使用灌注小鼠肝脏模型量化肝葡萄糖生成、尿素生成和脂肪分解

摘要

在这里，我们提出了一种用于小鼠肝脏 原位 灌注的稳健方法，以研究肝脏代谢的急性和直接调节，而不会干扰肝脏结构，但不存在肝外因素。

摘要

肝脏具有多种功能，包括营养代谢。与其他体 外 和 体内 肝脏研究模型相比，分离的灌注肝脏允许研究整个肝脏的肝脏生物学和代谢，具有完整的肝脏结构，不受肝外因素的影响。肝脏灌注最初是为大鼠开发的，但该方法也适用于小鼠。在这里，我们描述了小鼠肝脏 原位 灌注的方案。用含氧的Krebs-Henseleit碳酸氢盐缓冲液通过门静脉对肝脏进行顺行灌注，并从肝上下腔静脉收集输出物，并夹紧肝下腔静脉以关闭回路。使用这种方法，可以用详细的时间分辨率评估测试化合物的直接肝脏效应。肝功能和活力稳定至少3小时，允许在同一实验中加入内部对照。使用该模型的实验可能性很多，可以推断出对肝脏生理学和肝脏疾病的见解。

引言

肝脏是新陈代谢的重要器官。它通过调节葡萄糖、脂质和氨基酸代谢，在控制全身能量平衡方面发挥关键作用。全球肝脏疾病的增加正在成为全球的主要健康负担，需要更多的关于病理生理学及其对肝功能的影响的知识。

已经开发了各种用于肝脏研究的体外模型，以补充体内研究。从啮齿动物和人类中分离和培养的原代肝细胞被广泛使用。非实质细胞可以使用差速离心和梯度离心从肝细胞中分离出来，不同细胞类型的共培养可用于研究细胞间串扰¹。尽管原代人肝细胞被认为是测试药物毒性的金标准，但一些研究表明，肝细胞在组织培养物中迅速去分化，导致肝功能丧失^2,3,4。与传统的 2D 培养系统相比，3D 球状体系统中的肝细胞培养可改善去分化，更稳定，并且似乎在更高程度上模拟体内肝脏⁵。精确切割的肝切片是另一种成熟的体外模型，可保持组织结构完整并包含肝脏中存在的非实质细胞⁶。更先进的体外模型包括肝脏芯片⁷ 和肝脏类器官⁸。....

研究方案

所有动物实验均在丹麦环境和食品部丹麦动物实验监察局（许可证 2018-15-0201-01397）和当地伦理委员会的许可下进行，符合欧盟指令 2010/63/EU、美国国立卫生研究院（出版物编号 85-3）并遵循丹麦动物实验立法指南（1987 年）。这是一个终末手术，死因是在深度麻醉下放血和横膈膜穿孔。

1.实验动物

1. 获得所需品系，年龄和性别的小鼠。本研究使用11-16周龄的雄性C57BL / 6JRj小鼠。每个笼子最多饲养5只雄性或8只雌性小鼠，随意获取食物和水，并保持12小时/ 12小时的明暗循环，从早上6点到下午6点开灯。

2.术前准备

1. 配制肝灌注缓冲液。
   1. Krebs-Henseleit 缓冲区。将 118 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、1.2 mmol/L MgSO 4 和 1.2 mmol/L KH 2 PO₄ 混合并溶解在 dH 2 O 中，将 1.25 mmol/L CaCl₂溶解在单独的烧杯中并加入缓冲液。
   2. 溶解 25 mmol/L NaHCO₃ ，并在搅拌的同时缓慢加入缓冲液中。将缓冲液储存在4°....

讨论

分离的灌注小鼠肝脏是研究肝脏代谢动力学和分子机制的有力研究工具。每分钟样本采集的可能性提供了对测试化合物对肝脏的直接影响的详细评估。 与体内 研究相比，灌注肝脏使我们能够以孤立的方式研究肝脏代谢，避免血液携带的肝外因子，并完全控制实验条件。与使用分离肝细胞的 体外 研究相比，肝脏灌注的优势在于维持肝脏结构、极性、纬向分裂和血管完整性。肝脏灌注.......