Plataforma para la detección cuantitativa de células inmunes endometriales basada en inmunohistoquímica y análisis de imágenes digitales

Resumen

Aquí, se desarrolló y validó una plataforma digital de análisis de imágenes inmunohistoquímicas para analizar cuantitativamente las células inmunitarias endometriales de pacientes con abortos espontáneos recurrentes en la ventana de implantación.

Resumen

Para evaluar el microambiente inmune endometrial de pacientes con aborto espontáneo recurrente (RM), se desarrolló y validó una plataforma de análisis de imágenes inmunohistoquímicas digitales para analizar cuantitativamente las células inmunes endometriales durante la fase lútea media. Todas las muestras de endometrio se recogieron durante la fase lútea media del ciclo menstrual. Los tejidos endometriales incluidos en parafina se seccionaron en portaobjetos de 4 μm de espesor y se llevó a cabo una tinción inmunohistoquímica (IHQ) para detectar células inmunitarias endometriales, incluidas las células uNK CD56+, las Tregs Foxp3+, los macrófagos CD163+ M2, las CD CD1a+ y las células T CD8+. Las diapositivas panorámicas se escanearon con un escáner digital de diapositivas y se utilizó un sistema comercial de análisis de imágenes para el análisis cuantitativo. El porcentaje de células inmunitarias endometriales se calculó dividiendo el número de células inmunitarias en el total de células endometriales. Utilizando el sistema comercial de análisis de imágenes, la evaluación cuantitativa de las células inmunitarias endometriales, que son difíciles o imposibles de analizar con el análisis de imágenes convencional, podría analizarse de forma fácil y precisa. Esta metodología se puede aplicar para caracterizar cuantitativamente el microambiente del endometrio, incluida la interacción entre las células inmunitarias, y su heterogeneidad para diferentes pacientes con insuficiencia reproductiva. La plataforma para la evaluación cuantitativa de las células inmunitarias endometriales puede tener una importancia clínica importante para el diagnóstico y el tratamiento de las pacientes con RM.

Introducción

El aborto espontáneo recurrente (RM) es la pérdida de dos o más embarazos consecutivos y es una enfermedad compleja que ha llamado la atención de los médicos en los últimos años. La tasa de incidencia de RM en mujeres en edad fértil es del 1%-5% ¹. Los resultados de estudios previos muestran que los factores inmunes están estrechamente asociados con la patogénesis de RM 2,3,4,5. El mantenimiento de la homeostasis inmunitaria en la interfaz materno-fetal es necesario para la implantación y el desarrollo embrionario. Las células inmunitarias endometriales desempeñan varias funciones reguladoras para mantener esta homeostasis, como promover la invasión del trofoblasto, remodelar las arterias espirales y contribuir al desarrollo de la placenta 6,7,8,9.

Se han reportado previamente células inmunitarias endometriales aberrantes en mujeres con RM. Los resultados muestran una estrecha asociación entre la alta densidad de células asesinas naturales uterinas (uNK) y la ocurrencia de RM^10,11,12. Se ha descrito un aumento del número de macrófagos en el endometrio de mujeres con RM, en comparación con las que tuvieron un nacido vivo¹³. Las células T reguladoras (Treg) desempeñan un papel en la inmunidad materna hacia el embrión, y su nivel y función están disminuidos en la decidua de los pacientes con RM¹⁴. Los linfocitos T (CTL) y los linfocitos dendríticos (CD) también desempeñan un papel en la regulación inmunitaria del embarazo^15,16. Por lo tanto, un análisis cuantitativo exhaustivo de las células inmunitarias endometriales locales durante la fase lútea media podría ayudar a comprender mejor la patogénesis de la RM. Algunos métodos actuales para el análisis cuantitativo de las células inmunitarias endometriales utilizan la citometría de flujo, que puede etiquetar con precisión las células inmunitarias con múltiples marcadores^17,18. Sin embargo, la aplicación clínica de la citometría de flujo es limitada porque solo se puede realizar en tejido fresco. La obtención de tejido fresco solo es factible cuando se dispone de un gran volumen de exceso de tumor, algo poco frecuente en el endometrio. La inmunohistoquímica puede observar bien la morfología de los tejidos in situ y también puede marcar varias células inmunitarias, mientras que las técnicas inmunohistoquímicas tradicionales no pueden realizar análisis cuantitativos de las células inmunitarias.

En comparación con los experimentos de inmunohistoquímica convencionales, el análisis inmunohistoquímico cuantitativo de las células inmunitarias del endometrio tiene una importancia clínica importante. La puntuación de la intensidad de la IHQ suele clasificarse en una escala de cuatro puntos o fuerte y débil en el diagnóstico patológico y la investigación 19,20,21. Sin embargo, esta técnica semicuantitativa es subjetiva, altamente inexacta y demuestra una variabilidad significativa intraobservador e interobservador²². Una posible solución es la aplicación del aprendizaje automático, que es valioso en el análisis de imágenes digitales^23,24. Al proporcionar mediciones cuantitativas, este enfoque permite una evaluación más precisa de la infiltración, distribución y densidad de las células inmunitarias dentro del tejido uterino. Esta información cuantitativa puede ayudar a dilucidar los cambios dinámicos en las poblaciones de células inmunitarias durante el ciclo menstrual y en diversas condiciones patológicas. En general, la capacidad de analizar cuantitativamente las células inmunitarias del endometrio a través de la inmunohistoquímica ofrece información valiosa sobre el microambiente inmunitario del útero.

Por lo tanto, el protocolo tenía como objetivo desarrollar y validar una plataforma digital de análisis de imágenes inmunohistoquímicas para analizar cuantitativamente las células inmunitarias endometriales, incluidas las células uNK, Tregs, macrófagos, CD y células T citotóxicas durante la fase lútea media en pacientes con RM.

Protocolo

El contenido y el protocolo de la investigación han sido revisados éticamente y aprobados por el comité de ética de investigación del Hospital de Urología Shenzhen Zhongshan. Todas las mujeres (de 20 a 40 años) que participaron en el estudio dieron su consentimiento informado para la recolección y el uso de la muestra.

1. Adquisición de tejido patológico

1. Prepare las herramientas para la recolección de pañuelos, a saber, la regla de medición, la pinza, el casete de inclusión, el papel de incrustación y la canasta de pañuelos.
2. Observe si la cantidad de tejido endometrial (más grande que un frijol mungo), recolectado mediante un abordaje estándar con un catéter de pipella, es suficiente.
3. Transfiera el tejido endometrial de la formalina al papel de inclusión con pinzas y mida las dimensiones del tejido endometrial con una regla.
4. Envuelva el tejido endometrial con papel de inclusión y colóquelo en un casete de inclusión.
5. Coloque el casete de inclusión en la canasta de pañuelos para deshidratarlo.

2. Deshidratación de tejidos

1. Coloque la canasta de pañuelos en la cámara de reacción del deshidratador (consulte la Tabla de materiales) e inicie el procedimiento para la deshidratación de tejidos de rutina: formol durante 100 minutos; formol durante 100 min; 75% de alcohol durante 60 min; 85% de alcohol durante 60 min; 95% de alcohol durante 60 min; 100% alcohol durante 60 min; 100% alcohol durante 60 min; 100% alcohol durante 60 min; xileno durante 35 min; xileno durante 20 min; xileno durante 20 min; cera durante 80 min; cera durante 80 min; Cera durante 80 min. El proceso dura unas 15 h.
2. Al final del procedimiento de deshidratación de tejidos, abra la cámara de reacción del deshidratador, retire la canasta de tejidos.

3. Inclusión de tejidos

1. Saque un molde de inclusión adecuado según el tamaño de la muestra y llénelo con cera de parafina a 70 ° C.
2. Coloque rápidamente el pañuelo en el molde y ajústelo con cuidado para que el tejido quede ubicado en el centro del molde.
3. Mueva el molde suavemente a la placa de enfriamiento y presione suavemente el pañuelo mientras la parafina en la parte inferior se asienta.
4. Coloque el casete de incrustación encima del molde y rellene con más cera.
5. Coloque el molde en la placa de enfriamiento y, cuando la parafina esté completamente solidificada, retire el bloque con su casete adjunto lejos del molde.

4. Secciones de tejido

1. Inserte el bloque en el clip de muestra del micrótomo, coloque la cuchilla en el soporte, ajuste el ángulo entre el plano del bloque y la cuchilla, ajuste el grosor de la sección a 4 μm, gire el volante y comience el corte.
2. Exponga la superficie de tejido adecuada cortando algunas secciones delgadas del bloque. Saca las secciones continuas y completas con el pincel.
3. Cuando se corten suficientes secciones, deje de girar el volante, retire las secciones no calificadas en la parte delantera con pinzas y haga flotar las secciones en la superficie de agua a 42 ° C en el baño de agua con pinzas y cepillo.
4. Una vez que las secciones estén completamente aplanadas, recoja las secciones en portaobjetos antidesprendimiento y transfiéralas a un calentador de portaobjetos a 65 °C para hornear durante 60 minutos.
5. Cuando termine de hornear, saque los portaobjetos de vidrio del calentador de portaobjetos.

5. Tinción inmunohistoquímica

1. Diluya el anticuerpo primario en una solución funcional con diluyente de anticuerpos. Consulte la Tabla 1 para obtener más detalles.
2. Coloque la solución de anticuerpos diluida en un frasco de reactivo especial y el kit de detección en el compartimiento de reactivos de un instrumento automático de tinción IHQ (consulte la Tabla de materiales).
3. Coloque los portaobjetos en un soporte para portaobjetos, cubierto con un vértice especial, e insértelos en el compartimento de reacción experimental del instrumento.
4. Después de que el instrumento reconozca automáticamente el reactivo y la información experimental en el portaobjetos, haga clic en el botón Inicio para iniciar la tinción inmunohistoquímica. El experimento tiene una duración aproximada de 3 h.

6. Deshidratación y sellado del portaobjetos

1. Después de la tinción inmunohistoquímica, saque el portaobjetos, retire el vértice especial, coloque el portaobjetos teñido en el portaobjetos y lave el tinte restante del portaobjetos con agua limpia.
2. Transfiera el portaobjetos a un cubreobjetos automatizado (consulte la Tabla de materiales), seleccione y ejecute el procedimiento de deshidratación y sellado.
3. Saque los portaobjetos después de deshidratarlos y sellarlos.

7. Escaneo de diapositiva

1. Coloque los portaobjetos en el soporte de portaobjetos del escáner panorámico de imágenes patológicas (consulte la Tabla de materiales) y colóquelo en el compartimento de escaneo de portaobjetos del instrumento para el escaneo de imágenes patológicas panorámicas. El escaneo tarda 2 min. Véase la figura 1.

8. Análisis de imágenes

1. Importar imagen
   1. Abra el software de análisis de imágenes patológicas (consulte Tabla de materiales) y cree una nueva carpeta. Importar imágenes inmunohistoquímicas para ser analizadas.
2. Construir un clasificador de tejidos
   1. Marque varios tejidos y una anotación en blanco para entrenar y establecer un clasificador para identificar el tejido y el área en blanco, respectivamente.
   2. Utilice el ajuste en tiempo real para observar la capacidad de reconocimiento del software en tiempo real durante la anotación de marcas. Si el reconocimiento no es oportuno, retome la anotación y vuelva a entrenar hasta que el reconocimiento de tejidos sea preciso.
3. Algoritmo de análisis de compilación
   1. Seleccione el algoritmo estándar en el software de acuerdo con el tipo de experimento: IHC múltiplex.
   2. Establezca los parámetros de color del reconocimiento de celdas seleccionando píxeles negativos y positivos típicos.
      Sobre esta base, establezca los parámetros del núcleo, el citoplasma y la membrana celular, y observe la situación de reconocimiento celular en tiempo real hasta que se hayan encontrado los parámetros más adecuados para la imagen.
   3. Establezca el umbral de reconocimiento de celdas positivo y observe la situación de reconocimiento en tiempo real hasta que se ajuste el umbral apropiado.
   4. Seleccione el clasificador de tejido en el algoritmo y verifique la parte de tejido en el clasificador de tejido, para identificar las células sobre la base de los tejidos. En este punto, se completa el establecimiento de un algoritmo de análisis.
4. Ejecutar análisis de imágenes
   1. Seleccione el área de análisis. Utilice el algoritmo establecido para analizar imágenes.
5. Una vez finalizado el análisis del software, compruebe manualmente si el reconocimiento de imágenes es preciso, incluido el reconocimiento de tejidos, el reconocimiento de células negativas y positivas.
6. Si el reconocimiento de imágenes no es preciso, vuelva a ajustar el algoritmo y el umbral de parámetros, y vuelva a ejecutar el análisis de imágenes hasta que se realice correctamente. Exporte los resultados del análisis. Véase la figura 1.
7. También se pueden analizar otras células inmunitarias de acuerdo con los pasos anteriores (véase la figura 1). Establecer diferentes parámetros de análisis en función de la expresión real de diferentes marcadores inmunitarios endometriales (células CD56+uNK, Foxp3+Tregs, macrófagos CD68+, macrófagos CD163+M2, CD1a⁺DCs y células CD8⁺T^25,26).
8. A través del cálculo del software, se obtiene la proporción de células inmunes endometriales (ver Tabla 2). Utilícelo para evaluar los niveles de varias células inmunitarias en el endometrio de pacientes con abortos espontáneos recurrentes.

Resultados

Con el fin de evaluar cuantitativamente las células inmunitarias endometriales y reducir la inestabilidad causada por errores operativos provocados por el hombre, establecimos una plataforma de análisis cuantitativo digital para las células inmunitarias endometriales mediante el uso de la detección inmunohistoquímica automática y el sistema de evaluación cuantitativa digital. Se estableció la plataforma de análisis de imágenes inmunohistoquímicas para analizar cuantitativamente las células inmunes endometrial...

Discusión

Este protocolo estableció una plataforma digital de análisis de imágenes inmunohistoquímicas para analizar cuantitativamente las células inmunitarias endometriales de pacientes con RM. En este caso, se detectaron seis marcadores inmunitarios endometriales para evaluar el microambiente inmunitario endometrial en pacientes con RM.

Un endometrio receptivo durante la fase lútea media es clave para el éxito de la implantación y el embarazo^27,28

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automated coverslipper	Sakuraus	DRS-Prisma-P-JCS&Film-JC2
CD163	GrowGn Biotechnology	NCL-L-CD163
CD1a	Gene Tech	GM357129
CD56	Gene Tech	GT200529
CD8	Novocastra	NCL-L-CD8-4B11
Dehydrator	Thermo Fisher	Excelsior ES
Digital pathology and	Indica labs	HALO
Foxp3	YILIFANG biological	14-477-82
IHC stainer	Leica	BOND III
Image analysis platform	Indica labs	HALO
Slide Scanner	Olympus life science	VS200