיוניות שנאספו על-ידי משתמשים רבים ושונים. כדי לארגן רשימה זו, הקצה ניסויים לקבוצות נפרדות, לדוגמה בהתאם לשם המשתמש האחראי לניסוי.
      1. צור קבוצה חדשה או שנה קבוצה קיימת: צור קבוצות חדשות בממשק האינטרנט על-ידי לחיצה על נהל קבוצות ניסוי תחת התיבה בשם רכישת תמונות. בדף החדש שיופיע, הוסף את השם הרצוי על צור קבוצה חדשה ולחץ על צור. כדי לשנות שם של קבוצה קיימת, באותה תיבה, בחר את הקבוצה הרצויה לצד שנה קבוצה קיימת ולאחר מכן בחר שנה.
      2. הקצאת ניסויים לקבוצה: כדי להקצות ניסויים חדשים לקבוצה מסוימת, עבור אל ממשק האינטרנט ומצא את הניסוי הרצוי, אשר כברירת מחדל יוקצה לקבוצה ללא קבוצה בתחתית רשימת הניסויים. לחץ על הקישור לצד ימין של קטע הניסוי שבו כתוב ערוך, והשתמש ברשימה הנפתחת כדי לבחור את שם הקבוצה לשימוש. לאחר מכן, בחר שמור.
   7. ביטול ניסוי:
      הערה: ה-LSM ימשיך לעבוד באופן אוטונומי עד שהסריקות הסופיות יצוינו בלוח הזמנים של הניסוי. לאחר השלמת לוח זמנים ניסיוני, ה-LSM ימשיך כברירת מחדל לאסוף סריקות אך ישליך מיד את נתוני התמונה בתהליך שנקרא סריקה אוטומטית. סריקות אוטומטיות אלה מבוצעות כדי למנוע כיבוי וקירור של הסורקים, ולשמור על פרופיל טמפרטורה סטנדרטי כך שכל ניסוי אחר הפועל באותו חלל (אך מניסוי אחר) לא יושפע מהכיבוי של סורקים אחרים.
      1. עצור סריקות אוטומטיות: כדי לעצור את הסריקות האוטומטיות מניסוי מתמשך בממשק האינטרנט, לחץ על ערוך לצד הניסוי הרצוי, לאחר מכן בטל סריקות ממתינות ובחר בטל לכידות מתוזמנות.

איור 2: תצוגה מקדימה של לכידת תמונה ובחירת אזור סריקה. (A) עבור כל סורק בניסוי, נוצרת תמונת לכידת תצוגה מקדימה. (B) בחירה של שורה אחת של לוחות בכל פעם (תיבות אדומות), מה שמגביר את מהירות הסריקה ומונע טשטוש תנועת תולעת כתוצאה מסריקת אזורים רחבים מדי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

5. רכישת תמונות

הערה: ניתן לבצע את השלבים הבאים הן בזמן הפעלת הניסוי והן לאחר סיומו.

1. פלט של קובץ המסיכה של הניסוי: נתוני תמונה גולמיים מסורקים מכילים אזורים רבים שאין צורך לעבד (אזורים מחוץ ללוחות). כדי למקד את הניתוח בכל צלחת בנפרד, נוצרת "מסיכה" המציינת את השטח התפוס על ידי כל צלחת בכל סורק. צור מסיכה זו על-ידי ציור המיקום של כל לוח כשכבת-על על תמונות שנאספו על-ידי הסורקים.
   1. באמצעות דפדפן התולעת, בחר את הניסוי הרצוי על ידי בחירת קובץ > בחר ניסוי נוכחי ולאחר מכן לחץ על שם הניסוי.
   2. שוב בדפדפן התולעת, בחרו Image Acquisition > Define Sample Masks > Generate Experiment Mask Composite ושמרו את המסיכה במיקום הרצוי. ודא שהקובץ שנוצר נראה דומה לאיור 3A.

איור 3: אפיון מיקומי הלוחות עבור כל סורק באמצעות מסיכות לדוגמה. כדי להבטיח ניתוח עצמאי של לוחות בבחירות העמודות המוצגות באיור 1, יש לזהות לוחות בודדים באמצעות יצירת מסיכת תמונה ללא הפרדות צבע. (A) לכידת סריקות הסורקים נפתחת באמצעות תוכנה למניפולציה של תמונות (שימו לב לשם הסורק "han" מעל בחירה סרוקה, ו-"a-d" המתייחס לכל אחת מהעמודות). (B) השלבים הנפרדים של יצירת מסיכה לסימון המיקום של כל לוח ברצף המסיכה ללא הפרדות צבע מחייבים להגדיר את הרקע לשחור, (C) הסרת קצוות וקצוות משוננים של לוחות שלא נבחרו על-ידי הרחבה ולאחר מכן כיווץ של הרקע, ו-(D) בחירת לוחות החזית ומילוי האזורים במלואם בפיקסלים לבנים. (E) כדי שה-LSM יזהה לוחות בודדים בשורות הסרוקות, כל אזור לבן בשורה מלא בגוון אפור שונה, בדרך כלל בבהירות הולכת וגוברת. (F) בשלב זה נשמרת המסיכה (דחיסת LZW ללא שכבות שצוינו אם נוצרו ב- Photoshop). לאחר מכן המסיכה נסרקת על ידי דפדפן התולעת, ונוצרת הדמיה של המסכה על ידי התוכנה. תצוגה חזותית נכונה של מסיכה צריכה להציג ריבוע מוגדר אחד לכל לוחית עם צלב קטן במרכז וצבע שונה לכל שורה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

2. הוספת הערות למסיכת הניסוי: פתחו את הקובץ שנוצר בשלב הקודם בעזרת תוכנית לטיפול בתמונה (כגון Photoshop או GIMP) כדי לסמן את המיקום של כל לוח בתמונה. סקירה כללית של כל שלבי עריכת המסיכות באמצעות Photoshop מתוארת להלן.
   1. ב- Photoshop, בחרו בכלי מילוי כשהרגישות מוגדרת על אפס, האפשרות הרציפה נבחרה וההחלקה לא נבחרה. לחץ על הרקע האפור כדי להגדיר אותו לחלוטין לשחור. ודא שהתמונה המתקבלת נראית דומה לאיור 3B.
   2. השתמשו בכלי מטה הקסם כדי לבחור את הרקע השחור, כשהכינוי מוגדר ככבוי, הסיבולת מוגדרת לאפס והאפשרות הרציפה נבחרת. כדי להחליק את הקצוות, הרחב את הרקע שנבחר ב- 30 פיקסלים על-ידי לחיצה על בחר > שנה > הרחב. לאחר מכן, כווץ את הבחירה ב- 20 פיקסלים ב - Select > Modify > Contract. ודא שהתמונה המתקבלת נראית דומה לאיור 3C.
   3. לדוגמה, מלאו את הרקע המוחלק כולו בפיקסלים שחורים, באמצעות קביעת רגישות הכלי מילוי על 255 ומילוי האזור שנבחר. לאחר מכן, לחץ על בחר > הפוך כדי להפוך את הבחירה ובחר את החזית. לדוגמה, מלאו את האזור החדש כולו בפיקסלים לבנים, באמצעות קביעת רגישות הכלי מילוי ל- 255 ומילוי האזור בלבן. ודאו שהתמונה המתקבלת נראית דומה לאיור תלת-ממד.
   4. כדי להפריד כל לוח בתוך אזור אחד, מלא כל שורה במעבר צבע אפור שונה בבהירות הולכת וגוברת. ניתן לעשות זאת באמצעות הכלי מילוי ולאחר מכן על ידי בחירת הצבע הרצוי, כאשר הסובלנות מוגדרת ל- 0. ודא שהתמונה המתקבלת נראית דומה לאיור 3E. שמור אותו בדחיסת LZW ללא ציון "שכבות".
      הערה: סדר הלוחות נקבע לפי צבע האזורים שצוינו. כדי לתת שמות ללוחות 1-4 בסדר מלמעלה למטה, ציין את הצבעים בהגברת הבהירות לכל שורה.
   5. בדפדפן התולעת, בחרו Image Acquisition > Define Sample Masks > Analyze Plate Locations Drawn on Experiment Mask Composite ובחרו בקובץ שנוצר בשלב הקודם. התוכנה תיקח כעת כמה רגעים לנתח את המסכה שהוגשה.
   6. דפדפן התולעת יציג תצוגה חזותית של מסיכה. בדוק אם קיימות שגיאות אפשריות בקובץ במסיכה. ודא שכל שורת לוחות מלאה בצבע שונה ומסומנת במלבן צבעוני. ודא שהתמונה המתקבלת נראית דומה לאיור 3F.
      הערה: אם לוח בודד אחד מציג שני עיגולים או יותר, או אם שני עיגולים חולקים את אותו צבע, חזור לשלב 5.2 כדי לתקן את קובץ המסיכה וטען אותו שוב בדפדפן התולעת.
   7. לאחר שווידאת שהתצוגה החזותית של המסיכה נכונה, בדפדפן התולעת, בחר Image Acquisition > Define Sample Masks > Submit Analyzed Experiment Mask Composite to Cluster. שרת ניתוח התמונות ינתח כעת את המיקום של כל הלוחות בניסוי.
3. החל את המסיכה: ה- LSM משתמש במסיכות כדי לפצל את נתוני התמונה הגולמיים ללוחות נפרדים. כדי להתחיל בתהליך זה, תזמן משימת יישום מסיכה באמצעות ממשק האינטרנט.
   1. לפני שליחת העבודה, ודאו שכל הסורקים זיהו אזורים במסיכה. עבור לדף הראשי של ממשק האינטרנט, אתר את שם הניסוי ואת העמודה בשם ניתוח תמונות, ולחץ על הפעל ניתוח. ודא שלכל המכשירים תחת דגימות ניסוי יש אזורים מזוהים.
   2. כדי להחיל את המסכה, על אותו ממשק, לחץ על עבודה חדשה עבור כל הדגימות. בתיבה בשם תזמון משימה עבור תמונות בודדות, בחר בתיבה החל מסיכה ולאחר מכן שמור משימה.
      הערה: המסכה תחול על כל התמונות שכבר צולמו, כמו גם על כל התמונות שצולמו בעתיד.
4. בצע בקרת איכות צלחת:
   הערה: לוחות הסובלים מזיהום, התייבשות או ערפול מצונזרים בשלב זה של ניתוח התמונה. דוגמה ללוחות מזוהמים, מיובשים, מעורפלים ואופטימליים מוצגת באיור 4. סיבות אחרות לצנזורה כוללות רעב, צלחות ריקות או זחלים באוכלוסיות סטריליות. לוחות לא חוקיים יכילו לעתים קרובות צורות מורכבות שהמכונה שואפת לפרש כנמטודות. חשוב לא לכלול לוחות לא חוקיים בשלב זה כדי למנוע זמני עיבוד ארוכים בשלבים מאוחרים יותר של ניתוח התמונה.
   1. באמצעות ממשק האינטרנט, אל תכלול את הלוחות שיש לצנזר על-ידי מציאת הניסוי הרצוי והעמודה בשם Annotate Plate Information ובחירה באפשרות By Image.
   2. כדי לבדוק את הלוחות, לחץ על הצגת תמונות.
      הערה: אם השלב להצגת תמונות אינו פועל כראוי, ייתכן ששרת Linux לא הוגדר כראוי. הוראות כיצד לעשות זאת זמינות במדריך התקנת התוכנה במאגר GitHub הנ"ל.
   3. כדי לא לכלול לוחות, סמן את התיבה צנזור סמן אפשרות בתיבה הנפתחת בשם סיבה מצונזרת ולאחר מכן לחץ על שמור עבור כל דף.
5. הוספת מטא-נתונים: מטא-נתונים מתארים את התוכן של כל לוח בניסוי. מידע זה נכלל לאחר מכן בכל קבצי הנתונים הסטטיסטיים שנוצרו לאחר מכן.
   1. כדי להוסיף מידע מטא נתונים ביחס לזן, גנוטיפ, טמפרטורה, מזון וכו ', עבור לדף הראשי של ממשק האינטרנט, מצא את הניסוי הרצוי ואת העמודה בשם Annotate Plate Information, ובחר לפי מיקום.
   2. הזן את התוויות ובחר את הסורקים שעבורם יש לשמור את המטא-נתונים על-ידי לחיצה על שמור בהתקנים בפינה השמאלית התחתונה.
   3. כדי לעשות שימוש חוזר במטא-נתונים בין סורקים שונים מבלי להזין שוב את כל התוויות, עבור אל טען מהתקן בפינה השמאלית העליונה, בחר את הסורק שממנו תוכל לעשות שימוש חוזר במטא-נתונים ולחץ על טען מהתקן.
6. ציין את זמן "גיל האפס": כברירת מחדל, LSM מודד זמן ביחס לתחילת תקופת UNIX. לעתים רחוקות זה נוח, ולכן נדרש מפרט של זמן התייחסות (לדוגמה, התאריך שבו כל הפרטים בקעו או הגיעו לבגרות).
   1. כדי לציין את מידע זמן האפס, עבור אל הדף הראשי של ממשק האינטרנט, מצא את הניסוי הרצוי ואת העמודה בשם ניתוח תמונה, ובחר הפעל ניתוח.
   2. בדף החדש שמופיע, בחר משימה חדשה עבור כל האזורים. בתיבה בשם Update Region Information, בחר את השעה שבה לבעלי חיים היה גיל 0, הוסף את המידע ולאחר מכן לחץ על עדכן שדות נבחרים.
      הערה: אם כל בעלי החיים אינם חולקים את אותו זמן אפס-גיל, בחר במקום זאת משימה חדשה עבור סוגי בעלי חיים ספציפיים, וחזור על השלבים לעיל עבור כל קבוצה.
7. תזמן את זיהוי התולעת: ה-LSM יכול להפוך את הזיהוי של כל נמטודה לאוטומטי בהתבסס על מיקומה על הצלחת.
   1. כדי להתחיל את הזיהוי האוטומטי של נמטודות עבור כל תמונה, עבור אל הדף הראשי של ממשק האינטרנט, מצא את הניסוי הרצוי ואת העמודה בשם ניתוח תמונה, ובחר הפעל ניתוח.
   2. בדף החדש שיופיע, לחץ על משימה חדשה עבור כל האזורים, ולאחר מכן על התיבה בשם תזמון משימה עבור תמונות בודדות, ובחר את התיבות מסנן חציוני > סף > זיהוי תולעים > שמור עבודה. משימות אלה יחולו על כל תמונות העבר והעתיד שצולמו.
      הערה: כדי לתזמן עבודה רק עבור זן או מצב מסוים, לחץ במקום זאת על משרות עבור סוגי בעלי חיים ספציפיים. סיווג אובייקטים מתבצע באמצעות מודלי SVM המצוינים כקבצים המאוחסנים בתיקיית המשנה Models של ספריית האחסון לטווח ארוך של LSM. ניתן להוריד ערכות פרמטרים לזיהוי נמטודות V2.0 עבור LSM ממאגר GitHub.

איור 4: בקרת איכות צלחת באמצעות ממשק האינטרנט. צנזורה של לוחות תת-אופטימליים בממשק האינטרנט לפני ניתוח תנועת התולעת חיונית להאצת צינור עיבוד התמונה. דוגמאות ללוחות הכפופים להסרה כוללות תנאים של (א) התייבשות, (ב) זיהום, או (ג) ערפל, להבדיל. (D) לוחות אופטימליים שייכללו בניתוח נוסף. סרגל קנה מידה של 10 מ"מ מונח על גבי תמונת לכידת תצוגה מקדימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

6. רכישה לאחר תמונה

הערה: לאחר השלמת זיהוי התולעים, יש לצבור את כל הנתונים שנאספו מהניסוי לאורך זמן כדי לעקוב אחר כל פרט לאורך תוחלת חייו ולזהות את כל זמני המוות של הפרטים. המתן עד שכל בעלי החיים בניסוי ימותו ועד שכל עבודות איתור התולעים יושלמו, ולאחר מכן בצע את השלבים הבאים:

1. תזמן את ניתוח התנועה:
   1. ניתוח התנועה משלב את כל נתוני הניסוי לאורך זמן כדי להעריך את זמני המוות. כדי להתחיל בעבודה זו, עבור אל הדף הראשי של ממשק האינטרנט, ומצא את הניסוי הרצוי בעמודה בשם ניתוח תמונות. בחר את הקישור הפעל ניתוח.
   2. בדף החדש שמופיע, לחץ על הקישור עבודה חדשה לכל האזורים, ומהתפריט הנפתח, קבע משימה לאזור שלם, בחר נתח תנועת תולעת, ולחץ על כפתור שמור עבודה.
   3. שרת רכישת התמונות LSM יתחיל לנתח באופן אוטומטי את התנועה על פני כל הלוחות.
      הערה: ניתוח תנועה הוא העבודה הגדולה ביותר. במעבד מודרני מרובה ליבות, הניתוח של כל צלחת מניסוי אורך חיים של חודש אחד יכול להימשך 20 דקות או יותר.
2. צור לוח תכנון: לאחר השלמת ניתוח התנועה, לוח התכנון של LSM מאפשר למשתמשים לאמת באופן ידני את התוצאות האוטומטיות ולהבטיח שהתוכנה מניחה הנחות נכונות לגבי המורפולוגיה וההתנהגות של הנמטודה.
   1. בדף הראשי של ממשק האינטרנט, אתר את הניסוי הרצוי ואת העמודה בשם ניתוח תמונות, ובחר הפעל ניתוח. בדף החדש שמופיע, לחץ על משימת ניסוי חדשה. לאחר מכן, בסעיף תזמון משימה עבור אזור שלם, בחר צור לוח תכנון של בעלי חיים ולחץ על שמור עבודה.
   2. לאחר שה- LSM סיים ליצור את לוח התכנון, עבור אל דפדפן התולעת ובחר את הניסוי הרצוי. בחזרה בתפריט הראשי, בחר אימות > עיין בכל > הניסוי מיד לאחר מותו של כל תולעת.
3. הוסף הערות ללוחות התכנון בדפדפן התולעת: לוח תכנון טיפוסי בדפדפן התולעת אמור להיראות תרשים 5.
   1. ביאור אובייקטים "שאינם תולעים"
      הערה: כל אובייקט שזוהה במהלך התנועה מוצג בלוח התכנון, מסודר לפי זמן המוות המשוער. אלא אם המשתמש מציין אחרת, כל אובייקט ייכלל בעקומות ההישרדות שנוצרו. סיווג האובייקטים של LSM מכויל בכוונה להיות בעל שיעור חיובי כוזב גבוה, כפשרה כדי למזער את מספר הנמטודות שלא זוהו. ההדרה של חפצים שאינם תולעים חשובה להשגת עקומות הישרדות באיכות גבוהה (ראה תוצאות מייצגות). מספר רב של אובייקטים שאינם תולעת נמצאים בדרך כלל בעמודים הראשונים והאחרונים של לוח התכנון, אשר ניתן להוציא במהירות ידנית בכמויות גדולות.
      1. כדי לא לכלול אובייקטים שאינם תולעים בלוח התכנון, לחצו לחיצה ימנית פעם אחת על תמונת העצם. האובייקט המוחרג יסומן כעת על-ידי תיבה לבנה. כדי לא לכלול אובייקטים רבים בו-זמנית, החזק את מקש הבקרה ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני פעם אחת על אובייקט כלשהו, וכל האובייקטים בעמוד התכנון לא ייכללו.
      2. לאחר אי הכללת אובייקט בניתוח, ניתן לכלול אובייקט זה מחדש על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני פעמיים שוב.
      3. כדי לשמור את ההערות שבוצעו במהלך ביאור לוח התכנון, לחץ על להציל לחצן. מומלץ לשמור לעתים קרובות את ההתקדמות תוך כדי הערות.
   2. ביאור זמני הפטירה:
      הערה: ללא התערבות המשתמש, ה-LSM מעריך במדויק את זמני התמותה של רוב האוכלוסיות. עם זאת, מומלץ לאשר באופן שגרתי את דיוק התוצאות האוטומטיות על ידי אימות ידני של תת-קבוצה אקראית של אנשים מכל ניסוי. יש להקדיש תשומת לב מיוחדת לאנשים בעלי תוחלת החיים הקצרה ביותר והארוכה ביותר, מכיוון שכל טעות בניתוח אוטומטי נוטה להתקבץ בקבוצות אלה.
      1. לחץ לחיצה שמאלית פעם אחת על אובייקט כלשהו בלוח התכנון כדי לפתוח חלון חדש המציג מידע מפורט מסדרות זמן אודות אובייקט זה. חלון זה מאפשר לבחון את כל התמונות שנאספו של האובייקט במהלך הניסוי, כמו גם לכמת את דינמיקת התנועה והמורפולוגיה של האובייקט. באמצעות אותו ממשק, ביאורים ידניים של זמני המוות. הממשק לביאור זמן המוות מוצג באיור 6.
      2. כדי להוסיף ביאורים ידניים לזמני המוות, לחץ לחיצה שמאלית על הסרגל התחתון בנקודה המתאימה לשעת המוות. השתמש במקש הרווח ובחצים ימינה או שמאלה של המקלדת כדי לעבור בין מסגרות הזמן, או לחץ ישירות על הסרגל במסגרת הזמן הרצויה.
         הערה: התצוגה החזותית מייצגת את מצב התנועה של בעלי חיים לאורך זמן, כמו גרף עמודות אופקי עם זמן סימון ציר x. החלק הוורוד/סגול מציין את פרק הזמן שבו החפץ נע במרץ, צהוב מציין תנועה חלשה, אדום מציין בעלי חיים שאינם זזים, וירוק מציין את תקופת ההתפשטות הקשורה למוות. נמטודות מציגות אירועים מורפולוגיים אופייניים הקשורים למוות: התכווצות הדרגתית של הגוף שמתרחשת בדרך כלל לפני המוות, ואחריה התרחבות מהירה של הגוף במהלך המוות או מיד אחריו (איור 6B). עצמים שאינם תולעים כגון אבק או צללים אינם מראים את הדינמיקה הזו בגודל הגוף, ובמקום זאת, בדרך כלל עוקבים אחר שינוי ליניארי והדרגתי בגודל ובעוצמה לאורך זמן. דינמיקות גודל גוף שונות אלה מספקות שיטה מהירה ופשוטה לסיווג מהיר והרחקה ידנית.
      3. בהתאם לגישת הניתוח, זמן המוות יכול להיחשב כזמן הפסקת התנועה (תחילת הסרגל האדום בהדמיית התנועה) או כזמן ההתרחבות הקשורה למוות (הסרגל הירוק בהדמיית התנועה). כדי להוסיף ביאורים ידניים לאירועי התכווצות והתרחבות, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הסרגל התחתון במסגרת הזמן הרצויה.
   3. תצוגות חזותיות בסיסיות מסוימות של נתוני תמותה מסופקות באופן מקורי בתוך לקוח דפדפן התולעת. עקומות הישרדות ואבחון זמן מוות מוצגות עבור כל אוכלוסייה שנוכחת בלוח התכנון (איור 7). ראה את עקומות ההישרדות בצד שמאל ואת עלילת הפיזור המשווה את הזמן של הפסקת תנועה נמרצת (VMC) לזמן המוות של כל פרט בצד ימין של לוח התכנון.
      הערה: ניתן לקבץ תוצאות אלה לפי פרמטרים ניסיוניים שונים על ידי תת-הגדרה בסרגל התחתון עבור תנאים כגון זנים ספציפיים, סורקים או צלחות. ניתן לבחור תולעים בודדות בהתבסס על זמני המוות שלהן על ידי לחיצה שמאלית על נקודות בודדות בתרשים VMC לעומת זמן המוות.
4. כתיבת נתוני התמותה לדיסק: ה-LSM מייצר נתוני תמותה בצורה של קבצי CSV. שרטט את עקומות ההישרדות המופקות ונתח אותן בכל תוכנה סטטיסטית כגון R, SAS, STATA או JMP.
   1. כדי ליצור קבצים אלה, בחר את הניסוי בדפדפן התולעת, ובתפריט, בחר קבצי נתונים, זמני מוות, ולאחר מכן לחץ על צור זמני מוות עבור הניסוי הנוכחי. ה-LSM ייצור קובץ פלט עם נתוני ההישרדות של הניסוי, שיישמר בספריית התוצאות.
   2. אם בוצעו ביאורים ידניים בלוח התכנון, תופיע הנחיה בדפדפן התולעת השואלת כיצד לטפל ביאורים ידניים. לחץ על "מיד" כדי לכלול ביאורים ידניים בקובץ זמני המוות שהופק.
      הערה: קובצי נתוני תמותה נכתבים בספריית התוצאות שצוינה בקובץ imageserver.ini. מגוון קבצים נכתבים, אך הגרסה הנפוצה ביותר היא "survival_simple/survival=machine_hand", הכוללת את כל ההערות הידניות שנעשו באמצעות לוח התכנון.
   3. לנתח את נתוני התמותה בתוכנה הסטטיסטית הנבחרת.

איור 5: לוח התכנון של בעלי חיים בדפדפן התולעת. (A) כל התולעים הנייחות מוצגות בסדר כרונולוגי של זמן המוות המבואר על-ידי מכונה. כדי לנווט בלוח התכנון, לחץ על הלחצנים בפינה הימנית התחתונה (B) ו- (C) שמור את הביאורים לעתים קרובות. (D) התמונות עם רקע לא אפור מתארות שני אירועי מוות של תולעים (מוות מוקדם כירוק, מוות מאוחר יותר כאדום), אשר יכולים להתרחש כאשר שתי תולעים מתות קרוב זו לזו, או כאשר תולעים מתות מועברות על-ידי תולעת חולפת ולכן מזוהות כמתות פעמיים. (E) תג אדום בפינה התחתונה של תמונה מזהה תולעים עם זמן מוות שזוהה; (F) תג ירוק מציין היכן חפץ לא נשאר דומם מספיק זמן כדי לתעד זמן מוות. (G) ניתן לסמן תולעים מרובות באותה מסגרת על ידי הקשה על Shift ולחיצה שמאלית. (H) עצמים שאינם תולעים אינם נכללים בניתוח בלחיצה ימנית. (I) תולעים שהתפוצצו מצונזרות מהניתוח על ידי לחיצה על התמונה המתאימה (נפתח חלון ביאור ידני) ולחיצה על Shift ולחיצה ימנית עד שתופיע הודעת "חיה התפוצצה". סרגל קנה מידה של 0.5 מ"מ ותוויות מונחים על גבי צילום המסך של חלון דפדפן תולעת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: בדיקת עצמים וביאור זמני מוות בדפדפן התולעת. לחיצה שמאלית על אובייקט כלשהו בלוח התכנון של דפדפן התולעת פותחת ממשק חדש ומאפשרת למשתמש לבדוק את דינמיקת התנועה של האובייקט. בצד ימין מוצג ציון התנועה (A), המכמת את תנועת האובייקט; זה מוערך על ידי השינוי בעוצמות פיקסלים בין תצפיות עוקבות. בנוסף, בצד ימין, (B) מוצג השינוי בעוצמת האובייקט הכוללת, המכמת שינויים בגודל האובייקט. בצד שמאל, הסרגל העליון מציג את הערכת המכונה (C) של זמן המוות, ואילו הסרגל התחתון מציג את (D) ביאור ידני אנושי. לחיצה על נקודה כלשהי בסורגים ולחיצה על מקש הרווח מאפשרת למשתמש לנוע במסגרות הזמן שבהן צולמה התולעת. על הסורגים האלה, ורוד מייצג את הזמן המושקע בתנועה נמרצת, אדום מייצג את הזמן המושקע במוות, וצהוב הוא כל מה שביניהם. הזמן המושקע בהתרחבות והתכווצות לאחר זמן המוות מוצג בירוק. תוויות מופיעות על גבי צילום המסך של חלון דפדפן תולעת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תרשים 7: נתוני סיכום אוכלוסייה בדפדפן התולעים. סטטיסטיקת אוכלוסייה עבור מכשיר הסורק "obiwan", עם תרשים של הישרדות (פאנל שמאלי) ותרשים פיזור של זמן הפסקת התנועה הנמרצת (VMC) לעומת זמן המוות (פאנל ימני). התרשים הוא פרטים של (A) תנאי אחד, המתקבל מ-(B) סורק אחד שהושג על ידי בחירה ראשונה (C) של קבוצת ההישרדות לפי זן. (D) הצורות הריבועיות בתרשים הפיזור מתארות את האירועים המבוארים ביד, ואילו (E) הצורות המעגליות מתארות את האירועים המבוארים על-ידי מכונה. (F) ביאור ידני נדרש לעתים קרובות עבור אירועי מוות המתרחשים מוקדם או (G) אלה שבהם הזמן של הפסקת תנועה נמרצת עולה בקנה אחד עם זמן המוות. תוויות מופיעות על גבי צילום המסך של חלון דפדפן תולעת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות

יכולת השחזור הניסויית במבחני תוחלת חיים היא מאתגרת ודורשת הן תנאי ניסוי מבוקרים היטב והן אוכלוסיות גדולות כדי להשיג רזולוציה סטטיסטית מספקת ^4,36. ה-LSM מתאים באופן ייחודי לסקר אוכלוסיות גדולות של בעלי חיים בסביבה קבועה עם רזולוציית זמן גבוהה. כדי להדגים את הי?...

Discussion

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט ונגיש לביצוע ניסוי באמצעות הגרסה העדכנית ביותר של Lifespan Machine. הראינו כי השלב הקריטי להשגת עקומות הישרדות פתורות היטב הוא הרחקה ידנית של עצמים שאינם תולעים במהלך רכישת התמונה. לביאור זמן מוות ידני יש השפעה קטנה על הצורה הכוללת של עקומות ההישרדות, והוא מראה כי ה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Naphtaleneacetic  acid (Auxin)	Sigma	N0640	Solubilize Auxin in 1M potassium hydroxide and add into molten agar
5-fluoro-2-deoxyuridine (FUDR)	Sigma	F0503	27.5 μg/mL of FUDR was used to eliminate progeny from populations on UV-inactivated bacteria
Glass cleaner	Kristal-M	QB-KRISTAL-M125ml
Hydrophobic anti-fog glass treatment	Rain-X Scheibenreiniger	C. 059140
Rubber matt	Local crafstman		Cut on a high-strength EPDM rubber sheet stock
Scanner glass	Local hardware supplier		9" x 11.5" inch glass sheet
Scanner plates	Life Sciences	351006	50 mm x 9 mm, polystyrene petri dish
USB Reference Thermometer	USB Brando	ULIFE055500	For calibrating temperature of scanners