口腔鼻腔瘻マウスモデルの確立

要約

この記事では、口腔鼻腔瘻のあるマウスモデルを確立するための段階的な手順を概説します。口腔鼻瘻は、加熱された眼科焼灼を使用して硬口蓋の正中線部分を損傷し、口腔と鼻腔の間に開口部を形成することによって作成されました。

要約

この研究は、口腔瘻を調査するための実行可能なモデルを開発するために加熱された眼科焼灼を利用する方法を提示します。C57BL/6マウスを用いて、口腔鼻腔瘻(ONF)モデルを確立した。ONFを作製するために、マウスに麻酔をかけ、固定し、硬口蓋を露出させた。外科的処置中、眼科焼灼を使用して硬口蓋の正中線に2.0 x 1.5mmの全層粘膜損傷が誘発されました。実験を成功させるためには、ONFのサイズを制御し、出血を最小限に抑えることが重要でした。ONFモデルの有効性の検証は、解剖学的評価と機能的評価の両方を含む、術後7日目に実施されました。口腔内に鼻中隔が存在し、口腔内に注射した際の鼻孔からの滅菌水の流出により、ONFモデルの確立に成功しました。このモデルは、死亡率が低く、体重が有意に変化し、ONFサイズの変動が最小限であることを特徴とする、実用的で成功した口腔鼻腔瘻を実証しました。今後の研究では、口蓋創傷治癒のメカニズムを解明し、口腔鼻腔瘻の新しい治療法を探求するために、この方法論の採用を検討する可能性があります。

概要

口腔と鼻腔の間の異常な開口部である口腔瘻(ONF)は、臨床的には歯槽突起から口蓋垂までの構造領域の欠損として現れ、口蓋裂修復後の合併症として一般的に^{発生します1。}ONFの患者は、食物逆流、構音障害、および咽頭機能障害を経験し、生活の質に大きな影響を与えます^2,3,4。術後ONFの割合は、裂け目の幅、Veauタイプ、および手術方法5,6,7,8などの要因により、2.4%から55%の範囲です。さらに、ONF修復後の再発率は0%から43%の範囲で高くなっています⁹。

最近、さまざまな材料、薬物、および新しい技術を含む、いくつかの新しい治療法がONFの分野で有望であることが示されています10,11,12,13,14,15,16,17。治療効果の正確な評価は、ONF治療の選択とさらなる開発の基礎となるため、不可欠です。しかし、ONFの特性は患者によって異なるため、手術以外の治療効果について短期的に有効な評価を得ることは困難です。したがって、これらの治療法の有効性を検証するためには、ONF疾患モデルの確立が必要である。

数十年にわたり、研究者は、ラット^18,19、子豚^20,21、ミニブタ22、イヌ²³など、さまざまな動物種で口鼻瘻(ONF)モデルを作成してきました。しかし、マウスはヒトと類似した遺伝子配列と全ゲノムを持っているため、新薬の研究開発のための重要なモデルとなっています24,25,26。さらに、マウスはバッチ間のばらつきがほとんどないため、ONFモデル^12,13,27を確立するのに有利な選択肢となります。

ただし、ONFを作成するための詳細な手順は記載されておらず、ONFサイズの安定性は考慮されていませんでした。さらに、ONF形成の検証は観察のみに依存しており、口腔と鼻腔の間の直接的なコミュニケーションは保証されていませんでした²⁸。ONFによる摂食困難によるマウスの体重減少など、他の手段では実証されなかった。さらに、創傷治癒を促進または阻害する薬物または材料の研究に不可欠な創傷サイズの正常な変動は考慮されていませんでした。したがって、安定した検証済みのONFモデルを確立することが強く求められています。

本研究の目的は、上記の課題に対応する実用的なONFモデルの開発であり、このプロトコルが口蓋創傷治癒のメカニズムとONFの新しい治療法に関する将来の研究の基礎となることを期待しています。

プロトコル

この研究のすべての動物手順は、四川大学西中国口腔病学学校の倫理委員会によってレビューおよび承認されました。本研究では、成体C57BL/6マウス(雌)を用いた。

1.手術の準備

1. 手術に必要な手術器具を集めます:発芽器、眼科用焼灼、顕微手術用ハサミ、顕微手術用ピンセット、注射器、針(26 g x 0.63インチ)(図1A、B)( 材料表を参照)。
   注意: 外科的処置の前に、眼科用焼灼、マイクロサージェリーピンセット、マイクロサージェリーハサミなどの手術器具を102.9 kPa(1.05 kg / cm²)および121°Cで20分間オートクレーブします。
2. 手術用ドレープ、ラテックス手袋、滅菌綿、滅菌シート、滅菌金属ホイル、手術用プラットフォームとしての発泡スチロールボード、輪ゴム(医療用ラテックス手袋を引き裂くことで入手できる)、テープ(図1C)( 材料表を参照)など、必要な手術用品を集めます。
   注意:手術野用の注射器や滅菌シートなど、マウスごとに個別の消耗品セットを使用してください。
3. 手術部位と器具(光源、発泡スチロールボード、温度維持装置、 材料表を参照)をアルコールワイプを使用して清掃します。手順中に必要になる可能性のある器具のノブとハンドルを滅菌金属ホイルで覆います。
4. 個々の器具を無菌的に開き、手術領域に慎重に配置します。発芽器( 材料表を参照)と、手順中に使用するライトをアクティブにします。眼科用焼灼を発芽器に入れ、250°Cで20分間加熱します。

2.外科的処置

1. マウスの固定を行い、以下の手順で口腔を開きます。
   1. 体重20〜25g、8〜12週齢のメスのC57BL/6Jマウスを選択します。手順を実行する前に、マウスを7日間保管してください。
   2. ゾレチル50(80 mg / kg)およびキシラジン(5 mg / kg)の腹腔内注射によりマウスに麻酔をかけます( 材料表を参照)。マウスの目に眼科用軟膏を塗ります。つま先をつまむ反応がなくなるまで待ちます。
      メモ: マウスは、単独でひっくり返すことができない場合、手順の準備ができています。
   3. 滅菌シートで裏打ちされた発泡スチロールボードにマウスを固定します。テープを使用して、マウスを仰臥位で手術台に結び付けます(図2A)。
   4. マウスの口腔を開きます。2本の針(26 g x 0.63インチ)を眼窩耳面の前に置き、さらに2本の針をその後ろに置きます。針の周りに輪ゴムを置き、切歯を交差させて口を開いたままにします。マイクロサージェリーピンセットを使用して、口角を平らげて開きます(図2B)。
      注意: 硬口蓋がはっきりと露出していることを確認してください。舌を輪ゴムの下に固定して、視野の遮蔽やその後の実験中の火傷を防ぎます。
2. 硬口蓋に口鼻腔瘻(ONF)を作成します(図3A-F)。
   1. 250°Cで20分間加熱した眼科用焼灼を取り出します。口蓋の正中線と第一小臼歯の線の交点から1mm離して焼灼の先端を置き、正中線の硬口蓋に全層粘膜損傷を作成します。
      注意: マウスの舌をやけどしないでください。
   2. 数秒後、焼灼先端の粘膜が白くなったら眼科焼灼を抜去します。
   3. 眼科用焼灼を発芽器に入れ、250°Cで10分間加熱し続けます。前の手順を繰り返して、長さが2.0mm、幅が1.5mmになるまで、端の周りの傷を拡大します。
      注意: 各エクステンションは、最後の怪我の端に従う必要があります。ノギスを使用して、怪我の長さと幅を測定します。怪我は口蓋の10%を覆う必要があります。
   4. マイクロサージェリーハサミを使用して、創傷の周りの余分な変性軟部組織を取り除きます。滅菌綿を使用して、マウスの出血を止め、吸入窒息を防ぎます。創傷を測定して、正中線で2.0 x 1.5 mmの全層硬口蓋粘膜損傷を形成していることを確認します。

3. 術後のケア

1. 術後覚醒時にメロキシカムをマウスに投与し、5 mg / kg / dの用量で3日間、皮下投与します²⁹。.
2. マウスが完全に意識を取り戻すまで、温度維持装置の上にマウスを置きます。
   メモ: マウスが呼吸しやすい位置にあることを確認してください。マウスを10〜15分ごとに回転させて、血液が溜まったり、肺葉がつぶれたりするのを防ぎます。マウスが温まったら、ケージに戻します。マウスが消費できるように、ケージの底に滅菌ゼリーと照射された飼料を提供します。

4.口腔鼻腔瘻の生成の検証

注:口腔鼻腔瘻(ONF)の作成の成功は、外科的処置の7日目に評価されます。

1. 輪ゴム、テープ、注射器、外科用ドレープ、ラテックス手袋、滅菌シート、滅菌金属ホイル、発泡スチロールボードなど、必要な手術用品を準備します。
2. 無菌状態を維持するために、外科用ドレープと滅菌手袋を着用してください。発泡スチロールボード、光源、温度維持装置をアルコールで消毒します。
3. ゾレチル50(80 mg / kg)の腹腔内注射による全身麻酔を誘発します。.つま先をつまむ反応がなくなるまで待ちます。ステップ2.1.3および2.1.4で説明したのと同じ方法を使用して、マウスを固定し、硬口蓋を露出させます。
4. 解剖学的構造検証は、創傷部位に中隔がまだ見えることを確認し、ONFの作成が成功したことを示します(図4A、B)。
5. 機能検証を行う:マウスの口腔を閉じ、滅菌シリンジを使用して口腔内に滅菌水を注入します。ONFの生成が成功したのは、マウスの鼻孔から液体が流れたときです。
6. マウスが完全に意識を取り戻すまで、温度維持装置(37°C)の上にマウスを置きます。マウスを10〜15分ごとに回転させて、血液が溜まったり、肺葉がつぶれたりするのを防ぎます。

結果

この実験法の実現可能性と安定性を評価するために、10匹のマウスで同様の手順を実行し、死亡率、創傷サイズの変化、体重、および組織学的分析に関する観察を行いました。マウスは7日目に安楽死させた。

この手順は低い死亡率を示しました。図1A-Cに示されている眼科焼灼と発芽器は、この実験で使用された主要な器具...

ディスカッション

研究者は、ONF 10、11、¹²、13、^14、15、16、¹⁷を治療するためのさまざまな材料、薬物^、および新しい技術を探求してきました。外科的処置の進歩により、ONFの発生率と再発は減少しています。し...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Germinator	Electron Microscopy Sciences	66118-20	Heating and disinfection equipment
Latex gloves	Allmed		or similar
Lights	Olympus	A1813
Meloxicam	MedChemExpress	HY-B0261	crushed; 5 mg/kg
Microsurgical instruments (scissors and tweezers)	Jiangsu Tonghui Medical Devices Co.	M-Y-0087	Surgical instrument
Ophthalmologic cautery	Suqian Wenchong Medical Equipment Co.	1.00234E+13	Surgical instrument
Sterile cotton,	Yancheng Begu Technology Co.		or similar
Sterile metal foil	Biosharp		or similar
Sterile sheets	3M	XH003801129	or similar
Surgical drapes	Yancheng Begu Technology Co.		or similar
Syringes	Yancheng Begu Technology Co.	S-015301	or similar
Tape	Bkmamlab		or similar
Temperature maintenance device	Harvard Apparatus	LE-13-2104
Zoletil50	Virbac		80 mg/kg