Etablierung eines Oronasale Fistel-Mausmodells

Zusammenfassung

In diesem Artikel wird eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Etablierung eines Mausmodells mit einer Mund-Nasen-Fistel beschrieben. Die oronasale Fistel wurde durch den Einsatz eines erhitzten ophthalmologischen Kauters erzeugt, um den Mittellinienteil des harten Gaumens zu schädigen, was zur Bildung einer Öffnung zwischen Mund- und Nasenhöhle führte.

Zusammenfassung

In dieser Studie wird eine Methode vorgestellt, bei der erhitzter ophthalmologischer Kauter verwendet wird, um ein tragfähiges Modell für die Untersuchung oronasaler Fisteln zu entwickeln. C57BL/6-Mäuse wurden verwendet, um das Modell der oronasalen Fistel (ONF) zu etablieren. Um die ONF zu erzeugen, wurden die Mäuse betäubt, immobilisiert und ihre harten Gaumen freigelegt. Während des chirurgischen Eingriffs wurde eine 2,0 x 1,5 mm große Schleimhautverletzung in voller Dicke in der Mittellinie des harten Gaumens mittels ophthalmologischem Kauter induziert. Es war entscheidend, die Größe des ONF zu kontrollieren und Blutungen zu minimieren, um den Erfolg des Experiments sicherzustellen. Die Überprüfung der Wirksamkeit des ONF-Modells wurde am 7. Tag nach der Operation durchgeführt und umfasste sowohl anatomische als auch funktionelle Beurteilungen. Das Vorhandensein der Nasenscheidewand in der Mundhöhle und der Abfluss von sterilem Wasser aus den Nasenlöchern bei Injektion in die Mundhöhle bestätigten die erfolgreiche Etablierung des ONF-Modells. Das Modell zeigte eine praktische und erfolgreiche Mund-Nasen-Fistel, die durch eine niedrige Mortalitätsrate, signifikante Gewichtsveränderungen und minimale Variationen in der ONF-Größe gekennzeichnet ist. Zukünftige Studien könnten die Anwendung dieser Methodik in Betracht ziehen, um die Mechanismen der Wundheilung am Gaumen aufzuklären und neue Behandlungen für oronasale Fisteln zu erforschen.

Einleitung

Die oronasale Fistel (ONF), eine abnorme Öffnung zwischen Mund- und Nasenhöhle, manifestiert sich klinisch als Defekt in einem strukturellen Bereich vom Alveolarfortsatz bis zum Zäpfchen, der häufig als Komplikation nach einer Gaumenspaltenreparatur auftritt¹. Patienten mit ONF leiden unter Nahrungsreflux, Artikulationsstörungen und einer Beeinträchtigung der velopharyngealen Funktion, was ihre Lebensqualität erheblich beeinträchtigt ^2,3,4. Die postoperative ONF-Rate liegt zwischen 2,4 % und 55 %, was auf Faktoren wie Spaltbreite, Veau-Typ und Operationsmethode zurückzuführen^ist 5,6,7,8. Darüber hinaus ist die Rezidivrate nach einer ONF-Reparatur hoch und liegt zwischen 0 % und 43 %⁹.

Mehrere neuartige Behandlungen haben sich in letzter Zeit auf dem Gebiet der ONF als vielversprechend erwiesen, darunter verschiedene Materialien, Medikamente und neuartige Techniken 10,11,12,13,14,15,16,17. Eine genaue Bewertung der therapeutischen Effekte ist von entscheidender Bedeutung, da sie die Grundlage für die Auswahl und Weiterentwicklung von ONF-Behandlungen bildet. Es ist jedoch schwierig, kurzfristig eine valide Bewertung für andere therapeutische Wirkungen als die Operation zu erhalten, da die Eigenschaften von ONFs von Patient zu Patient unterschiedlich sind. Daher ist die Etablierung eines ONF-Krankheitsmodells notwendig, um die Wirksamkeit dieser Behandlungsmethoden zu überprüfen.

Seit mehreren Jahrzehnten haben Forscher das Modell der oronasalen Fistel (ONF) bei verschiedenen Tierarten entwickelt, darunter Ratten^18,19, Ferkel 20,21, Minischweine²² und Hunde ²³, da diese Arten einen beträchtlichen harten Gaumen besitzen^, der für chirurgische Eingriffe geeignet ist. Mäuse haben jedoch eine genetische Sequenz und ein vollständiges Genom, die dem des Menschen ähneln, was sie zu einem wichtigen Modell für die Erforschung und Entwicklung neuer Medikamente macht^24,25,26. Darüber hinaus bieten Mäuse nur geringe Variationen von Charge zu Charge, was sie zu einer günstigen Wahl für die Etablierung des ONF-Modells^12,13,27 macht.

Die detaillierten Schritte zur Erstellung von ONF wurden jedoch nicht beschrieben, und die Stabilität der ONF-Größe wurde nicht berücksichtigt. Darüber hinaus stützte sich der Nachweis der ONF-Bildung ausschließlich auf die Beobachtung²⁸, ohne eine direkte Kommunikation zwischen der Mund- und der Nasenhöhle zu gewährleisten. Es wurde nicht mit anderen Mitteln nachgewiesen, wie z. B. dem Verlust des Körpergewichts der Maus aufgrund von Schwierigkeiten beim Fressen, die durch die ONF verursacht wurden. Darüber hinaus wurde die normale Variation der Wundgröße nicht berücksichtigt, was für Studien zu Medikamenten oder Materialien, die die Wundheilung fördern oder hemmen, von entscheidender Bedeutung ist. Daher besteht ein dringender Bedarf an der Etablierung eines stabilen und validierten ONF-Modells.

Das Ziel dieser Studie war es, ein praktisches ONF-Modell zu entwickeln, das die oben genannten Probleme adressiert, in der Hoffnung, dass dieses Protokoll als Grundlage für zukünftige Forschungen zu den Mechanismen der palatinalen Wundheilung und neuartigen Behandlungen für ONF dienen wird.

Protokoll

Alle tierexperimentellen Verfahren in dieser Studie wurden vom Ethikkomitee der West China School of Stomatology der Universität Sichuan geprüft und genehmigt. Für die vorliegende Studie wurden adulte C57BL/6 Mäuse (weiblich) verwendet.

1. Chirurgische Vorbereitung

1. Stellen Sie die für den Eingriff erforderlichen chirurgischen Instrumente zusammen: Keimer, ophthalmologische Kauter, mikrochirurgische Scheren, mikrochirurgische Pinzetten, Spritzen und Nadeln (26 g x 0,63 Zoll) (Abbildung 1A,B) (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Autoklavieren Sie vor dem chirurgischen Eingriff die chirurgischen Instrumente, einschließlich des ophthalmologischen Kauters, der mikrochirurgischen Pinzette und der mikrochirurgischen Schere, bei 102,9 kPa (1,05 kg/^cm2) und 121 °C für 20 Minuten.
2. Sammeln Sie das erforderliche chirurgische Material: OP-Abdeckungen, Latexhandschuhe, sterile Baumwolle, sterile Bettwäsche, sterile Metallfolie, Schaumstoffplatte als chirurgische Plattform, Gummibänder (die durch Zerreißen eines medizinischen Latexhandschuhs erhalten werden können) und Klebeband (Abbildung 1C) (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Verwenden Sie für jede Maus ein separates Zubehör, einschließlich Spritzen und steriler Tücher für das Operationsfeld.
3. Reinigen Sie den Operationsbereich und die Apparatur (Lichtquelle, Schaumstoffplatte und Temperaturerhaltungsgerät, siehe Materialtabelle) mit Alkoholtüchern. Decken Sie die Knöpfe und Griffe von Instrumenten, die während des Eingriffs erforderlich sein können, mit steriler Metallfolie ab.
4. Öffnen Sie die einzelnen Instrumente aseptisch und positionieren Sie sie vorsichtig im Operationsgebiet. Aktivieren Sie den Keimer (siehe Materialtabelle) und die Lampen für die Verwendung während des Eingriffs. Den ophthalmologischen Kauter in den Keimer geben und 20 min lang auf 250 °C erhitzen.

2. Chirurgischer Eingriff

1. Führen Sie die Fixierung der Maus durch und öffnen Sie die Mundhöhle, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
   1. Wählen Sie eine weibliche C57BL/6J-Maus mit einem Gewicht von 20-25 g und einem Alter von 8-12 Wochen. Bringen Sie die Maus 7 Tage lang unter, bevor Sie Eingriffe durchführen.
   2. Die Maus wird durch intraperitoneale Injektion von Zoletil50 (80 mg/kg) und Xylazin (5 mg/kg) anästhesiert (siehe Materialtabelle). Tragen Sie Augensalbe auf das Auge der Maus auf. Warten Sie, bis Sie nicht mehr auf das Einklemmen der Zehen reagieren.
      HINWEIS: Die Maus ist bereit für den Vorgang, wenn sie nicht in der Lage ist, sich selbstständig umzudrehen.
   3. Befestigen Sie die Maus auf einer mit sterilen Laken ausgekleideten Schaumstoffplatte. Verwenden Sie Klebeband, um die Maus in Rückenlage an der chirurgischen Plattform zu befestigen (Abbildung 2A).
   4. Öffnen Sie die Mundhöhle der Maus. Positionieren Sie zwei Nadeln (26 g x 0,63 Zoll) vor der Augenhöhle und zwei weitere dahinter. Legen Sie ein Gummiband um die Nadeln und kreuzen Sie die Schneidezähne, um den Mund offen zu halten. Verwenden Sie eine mikrochirurgische Pinzette, um die Mundwinkel zu öffnen (Abbildung 2B).
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der harte Gaumen deutlich freiliegt. Befestigen Sie die Zunge unter dem Gummiband, um eine Behinderung des Sichtfeldes und ein Verbrennen bei nachfolgenden Experimenten zu vermeiden.
2. Erzeugen Sie die oronasale Fistel (ONF) am harten Gaumen (Abbildung 3A-F).
   1. Entnehmen Sie den ophthalmologischen Kauter, der 20 Minuten lang auf 250 °C erhitzt wurde. Platzieren Sie die Kauterspitze 1 mm vom Schnittpunkt der Mittellinie des Gaumens und der Linie des ersten Prämolaren entfernt, wodurch eine Schleimhautverletzung des harten Gaumens in der Mittellinie entsteht.
      HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Zunge der Maus zu verbrühen.
   2. Entfernen Sie nach einigen Sekunden den ophthalmologischen Kauter, wenn die Schleimhaut um die Kauterspitze weiß wird.
   3. Den ophthalmologischen Kauter in den Keimer geben und 10 Minuten lang auf 250 °C erhitzen. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt, um die Wunde an den Rändern zu vergrößern, bis sie eine Länge von 2,0 mm und eine Breite von 1,5 mm erreicht.
      HINWEIS: Jede Verlängerung sollte der Kante der letzten Verletzung folgen. Verwenden Sie einen Messschieber, um die Länge und Breite der Verletzung zu messen. Die Verletzung sollte 10% des Gaumens bedecken.
   4. Verwenden Sie eine mikrochirurgische Schere, um überschüssiges denaturiertes Weichgewebe um die Wunde herum zu entfernen. Verwenden Sie sterile Watte, um Blutungen zu stoppen und ein Einatmen des Erstickens der Maus zu verhindern. Messen Sie die Wunde, um sicherzustellen, dass sie eine Verletzung der harten Gaumenschleimhaut in voller Dicke bildet, die 2,0 x 1,5 mm in der Mittellinie misst.

3. Nachsorge

1. Verabreichen Sie der Maus Meloxicam zum Zeitpunkt des postoperativen Aufwachens in einer Dosis von 5 mg/kg/d für 3 Tage subkutan²⁹.
2. Legen Sie die Maus auf ein Temperaturerhaltungsgerät, bis sie wieder vollständig zu Bewusstsein kommt.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Maus so positioniert ist, dass das Atmen erleichtert wird. Drehen Sie die Mäuse alle 10-15 Minuten, um Blutansammlungen oder Kollaps der Lungenlappen zu verhindern. Sobald sich die Maus aufgewärmt hat, setzen Sie sie wieder in ihren Käfig zurück. Stellen Sie steriles Gelee und bestrahltes Futter am Boden des Käfigs bereit, damit die Mäuse es fressen können.

4. Überprüfung der Entstehung der Mund-Nasen-Fistel

HINWEIS: Der Erfolg der Bildung der Mund-Nasen-Fistel (ONF) wird am 7. Tag nach dem chirurgischen Eingriff beurteilt.

1. Bereiten Sie die notwendigen chirurgischen Utensilien vor: Gummiband, Klebeband, Spritzen, OP-Abdecktücher, Latexhandschuhe, sterile Laken, sterile Metallfolie und Schaumstoffplatte.
2. Tragen Sie OP-Abdecktücher und sterile Handschuhe, um die aseptischen Bedingungen aufrechtzuerhalten. Desinfizieren Sie die Schaumstoffplatte, die Lichtquelle und das Temperaturerhaltungsgerät mit Alkohol.
3. Induktion einer Vollnarkose durch intraperitoneale Injektion von Zoletil50 (80 mg/kg). Warten Sie, bis Sie nicht mehr auf das Einklemmen der Zehen reagieren. Verwenden Sie die gleiche Methode wie in den Schritten 2.1.3 und 2.1.4 beschrieben, um die Maus bewegungsunfähig zu machen und den harten Gaumen freizulegen.
4. Führen Sie eine anatomische Strukturüberprüfung durch, indem Sie sicherstellen, dass das Septum an der Wundstelle noch sichtbar ist, was auf eine erfolgreiche ONF-Bildung hinweist (Abbildung 4A,B).
5. Führen Sie eine Funktionsüberprüfung durch: Schließen Sie die Mundhöhle der Maus und injizieren Sie steriles Wasser mit einer sterilen Spritze in die Mundhöhle. Die erfolgreiche Bildung von ONF wird bestätigt, wenn Flüssigkeit aus den Nasenlöchern der Maus fließt.
6. Legen Sie die Maus auf das Temperaturerhaltungsgerät (37 °C), bis sie wieder zu Bewusstsein kommt. Drehen Sie die Mäuse alle 10-15 Minuten, um Blutansammlungen oder Kollaps der Lungenlappen zu verhindern.

Ergebnisse

Um die Durchführbarkeit und Stabilität dieser experimentellen Methode zu beurteilen, wurde das gleiche Verfahren an zehn Mäusen durchgeführt und Beobachtungen hinsichtlich Mortalität, Veränderungen der Wundgröße, des Körpergewichts und der histologischen Analyse gemacht. Die Mäuse wurden am 7. Tag eingeschläfert.

Das Verfahren wies eine niedrige Mortalitätsrate auf. Der ophthalmologische Kauter und der Keimer, die in Abbildung 1A-C

Diskussion

Forscher haben verschiedene Materialien, Medikamente und neuartige Techniken zur Behandlung von ONF 10,11,12,13,14,15,16,17 erforscht. Mit Fortschritten bei den chirurgischen Verfahren konnten die Inzidenz und das Wiederauftreten von ONF reduziert werden. A...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Germinator	Electron Microscopy Sciences	66118-20	Heating and disinfection equipment
Latex gloves	Allmed		or similar
Lights	Olympus	A1813
Meloxicam	MedChemExpress	HY-B0261	crushed; 5 mg/kg
Microsurgical instruments (scissors and tweezers)	Jiangsu Tonghui Medical Devices Co.	M-Y-0087	Surgical instrument
Ophthalmologic cautery	Suqian Wenchong Medical Equipment Co.	1.00234E+13	Surgical instrument
Sterile cotton,	Yancheng Begu Technology Co.		or similar
Sterile metal foil	Biosharp		or similar
Sterile sheets	3M	XH003801129	or similar
Surgical drapes	Yancheng Begu Technology Co.		or similar
Syringes	Yancheng Begu Technology Co.	S-015301	or similar
Tape	Bkmamlab		or similar
Temperature maintenance device	Harvard Apparatus	LE-13-2104
Zoletil50	Virbac		80 mg/kg