灌流マウス肝臓モデルを用いた肝臓のグルコース産生、尿素生成、脂肪分解の定量化

要約

ここでは、肝臓の構造を乱すことなく、肝外因子がない場合に、肝代謝の急性および直接的な調節を研究するためのマウス肝臓の in situ 灌流のための堅牢な方法を提示します。

要約

肝臓には、栄養代謝など多くの機能があります。肝臓研究の他の in vitro および in vivo モデルとは対照的に、単離された灌流肝臓は、肝外因子の影響から分離された、無傷の肝構造を持つ肝臓全体の肝臓生物学および代謝の研究を可能にします。肝灌流法はもともとラット用に開発されましたが、この方法はマウスにも適応されています。ここでは、マウス肝臓の in situ 灌流のプロトコルについて説明します。肝臓は、酸素化されたKrebs-Henseleit重炭酸緩衝液で門脈から順行性に灌流され、出力は肝下下大静脈から収集され、肝下下大静脈をクランプして回路を閉じます。この方法を使用すると、試験化合物の直接的な肝臓への影響を詳細な時間分解能で評価できます。肝機能と生存率は少なくとも3時間安定しており、同じ実験に内部コントロールを含めることができます。このモデルを用いた実験の可能性は数多くあり、肝生理学や肝疾患に関する洞察を推測できる可能性があります。

概要

肝臓は代謝に欠かせない器官です。グルコース、脂質、アミノ酸の代謝を調節することにより、全身のエネルギーバランスの制御に重要な役割を果たします。世界的な肝疾患の増加は、世界的な健康上の大きな負担として浮上しており、病態生理学と肝機能への影響についてより多くの知識が必要です。

in vivo研究を補完するために、肝臓の研究のためにさまざまなin vitroモデルが開発されています。げっ歯類やヒトから単離・培養した初代肝細胞が広く用いられています。非実質細胞は、差動遠心分離およびグラジエント遠心分離を使用して肝細胞から分離することができ、異なる細胞種の共培養は細胞間^{クロストークの研究}に有用です1。初代ヒト肝細胞は薬物毒性試験のゴールデンスタンダードと考えられていますが、いくつかの研究により、肝細胞は組織培養で急速に脱分化し、肝機能が失われることが示されています^2,3,4。3Dスフェロイド系での肝細胞培養は、脱分化を改善し、より安定しており、従来の2D培養系よりもin vivoで肝臓を高度に模倣しているようです⁵。精密に切断された肝臓スライスは、組織構....

プロトコル

すべての動物実験は、デンマーク環境食品省のデンマーク動物実験検査官(許可2018-15-0201-01397)、およびEU指令2010/63/EU、国立衛生研究所(出版物番号85-3)に従い、デンマークの動物実験に関する法律(1987)のガイドラインに従って、地元の倫理委員会の許可を得て実施されました。これは末期処置であり、死因は深い麻酔下での放血と横隔膜の穿孔です。

1. 実験動物

1. 希望の系統、年齢、性別のマウスを入手します。この研究では、11〜16週齢の雄のC57BL / 6JRjマウスを使用しました。ケージごとに最大5匹のオスまたは8匹のメスマウスを飼育し、チャウと水に自由にアクセスし、午前6時から午後6時までライトをオンにして12時間/12時間の明暗サイクルを維持します。

2. 術前の準備

1. 肝灌流緩衝液を作ります。
   1. Krebs-Henseleit バッファー。118 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、1.2 mmol/L MgSO 4、および1.2 mmol/L KH 2 PO₄をdH 2 Oに混合して溶解し、1.25 mmol/L CaCl₂を別のビーカーに溶解し、緩衝液を....

ディスカッション

単離された灌流マウス肝臓は、肝代謝の動態と分子メカニズムを研究するための強力な研究ツールです。分単位のサンプル収集が可能であるため、試験化合物が肝臓に及ぼす直接的な影響を詳細に評価できます。 in vivo研究と比較して、灌流肝臓は、血液によって運ばれる肝外因子を回避し、実験条件を完全に制御しながら、肝臓代謝を単独で研究することを可能にします。単離され?.......