口鼻瘘小鼠模型的建立

摘要

本文概述了建立具有口鼻瘘的小鼠模型的分步程序。口鼻瘘是通过采用加热的眼科烧灼术破坏硬腭的中线部分而形成的，导致口腔和鼻腔之间形成开口。

摘要

本研究提出了一种利用加热眼科烧灼术开发研究口鼻瘘的可行模型的方法。采用C57BL/6小鼠建立口鼻瘘（ONF）模型。为了产生ONF，小鼠被麻醉，固定，并暴露它们的硬腭。在手术过程中，使用眼科烧灼术在硬腭中线诱导 2.0 x 1.5 mm 的全层粘膜损伤。控制ONF的大小并尽量减少出血以确保实验成功至关重要。在术后第 7 天对 ONF 模型的有效性进行了验证，包括解剖学和功能评估。口腔内鼻中隔的存在以及注射到口腔时从鼻孔流出的无菌水证实了ONF模型的成功建立。该模型展示了实用且成功的口鼻瘘，其特点是死亡率低、体重变化显着且 ONF 大小变化最小。未来的研究可能会考虑采用这种方法来阐明腭伤口愈合的机制，并探索口鼻瘘的新疗法。

引言

口鼻瘘 （ONF） 是口腔和鼻腔之间的异常开口，临床表现为从肺泡突到悬雍垂的结构区域缺陷，通常作为腭裂修复后的并发症发生¹.ONF 患者会出现食物反流、发音障碍和腭咽功能受损，显着影响他们的生活质量 ^2,3,4。术后 ONF 的发生率在 2.4% 至 55% 之间，这是由于裂隙宽度、Veau 类型和手术方法⁵、⁶、^7、8 等因素造成的。此外，ONF修复后的复发率很高，从0%到43%^不等9。

最近，几种新的治疗方法在ONF领域显示出前景，包括不同的材料、药物和新技术10,11,12,13,14,15,16,17。准确评估治疗效果至关重要，因为它为选择和进一步开发ONF治疗提供了基础。然而，在短期内获得手术以外的治疗效果的有效评估具有挑战性，因为不同患者的 ONF 特征各不相同。因此，建立ONF疾病模型对于验证这些治疗方法的有效性是必要的。

几十年来，研究人员在各种动物物种中生成了口鼻瘘 （ONF） 模型，包括大鼠^18,19、仔猪^20、21、迷你猪 22 和狗 ^23，因为这些物种具有适合手术操作的大量硬腭。然而，小鼠的基因序列和全基因组与人类相似，使其成为研究和开发新药的重要模型24,25,26。此外，小鼠在批次之间几乎没有变化，使它们成为建立ONF模型^12,13,27的有利选择。

但是，没有描述创建ONF的详细步骤，也没有考虑ONF大小的稳定性。此外，ONF形成的验证仅依赖于观察²⁸，而没有确保口腔和鼻腔之间的直接沟通。它没有通过其他方式得到证明，例如由于ONF引起的进食困难导致小鼠体重减轻。此外，没有考虑伤口大小的正常变化，这对于研究促进或抑制伤口愈合的药物或材料至关重要。因此，迫切需要建立一个稳定且经过验证的ONF模型。

本研究的目的是开发一个实用的 ONF 模型来解决上述问题，希望该协议将成为未来研究腭伤口愈合机制和 ONF 新疗法的基础。

研究方案

本研究中的所有动物手术均由四川大学华西口腔医学院伦理委员会审查批准。本研究采用成年C57BL/6小鼠（雌性）。

1. 手术准备

1. 收集手术所需的手术器械：生发器，眼科烧灼器，显微外科剪刀，显微外科镊子，注射器和针头（26g×0.63英寸）（图1A，B）（见材料表）。
   注意：在外科手术之前，将手术器械（包括眼科烧灼器、显微外科镊子和显微外科剪刀）高压灭菌，在 102.9 kPa （1.05 kg/cm²） 和 121 °C 下高压灭菌 20 分钟。
2. 收集所需的手术用品：手术单、乳胶手套、无菌棉、无菌床单、无菌金属箔、作为手术平台的泡沫板、橡皮筋（可以通过撕开医用乳胶手套获得）和胶带（图 1C）（见 材料表）。
   注意：为每只小鼠使用一套单独的耗材，包括用于手术区域的注射器和无菌片。
3. 使用酒精湿巾清洁手术区域和器械（光源、泡沫板和温度维持装置，见 材料表）。用无菌金属箔盖住手术过程中可能需要的器械的旋钮和把手。
4. 无菌地打开各个器械，并小心地将它们放置在手术区域。激活发芽剂（参见 材料表）和在手术过程中使用的灯。将眼科烧灼器放入发芽器中，加热至250°C20分钟。

2. 外科手术

1. 按照以下步骤固定鼠标并打开口腔。
   1. 选择一只体重20-25克、年龄为8-12周龄的雌性C57BL/6J小鼠。在进行任何程序之前将小鼠放置 7 天。
   2. 通过腹膜内注射Zoletil50（80mg / kg）和甲苯噻嗪（5mg / kg）麻醉小鼠（参见 材料表）。将眼科眼药膏涂抹在小鼠的眼睛上。等到没有脚趾捏反应。
      注意： 当鼠标无法独立翻转时，鼠标已准备好进行该过程。
   3. 将鼠标固定在衬有无菌床单的泡沫板上。使用胶带将鼠标以仰卧姿势绑在手术平台上（图2A）。
   4. 打开小鼠的口腔。将两根针（26 g x 0.63 英寸）放在眶耳平面的前面，再放置两根针。将橡皮筋放在针头上，然后交叉门牙以保持嘴巴张开。使用显微外科镊子撑开嘴角（图2B）。
      注意：确保硬腭清晰暴露。将舌头固定在橡皮筋下方，以防止在随后的实验中阻碍视野和燃烧。
2. 在硬腭上创建口鼻瘘（ONF）（图3A-F）。
   1. 取回眼科烧灼器，将其加热至250°C20分钟。将烧灼尖端放置在距离上颚中线和第一前磨牙线交汇处 1 毫米处，在中线的硬腭上造成全层粘膜损伤。
      注意： 避免烫伤鼠标的舌头。
   2. 几秒钟后，当烧灼尖端周围的粘膜变白时，取下眼科烧灼器。
   3. 将眼科烧灼器置于萌发器中，继续加热至250°C10分钟。重复上一步，扩大边缘周围的伤口，直到其长度达到 2.0 毫米，宽度达到 1.5 毫米。
      注意：每次延伸都应遵循最后一次受伤的边缘。使用游标卡尺测量受伤的长度和宽度。损伤应覆盖上颚的 10%。
   4. 使用显微外科剪刀去除伤口周围多余的变性软组织。使用无菌棉止血，防止小鼠吸入性窒息。测量伤口，确保其在中线形成 2.0 x 1.5 毫米的全层硬腭粘膜损伤。

3. 术后护理

1. 在术后觉醒时给予小鼠美洛昔康，剂量为5mg / kg / d，持续3天，皮下注射²⁹。
2. 将鼠标放在温度维持装置上，直到它完全恢复意识。
   注意： 确保鼠标的位置有利于呼吸。每10-15分钟旋转一次小鼠，以防止血液淤积或肺叶塌陷。一旦老鼠热身，将其放回笼子里。在笼子底部提供无菌果冻和辐照饲料供小鼠食用。

4. 口鼻瘘的形成验证

注意：口鼻瘘 （ONF） 创建的成功率在手术后的第 7 天进行评估。

1. 准备必要的手术用品：橡皮筋、胶带、注射器、手术单、乳胶手套、无菌床单、无菌金属箔和泡沫板。
2. 佩戴手术单和无菌手套以保持无菌状态。用酒精对泡沫板、光源、保温装置进行消毒。
3. 通过腹膜内注射Zoletil50（80mg / kg）诱导全身麻醉。等到没有脚趾捏反应。使用步骤 2.1.3 和 2.1.4 中描述的相同方法固定鼠标并暴露硬腭。
4. 通过确保隔膜在伤口部位仍然可见来进行解剖结构验证，表明ONF创建成功（图4A，B）。
5. 进行功能验证：关闭小鼠的口腔，并使用无菌注射器将无菌水注入其口腔。当液体从小鼠的鼻孔流出时，ONF的成功产生得到确认。
6. 将鼠标放在温度维持装置（37°C）上，直到它完全恢复意识。每10-15分钟旋转一次小鼠，以防止血液淤积或肺叶塌陷。

结果

为了评估该实验方法的可行性和稳定性，对 10 只小鼠进行了相同的程序，并观察了死亡率、伤口大小、体重和组织学分析的变化。小鼠在第7天被安乐死。

该手术的死亡率较低。眼科烧灼器和萌发器，如图1A-C所示，是本实验中使用的关键仪器。ONF模型是根据提供的协议创建的。在手术的10只小鼠中，只有1只在手术后第7天死亡。...

讨论

研究人员探索了治疗 ONF¹⁰、11、12、13、14、15、^16、17 的各种材料、药物和新技术。随着外科手术的进步，ONF的发病率和复发率已经降低。然而，由于该疾病的独特性，临床上ONF患者的数量有限，?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Germinator	Electron Microscopy Sciences	66118-20	Heating and disinfection equipment
Latex gloves	Allmed		or similar
Lights	Olympus	A1813
Meloxicam	MedChemExpress	HY-B0261	crushed; 5 mg/kg
Microsurgical instruments (scissors and tweezers)	Jiangsu Tonghui Medical Devices Co.	M-Y-0087	Surgical instrument
Ophthalmologic cautery	Suqian Wenchong Medical Equipment Co.	1.00234E+13	Surgical instrument
Sterile cotton,	Yancheng Begu Technology Co.		or similar
Sterile metal foil	Biosharp		or similar
Sterile sheets	3M	XH003801129	or similar
Surgical drapes	Yancheng Begu Technology Co.		or similar
Syringes	Yancheng Begu Technology Co.	S-015301	or similar
Tape	Bkmamlab		or similar
Temperature maintenance device	Harvard Apparatus	LE-13-2104
Zoletil50	Virbac		80 mg/kg