基于免疫组化和数字图像分析的子宫内膜免疫细胞定量检测平台

摘要

本文开发并验证了数字免疫组化图像分析平台，用于定量分析复发性流产患者在植入窗口期的子宫内膜免疫细胞。

摘要

为评估复发性流产（RM）患者的子宫内膜免疫微环境，开发并验证了数字免疫组化图像分析平台，用于定量分析黄体中期子宫内膜免疫细胞。所有子宫内膜样本均在月经周期的黄体中期采集。将石蜡包埋的子宫内膜组织切片成4 μm厚的载玻片，进行免疫组化（IHC）染色检测子宫内膜免疫细胞，包括CD56+ uNK细胞、Foxp3+ Tregs、CD163+ M2巨噬细胞、CD1a+ DCs和CD8+ T细胞。使用数字玻片扫描仪对全景玻片进行扫描，并使用商业图像分析系统进行定量分析。子宫内膜免疫细胞的百分比是通过除以总子宫内膜细胞中的免疫细胞数来计算的。使用商用图像分析系统，可以轻松准确地分析传统图像分析难以或不可能分析的子宫内膜免疫细胞的定量评估。该方法可用于定量表征子宫内膜微环境，包括免疫细胞之间的相互作用，以及不同生殖失败患者的异质性。子宫内膜免疫细胞定量评估平台对RM患者的诊断和治疗具有重要的临床意义。

引言

复发性流产（RM）是指连续两次或两次以上妊娠的流产，是一种复杂的疾病，近年来引起了临床医生的关注。育龄妇女RM的发病率为1%-5%¹。既往研究结果表明，免疫因子与RM 2,3,4,5的发病机制密切相关。维持母胎界面的免疫稳态是胚胎植入和发育所必需的。子宫内膜免疫细胞在维持这种稳态方面发挥多种调节作用，例如促进滋养层侵袭、重塑螺旋动脉和促进胎盘发育 6,7,8,9。

RM 女性的子宫内膜免疫细胞异常既往已有报道。结果显示，高密度子宫自然杀伤细胞 （uNK） 与 RM¹⁰、^11、12 的发生密切相关。据报道，与活产女性相比，RM女性子宫内膜中....

研究方案

研究内容和方案已通过深圳市中山泌尿外科医院研究伦理委员会的伦理审查和批准。参与研究的所有女性（20-40 岁）都对样本收集和使用提供了知情同意。

1.病理组织的获取

1. 准备用于组织采集的工具，即测量尺、镊子、包埋盒、包埋纸和纸巾篮。
2. 观察使用移液管的标准方法收集的子宫内膜组织（比绿豆大）的数量是否足够。
3. 用镊子将福尔马林的子宫内膜组织转移到包埋纸上，并用尺子测量子宫内膜组织尺寸。
4. 用包埋纸包裹子宫内膜组织，然后放入包埋盒中。
5. 将包埋盒放入纸巾篮中进行脱水。

2.组织脱水

1. 将组织篮放入脱水机的反应室中（参见 材料表），并开始常规组织脱水程序：福尔马林100分钟;福尔马林100分钟;75%酒精60分钟;85% 酒精 60 分钟;95% 酒精 60 分钟;100%酒精60分钟;100%酒精60分钟;100%酒精60分钟;二甲苯35分钟;二甲苯20分钟;二甲苯20分钟;蜡80分钟;蜡80分钟;打蜡 80 分钟。该过程大约需要15小时。
2. 在组织脱水程序结束时，打开脱水机的反应室，取出组织篮。

3. 组织包....

讨论

该协议建立了数字免疫组化图像分析平台，以定量分析RM患者的子宫内膜免疫细胞。在这里，检测了六种子宫内膜免疫标志物，以评估RM患者的子宫内膜免疫微环境。

黄体中期的接受性子宫内膜是成功植入和怀孕的关键^27,28。因此，评估子宫内膜免疫细胞百分比在估计子宫内膜容受性方面起着重要作用。通过传统的病理学方法进行子.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automated coverslipper	Sakuraus	DRS-Prisma-P-JCS&Film-JC2
CD163	GrowGn Biotechnology	NCL-L-CD163
CD1a	Gene Tech	GM357129
CD56	Gene Tech	GT200529
CD8	Novocastra	NCL-L-CD8-4B11
Dehydrator	Thermo Fisher	Excelsior ES
Digital pathology and	Indica labs	HALO
Foxp3	YILIFANG biological	14-477-82
IHC stainer	Leica	BOND III
Image analysis platform	Indica labs	HALO
Slide Scanner	Olympus life science	VS200