灌流マウス肝臓モデルを用いた肝臓のグルコース産生、尿素生成、脂肪分解の定量化

要約

ここでは、肝臓の構造を乱すことなく、肝外因子がない場合に、肝代謝の急性および直接的な調節を研究するためのマウス肝臓の in situ 灌流のための堅牢な方法を提示します。

要約

肝臓には、栄養代謝など多くの機能があります。肝臓研究の他の in vitro および in vivo モデルとは対照的に、単離された灌流肝臓は、肝外因子の影響から分離された、無傷の肝構造を持つ肝臓全体の肝臓生物学および代謝の研究を可能にします。肝灌流法はもともとラット用に開発されましたが、この方法はマウスにも適応されています。ここでは、マウス肝臓の in situ 灌流のプロトコルについて説明します。肝臓は、酸素化されたKrebs-Henseleit重炭酸緩衝液で門脈から順行性に灌流され、出力は肝下下大静脈から収集され、肝下下大静脈をクランプして回路を閉じます。この方法を使用すると、試験化合物の直接的な肝臓への影響を詳細な時間分解能で評価できます。肝機能と生存率は少なくとも3時間安定しており、同じ実験に内部コントロールを含めることができます。このモデルを用いた実験の可能性は数多くあり、肝生理学や肝疾患に関する洞察を推測できる可能性があります。

概要

肝臓は代謝に欠かせない器官です。グルコース、脂質、アミノ酸の代謝を調節することにより、全身のエネルギーバランスの制御に重要な役割を果たします。世界的な肝疾患の増加は、世界的な健康上の大きな負担として浮上しており、病態生理学と肝機能への影響についてより多くの知識が必要です。

in vivo研究を補完するために、肝臓の研究のためにさまざまなin vitroモデルが開発されています。げっ歯類やヒトから単離・培養した初代肝細胞が広く用いられています。非実質細胞は、差動遠心分離およびグラジエント遠心分離を使用して肝細胞から分離することができ、異なる細胞種の共培養は細胞間^{クロストークの研究}に有用です1。初代ヒト肝細胞は薬物毒性試験のゴールデンスタンダードと考えられていますが、いくつかの研究により、肝細胞は組織培養で急速に脱分化し、肝機能が失われることが示されています^2,3,4。3Dスフェロイド系での肝細胞培養は、脱分化を改善し、より安定しており、従来の2D培養系よりもin vivoで肝臓を高度に模倣しているようです⁵。精密に切断された肝臓スライスは、組織構造を無傷に保ち、肝臓に存在する非実質細胞を含む、もう1つの確立されたin vitroモデル^{である6。}より高度なin vitroモデルには、肝臓チップ⁷および肝臓オルガノイド⁸が含まれます。しかし、これらすべてのアプローチでは、ベクトル的な門脈-肝静脈の流れを含む構造的完全性と流れのダイナミクスが失われ、一般化可能性に影響を与える可能性があります。

単離された灌流ラット肝臓は、1855⁹年にクロード・ベルナールによって最初に記述され、肝臓生物学、毒物学、および病態生理学の研究のためにさまざまな科学分野で現在でも使用されています。上記のin vitroモデルと比較した灌流肝臓の利点には、肝構造の維持、血管の流れ、肝細胞の極性とゾーネーション、および肝細胞と非実質細胞間の相互作用が含まれます。in vivo研究と比較して、灌流肝臓は、血液によって運ばれる肝外因子を回避し、実験条件を完全に制御しながら、肝臓代謝を単独で研究することを可能にします。何年にもわたってラット肝灌流モデルを改善するためにいくつかの変更が加えられました10,11,12,13。単離された灌流肝研究にはマウスが用いられているが、文献は少ない。ここでは、マウス肝臓からの肝静脈流出液中の代謝基質およびホルモンに対する急性および直接的な代謝応答をリアルタイムで測定するために、門脈と下肝大静脈下大静脈のカニューレ挿入によるマウス肝臓のin situ灌流の方法を紹介します。

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プロトコル

すべての動物実験は、デンマーク環境食品省のデンマーク動物実験検査官(許可2018-15-0201-01397)、およびEU指令2010/63/EU、国立衛生研究所(出版物番号85-3)に従い、デンマークの動物実験に関する法律(1987)のガイドラインに従って、地元の倫理委員会の許可を得て実施されました。これは末期処置であり、死因は深い麻酔下での放血と横隔膜の穿孔です。

1. 実験動物

1. 希望の系統、年齢、性別のマウスを入手します。この研究では、11〜16週齢の雄のC57BL / 6JRjマウスを使用しました。ケージごとに最大5匹のオスまたは8匹のメスマウスを飼育し、チャウと水に自由にアクセスし、午前6時から午後6時までライトをオンにして12時間/12時間の明暗サイクルを維持します。

2. 術前の準備

1. 肝灌流緩衝液を作ります。
   1. Krebs-Henseleit バッファー。118 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、1.2 mmol/L MgSO 4、および1.2 mmol/L KH 2 PO₄をdH 2 Oに混合して溶解し、1.25 mmol/L CaCl₂を別のビーカーに溶解し、緩衝液を加えます。
   2. 25 mmol/L NaHCO₃ を溶解し、攪拌しながら緩衝液にゆっくりと添加します。バッファーは 4 度で保存します。バッファーは少なくとも1か月間安定しています。
      注:CaCl₂ と NaHCO₃ を添加する前に個別に溶解しないと、沈殿が発生する可能性があります。
2. 灌流バッファーを2 μmフィルターでろ過し、HClを使用してpHを7.5に調整します。
   注:このステップは、密閉フラスコに保管した場合でも、時間の経過とともにpHが上昇するため、実験日に実行する必要があります。
3. 濾過し、pH調整したKrebs-Henseleit灌流バッファー中で、所望の最終濃度よりも高い濃度(例:サイドアームポンプを介して0.175 mL/minの速度で注入した場合の濃度の20倍)で試験化合物を調製します。必要に応じて、1% BSAを担体として添加したKrebs-Henseleit灌流バッファーで試験化合物を希釈し(すべてのペプチドに必須のチューブやガラス器具への付着を避けるため)、適切なサイズのフィルターでろ過します。

3.操作と灌流

注:この研究で使用した灌流セットアップの図を 図1に示します。

1. 灌流バッファー(95%O 2、5%CO₂)を少なくとも30分間ガス化して、肝臓に十分な酸素を供給し、操作の開始から正しいpHを維持します(重炭酸緩衝システムは、連続ガス処理下でpH7.4に達します、補足図1を参照)。
2. ケタミン(90mg/kg)とキシラジン(10mg/kg)を腹腔内注射で投与し、マウスを麻酔する。
3. マウスを加熱した手術台に仰向けに置き、つま先のつまみに反応して反射神経がなくなることを確認します。70%エタノールをスプレーして、髪の毛がハサミにくっつかないようにします。マウスを温かい面に固定すると、次の手順の安定性が向上します。
4. 腹部の付け根をハサミで切開し、両側の胸郭まで上向きに切り込み、腹腔を露出させます。綿棒を使って腸を右に動かし、門脈を露出させます。
5. 湾曲した鉗子を使用して門脈の下に2つの結紮糸を配置し、各結紮糸に緩い結び目を準備します。
6. 0.7mmのカテーテルを門脈に挿入します。穿孔したら、カテーテルから針を抜き、 図2に示すように、カテーテルの先端が肝臓に近づくまでカテーテルを静脈に導きます。血液はカテーテルに流れ込みます。
7. 合字を締めます。カテーテルが血液で満たされていない場合は、気泡の発生を避けるために灌流緩衝液で満たします。
8. 灌流チューブを取り付け、ローラーポンプを0.8 mL / minの灌流流量で始動することにより、37°CでKrebs-Henseleit重炭酸緩衝液で肝臓の灌流を開始します。肝臓は数秒で青白くなります。
9. 胸郭と横隔膜をハサミで切ります。この時点で、動物は安楽死させられます。細かい点鉗子を使用して、肝上下大静脈の下に結紮糸を配置します。マウスの背面の下にペン、ロールガーゼ、またはその他の使い捨てアイテムを置いて、静脈にアクセスしやすくします。
10. 心臓の右心房から肝上下大静脈にカテーテルを挿入します。穿孔したら、針をカテーテルから外し、カテーテルの先端が肝臓に近づくまでカテーテルを静脈に導きます。血液と灌流バッファーはすぐに使い果たされます。
11. 結紮糸を締め、灌流廃液を収集するためのチューブを取り付けます。すべてのチューブを防水テープ(なめらかなテープなど)で固定します。
12. 血管クランプアダプターを使用して、右腎静脈のすぐ上の肝下大静脈を横切って血管クランプを配置し、混合を防ぎます(図2)。
13. 灌流流量を3.5mL/minに増やし、タイマーを開始する。圧力記録を開始します。灌流が成功すると、通常、~10 mm/Hgの圧力が発生します。
14. 生理食塩水で湿らせた滅菌ドレープで肝臓を覆い、実験中に生理食塩水を追加して乾燥を防ぎます。
15. 灌流排水を1分間収集し、体積を測定します。容量は約 3.5 mL/分である必要があります。この段階では血液の混合は予想されず、心臓はもはやポンプしません。
16. 実験を開始する前に、30分の平衡化期間を待ちます。

図1:灌流セットアップの図。 (A)手術台を三脚台に載せ、37°Cに加熱します。 灌流緩衝液はガス化され(95%O 2、5% CO₂)、蠕動ローラーポンプを介してポンプで送られ、内蔵の気泡トラップを備えた熱交換器で加熱されます。このシステムはさらに、灌流圧力を調整するための圧力計とスピンドルポンプで構成されています。灌流圧力は、PC上のトランスデューサを介して連続的に記録され、圧力記録プログラムによって視覚化されます。(B)赤いボックスは、三方活栓の接続部を捉えています。最初の三方活栓は、シリンジポンプを介して試験化合物を注入するために開いており、2番目の活栓は閉じています。3つ目は、連続的な圧力測定が可能です。第4の活栓は、例えば、灌流肝臓全体のガス分析のために、入力サンプルを収集するために使用され得る。コネクタは、輸液ラインを増減させる必要がある特定の実験のために、必要に応じて変更することができます。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:肝灌流前および肝灌流中のマウス腹腔の写真。 (A)緑色の点は門脈カテーテルの先端の位置を示す。カテーテルの先端は、漏出を避けるために、門脈の分岐点のすぐ下、左右の肝門脈への門脈の上に位置することが重要ですが、膵十二指腸枝の上にあります。黄色の点は、灌流肝臓への血液の逆流を避けるために、右腎静脈と肝臓の間の肝下大静脈の血管クランプの正しい位置を示しています。 (B、C)2本のカテーテルを門脈に挿入した灌流マウス肝臓(B)と肝上下大静脈(C)と肝下大静脈(B)を血管で固定。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

4. 実験

1. 平衡化期間の終了時にフラクションコレクターを使用して最初のベースラインサンプルを収集することから実験を開始します。希望の時間間隔でサンプルを収集し、すぐに氷上に置きます。
2. 気泡トラップを定期的にチェックし、空に近づいたら灌流バッファーを補充してください。
3. 緩衝液のサンプルを、臓器に入る直前に三方活栓を通して、および下大静脈に挿入された収集カテーテルから採取します(肝臓から灌流された後)。
4. 血液ガス分析装置でサンプルを測定して、臓器が代謝的に活発であることを確認します(_CO2 の分圧の上昇とpHの低下によって示されます)。
5. 実験の最後にステップ4.3〜4.4を繰り返して、実験全体の生存率を評価します(補足図2)。
   注:酸素分圧の低下は、チューブや臓器などからの酸素の損失のため、呼吸の信頼できる尺度を提供しません。
6. ベースライン灌流の15分後、シリンジポンプを使用して所望の流量で三方活栓を通して試験物質を注入することにより、最初の刺激を開始します(例:.、サイドアームポンプを介して0.175 mL / minの速度で注入した場合の試験物質の20倍の濃度)。あるいは、ベースラインバッファーを、試験化合物を最終濃度で含む新しい(酸素化および加熱された)バッファーに切り替えます。
7. 刺激を停止し、20〜30分間ベースラインサンプルを収集してから、2回目の刺激を開始します。
8. 実験の最後に、適切なポジティブコントロールを5〜10分間注入します。
9. 実験後、灌流肝臓を切除し、それを計量して出力を肝臓重量に正規化します。肝臓を液体窒素で急速凍結して、タンパク質含有量を測定して、出力をタンパク質含有量に正規化します。

5. 生化学的測定

1. 灌流バッファーでの測定に適したアッセイ(社内または市販の比色アッセイまたはELISAアッセイ)を使用して、目的分子の濃度を定量します。このバッファーは、メタボロミクスやプロテオミクスなど、ほとんどのオミクスベースの技術に適合します。
   注:この研究では、尿素は以前に説明した比色アッセイに基づいて測定されました¹⁴。グルコースおよび非エステル化脂肪酸は、市販のキットを用いて定量した。

6. データ解析

1. 経時的な分泌量を示すXYグラフでデータを表示します。
   注:in vitro灌流システムの長所の1つは、in vivo研究のように出力で測定された濃度(mmol / L)ではなく、実際の出力(濃度×流量、例:μmol / min)としてデータを表現できることです。異なるマウスモデルを比較する場合は肝臓重量に出力を正規化するか、脂肪含有量の増加が肝臓重量の増加に起因する可能性のある肥満または肝疾患のマウスモデルと対照マウスを比較する場合は、出力を総タンパク質含有量(BCAで測定)に正規化することを検討してください。
2. 要約データを、ベースライン中および刺激期間(通常は15〜30分)の平均または合計出力を表す動物ごとの個々のドットとして提示するか、研究デザインに応じて各刺激期間の先行ベースラインを使用した増分出力として提示します。
3. 対応のあるt検定(2つのグループ)または反復刺激を伴う一元配置分散分析(2つ以上のグループ)を使用してデータを分析し、複数の検定に適切な事後検定を行います。

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結果

刺激または基質が目的の分子の放出につながるかどうかを判断するには、安定したベースラインが必要です。 図3A は、成功した実験の例を示しています。灌流肝臓における尿素の産生は2分間隔で測定され、SEM±平均として示されます。2 つの刺激期間のそれぞれに先行するベースライン期間は安定しています。2 つの刺激期間中の平均尿素生成?...

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ディスカッション

単離された灌流マウス肝臓は、肝代謝の動態と分子メカニズムを研究するための強力な研究ツールです。分単位のサンプル収集が可能であるため、試験化合物が肝臓に及ぼす直接的な影響を詳細に評価できます。 in vivo研究と比較して、灌流肝臓は、血液によって運ばれる肝外因子を回避し、実験条件を完全に制御しながら、肝臓代謝を単独で研究することを可能にします。単離され?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-way stopcock	BD	394601
Altromin breeding diet	Altromin Spezialfutter	1319
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)	Sigma	C8106
Catheters (0.7 mm)	BD	381812
Filter paper (pore size 2.0 µm)	Millipore	AP2029325
Glucose kit	QuantiChromTM	DIGL-100	Low concentration protocol
Ketamine	MSD Animal Health	511485	90 mg/kg
Ligature (black sterile silk)	Agnthos	14739
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma	230391
Non-esterified fatty acids kit	Fujifilm Wako Chemicals	NEFA-HR(2)
Operating table, heated on tripod stand, type 873	Harvard Bioscience, Inc.	733776
Potassium chloride (KCl)	Sigma	P9541
Potassium dihydrogen phosphate(KH2PO4)	Merck	1.04877
Roller Pump, with four channels	Harvard Bioscience, Inc.	730100
Sleek tape	Mediq danmark	4001910
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma	S5761
Sodium chloride (NaCl)	Sigma	S1679
Thermostatic Circulator	Harvard Bioscience, Inc.	730125	Bath Volume 3 L, 230 V/50 Hz
Tubing	Tygon	E3603	Inner diameter 1.59 mm, outer diameter 3.18 mm
Universal perfusion system	Harvard Bioscience, Inc.	732316	Basic unit uniper UP-100, type 834
Vamin	Fresenius Kabi	B05ABA01	Mixed amino acids
Vessel clamp adaptor	Deutsche Biomedical	DBC1002
Vessel clamps	Deutsche Biomedical	DBC1005
Windkessel	Harvard Bioscience, Inc.	732068
Xylazine	Rompun Vet	530701	10 mg/kg