Oronazal Fistül Fare Modelinin Oluşturulması

Özet

Bu makale, oronazal fistüllü bir fare modeli oluşturmak için adım adım bir prosedürü özetlemektedir. Oronazal fistül, sert damağın orta hat kısmına zarar vermek için ısıtılmış oftalmolojik koter kullanılarak oluşturulmuştur ve bu da ağız ve burun boşlukları arasında bir açıklık oluşmasına neden olur.

Özet

Bu çalışmada oronazal fistüllerin araştırılmasında uygulanabilir bir model geliştirmek için ısıtılmış oftalmolojik koter kullanılan bir yöntem sunulmuştur. Oronazal fistül (ONF) modelini oluşturmak için C57BL/6 fareler kullanıldı. ONF'yi oluşturmak için fareler uyuşturuldu, hareketsiz hale getirildi ve sert damakları açığa çıkarıldı. Cerrahi işlem sırasında oftalmolojik koter kullanılarak sert damak orta hattında 2.0 x 1.5 mm boyutlarında tam kat mukozal yaralanma indüklendi. Deneyin başarısını sağlamak için ONF'nin boyutunu kontrol etmek ve kanamayı en aza indirmek çok önemliydi. ONF modelinin etkinliğinin doğrulanması, hem anatomik hem de fonksiyonel değerlendirmeleri kapsayacak şekilde ameliyattan sonraki 7. günde gerçekleştirildi. Oral kavite içinde nazal septumun varlığı ve oral kaviteye enjeksiyon üzerine burun deliklerinden steril su çıkışı, ONF modelinin başarılı bir şekilde kurulduğunu doğruladı. Model, düşük mortalite oranı, önemli ağırlık değişiklikleri ve ONF boyutunda minimal varyasyon ile karakterize pratik ve başarılı bir oronazal fistül gösterdi. Gelecekteki çalışmalar, damak yara iyileşmesinin mekanizmalarını aydınlatmak ve oronazal fistüller için yeni tedavileri keşfetmek için bu metodolojiyi benimsemeyi düşünebilir.

Giriş

Oral ve nazal boşluklar arasında anormal bir açıklık olan oronazal fistül (ONF), klinik olarak alveoler süreçten uvulaya kadar olan yapısal bir alanda defekt olarak kendini gösterir ve genellikle yarık damak onarımını takiben bir komplikasyon olarak ortaya çıkar¹. ONF'li hastalar gıda reflüsü, artikülasyon bozuklukları ve bozulmuş velofaringeal fonksiyon yaşarlar^ve bu da yaşam kalitelerini önemli ölçüde etkiler ^2,3,4. Yarık genişliği, Veau tipi, cerrahi yöntem 5,6,7,8 gibi faktörlere bağlı olarak postoperatif ONF oranı %^2,4 ile %55 arasında değişmektedir. Ek olarak, ONF onarımı sonrası nüks oranı yüksektir ve %0 ile %43 arasında ^{değişmektedir9}.

Son zamanlarda ONF alanında farklı materyaller, ilaçlar ve yeni teknikler^dahil olmak üzere birçok yeni tedavi umut vaat etmektedir 10,11,12,13,14,15,16,17. Terapötik etkilerin doğru değerlendirilmesi, ONF tedavilerinin seçilmesi ve daha da geliştirilmesi için temel oluşturduğu için esastır. Bununla birlikte, ONF'lerin özellikleri farklı hastalar arasında farklılık gösterdiğinden, ameliyat dışındaki terapötik etkiler için kısa vadede geçerli bir değerlendirme elde etmek zordur. Bu nedenle, bu tedavi yöntemlerinin etkinliğini doğrulamak için bir ONF hastalığı modeli oluşturmak gereklidir.

Birkaç on yıl boyunca, araştırmacılar sıçanlar^18,19, domuz yavruları^20,21, mini domuzlar 22 ve köpekler²³ dahil olmak üzere çeşitli hayvan türlerinde oronazal fistül (ONF) modelini oluşturdular^, çünkü bu türler cerrahi manipülasyon için uygun önemli bir sert damağa sahiptir. Bununla birlikte, fareler, insanlarınkine benzer bir genetik diziye ve tüm genoma sahiptir, bu da onları yeni ilaçların araştırılması ve geliştirilmesi için önemli bir model haline getirir^24,25,26. Ayrıca, fareler partiden partiye çok az varyasyon sunar, bu da onları ONF modeli ^12,13,27'yi oluşturmak için uygun bir seçim haline getirir.

Bununla birlikte, ONF oluşturmak için ayrıntılı adımlar açıklanmadı ve ONF boyutunun kararlılığı dikkate alınmadı. Ek olarak, ONF oluşumunun doğrulanması, ağız ve burun boşlukları arasında doğrudan iletişim sağlamadan yalnızca gözlem^28'e dayanıyordu. ONF'nin neden olduğu yeme güçlüğü nedeniyle farenin vücut ağırlığını kaybetmesi gibi başka yollarla gösterilmedi. Ayrıca, yara iyileşmesini destekleyen veya engelleyen ilaçlar veya materyaller üzerinde yapılan çalışmalar için çok önemli olan yara boyutundaki normal varyasyon dikkate alınmamıştır. Bu nedenle, kararlı ve doğrulanmış bir ONF modeli oluşturmaya güçlü bir ihtiyaç vardır.

Bu çalışmanın amacı, bu protokolün damak yara iyileşmesi mekanizmaları ve ONF için yeni tedaviler üzerine gelecekteki araştırmalar için temel oluşturacağı umuduyla, yukarıda belirtilen sorunları ele alan pratik bir ONF modeli geliştirmekti.

Protokol

Bu çalışmadaki tüm hayvan prosedürleri, Sichuan Üniversitesi Batı Çin Stomatoloji Okulu Etik Komitesi tarafından gözden geçirildi ve onaylandı. Bu çalışma için yetişkin C57BL/6 fareler (dişi) kullanıldı.

1. Cerrahi hazırlık

1. Prosedür için gerekli cerrahi aletleri toplayın: germinatör, oftalmolojik koter, mikrocerrahi makas, mikrocerrahi cımbız, şırınga ve iğneler (26 g x 0.63 inç) (Şekil 1A, B) (bkz.
   NOT: Cerrahi işlemden önce, oftalmolojik koter, mikrocerrahi cımbız ve mikrocerrahi makas dahil olmak üzere cerrahi aletleri 102.9 kPa (1.05 kg/^cm2) ve 121 °C'de 20 dakika otoklavlayın.
2. Gerekli cerrahi malzemeleri toplayın: cerrahi örtüler, lateks eldivenler, steril pamuk, steril çarşaflar, steril metal folyo, cerrahi platform olarak köpük levha, lastik bantlar (tıbbi lateks eldivenin yırtılmasıyla elde edilebilir) ve bant (Şekil 1C) (bkz.
   NOT: Cerrahi alan için şırıngalar ve steril çarşaflar dahil olmak üzere her fare için ayrı bir malzeme seti kullanın.
3. Cerrahi alanı ve aparatı (ışık kaynağı, köpük levha ve sıcaklık bakım cihazı, bkz. Malzeme Tablosu) alkollü mendiller kullanarak temizleyin. İşlem sırasında gerekli olabilecek aletlerin topuzlarını ve kollarını steril metal folyo ile kapatın.
4. Tek tek aletleri aseptik olarak açın ve cerrahi alana dikkatlice yerleştirin. Prosedür sırasında kullanılacak germinatörü ( Malzeme Tablosuna bakın) ve ışıkları etkinleştirin. Oftalmolojik koteri germinatöre yerleştirin ve 20 dakika boyunca 250 °C'ye ısıtın.

2. Cerrahi prosedür

1. Farenin fiksasyonunu gerçekleştirin ve aşağıdaki adımları izleyerek ağız boşluğunu açın.
   1. 20-25 g ağırlığında ve 8-12 haftalık bir dişi C57BL/6J fare seçin. Herhangi bir işlem yapmadan önce fareyi 7 gün boyunca tutun.
   2. Fareyi intraperitoneal Zoletil50 (80 mg / kg) ve Xylazine (5 mg / kg) enjeksiyonu ile uyuşturun (bkz. Farenin gözüne oftalmik göz merhemi sürün. Ayak parmağını kıstırma tepkisi kalmayana kadar bekleyin.
      NOT: Fare, bağımsız olarak dönemediğinde prosedür için hazırdır.
   3. Fareyi steril çarşaflarla kaplı bir köpük levhaya sabitleyin. Fareyi sırtüstü pozisyonda cerrahi platforma bağlamak için bant kullanın (Şekil 2A).
   4. Farenin ağız boşluğunu açın. Yörünge kulak düzleminin önüne iki iğne (26 g x 0.63 inç) ve arkasına iki iğne daha yerleştirin. İğnelerin etrafına bir lastik bant yerleştirin ve ağzı açık tutmak için kesici dişleri çaprazlayın. Ağzın köşelerini açmak için mikrocerrahi cımbız kullanın (Şekil 2B).
      NOT: Sert damağın net bir şekilde açıkta olduğundan emin olun. Sonraki deneyler sırasında görüş alanının engellenmesini ve yanmasını önlemek için dili lastik bandın altına sabitleyin.
2. Sert damakta oronazal fistül (ONF) oluşturun (Şekil 3A-F).
   1. 20 dakika boyunca 250 ° C'ye ısıtılmış oftalmolojik koterleri alın. Koter ucunu, damağın orta hattı ile birinci premolar hattının kesişme noktasından 1 mm uzağa yerleştirin ve orta hatta sert damakta tam kalınlıkta bir mukozal yaralanma oluşturun.
      NOT: Farenin dilini haşlamaktan kaçının.
   2. Birkaç saniye sonra, koter ucunun etrafındaki mukoza beyazlaştığında oftalmolojik koteri çıkarın.
   3. Oftalmolojik koteri germinatöre yerleştirin ve 10 dakika boyunca 250 °C'ye ısıtmaya devam edin. Yarayı 2,0 mm uzunluğa ve 1,5 mm genişliğe ulaşana kadar kenarlarda büyütmek için önceki adımı tekrarlayın.
      NOT: Her uzatma, son yaralanmanın kenarını takip etmelidir. Yaralanmanın uzunluğunu ve genişliğini ölçmek için sürmeli bir kumpas kullanın. Yaralanma damağın %10'unu kaplamalıdır.
   4. Yaranın etrafındaki fazla denatüre yumuşak dokuyu çıkarmak için mikrocerrahi makas kullanın. Kanamayı durdurmak ve farenin solunmasını önlemek için steril pamuk kullanın. Orta hatta 2.0 x 1.5 mm ölçülerinde tam kalınlıkta sert damak mukozal yaralanması oluşturduğundan emin olmak için yarayı ölçün.

3. Ameliyat sonrası bakım

1. Ameliyat sonrası uyanma sırasında fareye Meloksikam'ı 3 gün boyunca 5 mg / kg / gün dozunda, deri altından^{uygulayın 29}.
2. Fareyi, bilincini tamamen geri kazanana kadar bir sıcaklık bakım cihazına yerleştirin.
   NOT: Farenin nefes almayı kolaylaştıracak şekilde yerleştirildiğinden emin olun. Kan birikmesini veya akciğer loblarının çökmesini önlemek için fareleri her 10-15 dakikada bir döndürün. Fare ısındıktan sonra kafesine geri koyun. Farelerin tüketmesi için kafesin dibinde steril jöle ve ışınlanmış yem sağlayın.

4. Oronazal fistül oluşumunun doğrulanması

NOT: Oronazal fistül (ONF) oluşturma başarısı cerrahi işlemi takip eden 7. günde değerlendirilir.

1. Gerekli cerrahi malzemeleri hazırlayın: lastik bant, bant, şırıngalar, cerrahi örtüler, lateks eldivenler, steril çarşaflar, steril metal folyo ve köpük levha.
2. Aseptik koşulları korumak için cerrahi örtüler ve steril eldivenler giyin. Köpük levhayı, ışık kaynağını ve sıcaklık bakım cihazını alkolle dezenfekte edin.
3. Zoletil50'nin (80 mg / kg) intraperitoneal enjeksiyonu ile genel anesteziyi indükleyin. Ayak parmağını kıstırma tepkisi kalmayana kadar bekleyin. Fareyi hareketsiz hale getirmek ve sert damağı ortaya çıkarmak için adım 2.1.3 ve 2.1.4'te açıklanan yöntemin aynısını kullanın.
4. Septumun yara bölgesinde hala görünür olduğundan emin olarak anatomik yapısal doğrulama yapın, bu da başarılı ONF oluşumunu gösterir (Şekil 4A, B).
5. İşlevsel doğrulama yapın: farenin ağız boşluğunu kapatın ve steril bir şırınga kullanarak ağız boşluğuna steril su enjekte edin. ONF'nin başarılı bir şekilde oluşturulması, farenin burun deliklerinden sıvı aktığında doğrulanır.
6. Fareyi, bilinci tamamen yerine gelene kadar sıcaklık bakım cihazına (37 °C) yerleştirin. Kan birikmesini veya akciğer loblarının çökmesini önlemek için fareleri her 10-15 dakikada bir döndürün.

Sonuçlar

Bu deneysel yöntemin fizibilitesini ve stabilitesini değerlendirmek için on fare üzerinde aynı prosedür uygulandı ve mortalite, yara boyutundaki değişiklikler, vücut ağırlığı ve histolojik analiz ile ilgili gözlemler yapıldı. Farelere 7. günde ötenazi uygulandı.

Prosedür düşük bir mortalite oranı sergiledi. Şekil 1A-C'de gösterilen oftalmolojik koter ve germinatör, bu deneyde kullanılan anahtar araçl...

Tartışmalar

Araştırmacılar, ONF 10,11,12,13,14,15,16,17'yi tedavi etmek için çeşitli materyaller^, ilaçlar ve yeni teknikler araştırdılar. Cerrahi işlemlerdeki gelişmelerle ONF'nin insidansı ve nüksü azalmıştır. Bununla birlikte, hastalığın benzers...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Germinator	Electron Microscopy Sciences	66118-20	Heating and disinfection equipment
Latex gloves	Allmed		or similar
Lights	Olympus	A1813
Meloxicam	MedChemExpress	HY-B0261	crushed; 5 mg/kg
Microsurgical instruments (scissors and tweezers)	Jiangsu Tonghui Medical Devices Co.	M-Y-0087	Surgical instrument
Ophthalmologic cautery	Suqian Wenchong Medical Equipment Co.	1.00234E+13	Surgical instrument
Sterile cotton,	Yancheng Begu Technology Co.		or similar
Sterile metal foil	Biosharp		or similar
Sterile sheets	3M	XH003801129	or similar
Surgical drapes	Yancheng Begu Technology Co.		or similar
Syringes	Yancheng Begu Technology Co.	S-015301	or similar
Tape	Bkmamlab		or similar
Temperature maintenance device	Harvard Apparatus	LE-13-2104
Zoletil50	Virbac		80 mg/kg