Создание модели мышей ороназальной фистулы

Резюме

В данной статье описана пошаговая процедура создания модели мышей с ороназальным свищом. Ороназальный свищ был создан путем использования горячего офтальмологического прижигания, чтобы повредить срединную часть твердого неба, что привело к образованию отверстия между ротовой и носовой полостями.

Аннотация

В данном исследовании представлен метод, использующий офтальмологическое прижигание с подогревом для разработки жизнеспособной модели исследования ороназальных свищей. Мыши C57BL/6 были использованы для создания модели ороназальной фистулы (ONF). Для создания ОНФ мышей обезболивали, обездвиживали и обнажали их твердые нёба. Во время хирургического вмешательства было индуцировано повреждение слизистой оболочки на всю толщину 2,0 х 1,5 мм по средней линии твердого неба с помощью офтальмологического прижигания. Для обеспечения успеха эксперимента было крайне важно контролировать размер ОНФ и свести к минимуму кровотечение. Верификация эффективности модели ОНФ проводилась на 7-е сутки после операции, включая как анатомическую, так и функциональную оценку. Наличие носовой перегородки в полости рта и отток стерильной воды из ноздрей при инъекции в ротовую полость подтвердили успешное создание модели ОНФ. Модель продемонстрировала практичную и успешную ороназальную фистулу, характеризующуюся низким уровнем смертности, значительными изменениями массы тела и минимальными вариациями размера ОНФ. В будущих исследованиях может быть рассмотрен вопрос о применении этой методологии для выяснения механизмов заживления ран неба и изучения новых методов лечения ороназальных свищей.

Введение

Ороназальный свищ (ОНФ), аномальное отверстие между полостью рта и носом, клинически проявляется как дефект в структурной области от альвеолярного отростка до язычка, который обычно возникает как осложнение после коррекции расщелины неба¹. У пациентов с ОНФ наблюдается пищевой рефлюкс, нарушения артикуляции и нарушения функции глоточной ки, что значительно влияет на качество их жизни ^2,3,4. Частота послеоперационного ОНФ колеблется от 2,4% до 55% из-за таких факторов, как ширина расщелины, тип Во и хирургический метод 5,6,7,8. Кроме того, частота рецидивов после операции ОНФ высока и колеблется от 0% до 43%⁹.

Несколько новых методов лечения в последнее время показали многообещающие результаты в области ОНФ, включая различные материалы, лекарства и новые методы 10,11,12,13,14,15,16,17. Точная оценка терапевтических эффектов имеет важное значение, поскольку она обеспечивает основу для выбора и дальнейшей разработки методов лечения ОНФ. Тем не менее, получение достоверной оценки в краткосрочной перспективе терапевтических эффектов, отличных от хирургического вмешательства, является сложной задачей, поскольку характеристики ОНФ различаются у разных пациентов. Таким образом, для проверки эффективности этих методов лечения необходимо создание модели заболевания ОНФ.

В течение нескольких десятилетий исследователи создавали модель ороназальной фистулы (ОНФ) у различных видов животных, включая крыс^18,19, поросят 20,21, минипигов²² и собак ^23, поскольку эти виды обладают значительным твердым нёбом, подходящим для хирургических манипуляций. Тем не менее, мыши имеют генетическую последовательность и весь геном, похожий на человеческий, что делает их важной моделью для исследования и разработки новых лекарств^24,25,26. Кроме того, мыши практически не отличаются от партии к партии, что делает их благоприятным выбором для создания модели ONF^12,13,27.

Однако детальные шаги по созданию ОНФ не были описаны, а стабильность размера ОНФ не была учтена. Кроме того, верификация образования ОНФ основывалась исключительно на наблюдении²⁸, без обеспечения прямой связи между ротовой и носовой полостями. Это не было продемонстрировано другими способами, такими как потеря мышью массы тела из-за трудностей с приемом пищи, вызванных ОНФ. Кроме того, не учитывалась нормальная вариабельность размера раны, что имеет решающее значение для исследований лекарств или материалов, которые способствуют или ингибируют заживление ран. Таким образом, существует острая необходимость в создании стабильной и валидированной модели ONF.

Цель данного исследования состояла в том, чтобы разработать практическую модель ОНФ, которая решает вышеупомянутые вопросы, с надеждой, что этот протокол послужит основой для будущих исследований механизмов заживления небных ран и новых методов лечения ОНФ.

протокол

Все процедуры на животных в этом исследовании были рассмотрены и одобрены Этическим комитетом Западно-Китайской школы стоматологии Сычуаньского университета. Для настоящего исследования использовали взрослых мышей линии C57BL/6 (самок).

1. Хирургическая подготовка

1. Подготовьте необходимые хирургические инструменты для процедуры: проращиватель, офтальмологическое прижигание, микрохирургические ножницы, микрохирургический пинцет, шприцы и иглы (26 г x 0,63 дюйма) (Рисунок 1A, B) (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед хирургической процедурой автоклавируйте хирургические инструменты, включая офтальмологическое прижигание, микрохирургический пинцет и микрохирургические ножницы, при давлении 102,9 кПа (1,05 кг/^см2) и 121 °C в течение 20 минут.
2. Соберите необходимые хирургические принадлежности: хирургические простыни, латексные перчатки, стерильную вату, стерильные простыни, стерильную металлическую фольгу, пенопласт в качестве хирургической платформы, резинки (которые можно получить, разорвав медицинскую латексную перчатку) и скотч (рисунок 1С) (см. таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте отдельный набор расходных материалов для каждой мыши, включая шприцы и стерильные простыни для операционного поля.
3. Очистите операционную область и аппарат (источник света, пенопласт и устройство для поддержания температуры, см. Таблицу материалов) с помощью спиртовых салфеток. Накройте ручки и ручки инструментов, которые могут потребоваться во время процедуры, стерильной металлической фольгой.
4. Асептически откройте отдельные инструменты и осторожно расположите их в области операции. Включите проращиватель (см. Таблицу материалов) и освещение для использования во время процедуры. Поместите офтальмологический прижигатель в проращиватель и нагревайте его до 250 °C в течение 20 минут.

2. Хирургическое вмешательство

1. Выполните фиксацию мыши и откройте ротовую полость, выполнив следующие действия.
   1. Выберите самку мыши C57BL/6J весом 20-25 г в возрасте 8-12 недель. Поместите мышь в дом в течение 7 дней перед проведением любых процедур.
   2. Обезболивайте мышь внутрибрюшинной инъекцией Zoletil50 (80 мг/кг) и ксилазина (5 мг/кг) (см. таблицу материалов). Нанесите офтальмологическую глазную мазь на глаз мыши. Подождите, пока не перестанет быть реакцией защемления пальца ноги.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь готова к процедуре, когда она не может перевернуться самостоятельно.
   3. Закрепите мышь на пенопластовой доске, выстланной стерильными листами. С помощью скотча привяжите мышь к хирургической платформе в положении лежа на спине (рис. 2A).
   4. Откройте ротовую полость мыши. Расположите две иглы (26 г x 0,63 дюйма) перед плоскостью уха и еще две позади нее. Наденьте резинку на иглы и скрестите резцы, чтобы держать рот открытым. Используйте микрохирургический пинцет, чтобы приоткрыть уголки рта (Рисунок 2B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что твердое нёбо четко обнажено. Зафиксируйте язычок под резинкой, чтобы предотвратить загораживание поля зрения и ожоги при последующих экспериментах.
2. Создайте ороназальный свищ (ОНФ) на твердом небе (рисунок 3A-F).
   1. Извлеките офтальмологическое прижигание, нагретое до 250 °C в течение 20 минут. Расположите кончик прижигателя на расстоянии 1 мм от пересечения средней линии неба и линии первого премоляра, создавая повреждение слизистой оболочки твердого неба по всей толщине по средней линии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не обжигайте язык мыши.
   2. Через несколько секунд снимите офтальмологическое прижигание, когда слизистая оболочка вокруг кончика прижигателя побелеет.
   3. Поместите офтальмологический прижигатель в проращиватель и продолжайте нагревать его до 250 °C в течение 10 минут. Повторите предыдущий шаг, чтобы расширить рану по краям, пока она не достигнет длины 2,0 мм и ширины 1,5 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждое разгибание должно следовать за краем последней травмы. С помощью штангенциркуля измерьте длину и ширину травмы. Травма должна охватывать 10% неба.
   4. Используйте микрохирургические ножницы, чтобы удалить излишки денатурированных мягких тканей вокруг раны. Используйте стерильную вату, чтобы остановить кровотечение и предотвратить ингаляционную асфиксию мыши. Измерьте рану, чтобы убедиться, что она образует повреждение слизистой оболочки твердого неба на всю толщину размером 2,0 х 1,5 мм по средней линии.

3. Послеоперационный уход

1. Вводят мелоксикам мышам в момент послеоперационного пробуждения в дозе 5 мг/кг/сут в течение 3 дней, подкожно²⁹.
2. Поместите мышь на устройство поддержания температуры до тех пор, пока она полностью не придет в сознание.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что мышь расположена таким образом, чтобы облегчить дыхание. Чередуйте мышей каждые 10-15 минут, чтобы предотвратить скопление крови или коллапс долей легких. Как только мышь согреется, верните ее в клетку. Обеспечьте мышам стерильное желе и облученный корм на дне клетки.

4. Верификация создания ороназального свища

ПРИМЕЧАНИЕ: Успешность создания ороназальной фистулы (ОНФ) оценивается на 7-й день после хирургического вмешательства.

1. Подготовьте необходимые хирургические принадлежности: резиновую ленту, скотч, шприцы, хирургические простыни, латексные перчатки, стерильные простыни, стерильную металлическую фольгу и пенокартон.
2. Носите хирургические простыни и стерильные перчатки для поддержания асептических условий. Продезинфицируйте пенопластовую плиту, источник света и устройство для поддержания температуры спиртом.
3. Индуцируют общий наркоз путем внутрибрюшинной инъекции Zoletil50 (80 мг/кг). Подождите, пока не перестанет быть реакцией защемления пальца ноги. Используйте тот же метод, что описан в шагах 2.1.3 и 2.1.4, чтобы обездвижить мышь и обнажить твердое небо.
4. Выполните анатомическую структурную проверку, убедившись, что перегородка все еще видна в месте раны, что указывает на успешное создание ОНФ (рис. 4A, B).
5. Выполните функциональную проверку: закройте ротовую полость мыши и введите стерильную воду в ее ротовую полость с помощью стерильного шприца. Успешное создание ОНФ подтверждается, когда жидкость вытекает из ноздрей мыши.
6. Поместите мышь на устройство поддержания температуры (37 °C) до тех пор, пока она полностью не придет в сознание. Чередуйте мышей каждые 10-15 минут, чтобы предотвратить скопление крови или коллапс долей легких.

Результаты

Чтобы оценить осуществимость и стабильность этого экспериментального метода, та же процедура была проведена на десяти мышах, и были проведены наблюдения за смертностью, изменениями размера раны, массы тела и гистологическим анализом. Мышей усыпили на 7-й день.

Процедура ...

Обсуждение

Исследователи изучили различные материалы, лекарства и новые методы лечения ОНФ 10,11,12,13,14,15,16,17. Благодаря достижениям в области хирургическ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Germinator	Electron Microscopy Sciences	66118-20	Heating and disinfection equipment
Latex gloves	Allmed		or similar
Lights	Olympus	A1813
Meloxicam	MedChemExpress	HY-B0261	crushed; 5 mg/kg
Microsurgical instruments (scissors and tweezers)	Jiangsu Tonghui Medical Devices Co.	M-Y-0087	Surgical instrument
Ophthalmologic cautery	Suqian Wenchong Medical Equipment Co.	1.00234E+13	Surgical instrument
Sterile cotton,	Yancheng Begu Technology Co.		or similar
Sterile metal foil	Biosharp		or similar
Sterile sheets	3M	XH003801129	or similar
Surgical drapes	Yancheng Begu Technology Co.		or similar
Syringes	Yancheng Begu Technology Co.	S-015301	or similar
Tape	Bkmamlab		or similar
Temperature maintenance device	Harvard Apparatus	LE-13-2104
Zoletil50	Virbac		80 mg/kg