Plattform zum quantitativen Nachweis von Immunzellen des Endometriums auf Basis von Immunhistochemie und digitaler Bildanalyse

Zusammenfassung

Hier wurde eine digitale immunhistochemische Bildanalyseplattform entwickelt und validiert, um die Immunzellen des Endometriums von Patientinnen mit rezidivierenden Fehlgeburten im Implantationsfenster quantitativ zu analysieren.

Zusammenfassung

Um die Immunumgebung des Endometriums von Patientinnen mit rezidivierenden Fehlgeburten (RM) zu bewerten, wurde eine digitale immunhistochemische Bildanalyseplattform entwickelt und validiert, um Immunzellen des Endometriums während der mittleren Lutealphase quantitativ zu analysieren. Alle Proben der Gebärmutterschleimhaut wurden während der mittleren Lutealphase des Menstruationszyklus entnommen. In Paraffin eingebettetes Endometriumgewebe wurde in 4 μm dicke Objektträger geschnitten und eine immunhistochemische (IHC) Färbung zum Nachweis von Immunzellen des Endometriums, einschließlich CD56+ uNK-Zellen, Foxp3+ Tregs, CD163+ M2-Makrophagen, CD1a+ DCs und CD8+ T-Zellen, durchgeführt. Die Panorama-Dias wurden mit einem digitalen Diascanner gescannt und für die quantitative Analyse wurde ein kommerzielles Bildanalysesystem verwendet. Der prozentuale Anteil der Immunzellen des Endometriums wurde berechnet, indem die Anzahl der Immunzellen in den gesamten Endometriumzellen geteilt wurde. Mit dem kommerziellen Bildanalysesystem konnte die quantitative Bewertung von Immunzellen des Endometriums, die mit herkömmlicher Bildanalyse nur schwer oder gar nicht analysiert werden können, einfach und genau analysiert werden. Diese Methodik kann angewendet werden, um die Mikroumgebung der Gebärmutterschleimhaut, einschließlich der Interaktion zwischen Immunzellen, und ihre Heterogenität für verschiedene Patientinnen mit reproduktivem Versagen quantitativ zu charakterisieren. Die Plattform zur quantitativen Bewertung von Immunzellen des Endometriums könnte für die Diagnose und Behandlung von RM-Patientinnen von wichtiger klinischer Bedeutung sein.

Einleitung

Wiederholte Fehlgeburten (RM) sind der Verlust von zwei oder mehr aufeinanderfolgenden Schwangerschaften und sind eine komplexe Erkrankung, die in den letzten Jahren die Aufmerksamkeit von Klinikern auf sich gezogen hat. Die Inzidenzrate von RM bei Frauen im gebärfähigen Alter liegt bei 1%-5% ¹. Ergebnisse früherer Studien zeigen, dass Immunfaktoren eng mit der Pathogenese von RM 2,3,4,5 assoziiert sind. Die Aufrechterhaltung der Immunhomöostase an der Schnittstelle zwischen Mutter und Fötus ist für die Einnistung und Entwicklung des Embryos erforderlich. Endometrium-Immunzellen erfüllen mehrere regulatorische Funktionen, um diese Homöostase aufrechtzuerhalten, wie z. B. die Förderung der Trophoblasteninvasion, den Umbau von Spiralarterien und die Mitwirkung an der Plazentaentwicklung 6,7,8,9.

Zuvor wurde über aberrante Immunzellen des Endometriums bei Frauen mit RM berichtet. Die Ergebnisse zeigen einen engen Zusammenhang zwischen der hohen Dichte an uterinen natürlichen Killerzellen (uNKs) und dem Auftreten von RM^10,11,12. Eine erhöhte Anzahl von Makrophagen wurde im Endometrium von Frauen mit RM im Vergleich zu Frauen mit Lebendgeburt berichtet¹³. Regulatorische T-Zellen (Treg) spielen eine Rolle bei der mütterlichen Immuntoleranz gegenüber dem Embryo, und ihr Spiegel und ihre Funktion sind in der Dezidua von RM-Patienten verringert¹⁴. Zytotoxizität T-Zellen (CTL) und dendritische Zellen (DCs) spielen ebenfalls eine Rolle bei der Immunregulation der Schwangerschaft^15,16. Daher könnte eine umfassende quantitative Analyse lokaler Immunzellen des Endometriums während der mittleren Lutealphase helfen, die Pathogenese der RM besser zu verstehen. Einige aktuelle Methoden zur quantitativen Analyse von Immunzellen des Endometriums verwenden die Durchflusszytometrie, die Immunzellen mit mehreren Markern genau markieren kann^17,18. Die klinische Anwendung der Durchflusszytometrie ist jedoch begrenzt, da sie nur an frischem Gewebe durchgeführt werden kann. Die Gewinnung von frischem Gewebe ist nur möglich, wenn ein großes Volumen an überschüssigem Tumor zur Verfügung steht, was bei der Gebärmutterschleimhaut selten vorkommt. Die Immunhistochemie kann die Gewebemorphologie gut in situ beobachten und auch verschiedene Immunzellen markieren, während herkömmliche immunhistochemische Techniken keine quantitative Analyse von Immunzellen durchführen können.

Im Vergleich zu konventionellen immunhistochemischen Experimenten hat die quantitative immunhistochemische Analyse von Immunzellen im Endometrium eine wichtige klinische Bedeutung. Das IHC-Intensitäts-Scoring wird in der Regel auf einer vierstufigen Skala oder stark und schwach in der pathologischen Diagnostik und Forschung eingestuft 19,20,21. Diese semi-quantitative Technik ist jedoch subjektiv, höchst ungenau und weist eine signifikante Variabilität innerhalb und zwischen Beobachtern auf²². Eine mögliche Lösung ist die Anwendung des maschinellen Lernens, das in der digitalen Bildanalyse wertvoll ist^23,24. Durch quantitative Messungen ermöglicht dieser Ansatz eine genauere Beurteilung der Infiltration, Verteilung und Dichte von Immunzellen im Gebärmuttergewebe. Diese quantitativen Informationen können dazu beitragen, die dynamischen Veränderungen in Immunzellpopulationen während des Menstruationszyklus und bei verschiedenen pathologischen Zuständen aufzuklären. Insgesamt bietet die Möglichkeit, Immunzellen in der Gebärmutterschleimhaut mittels Immunhistochemie quantitativ zu analysieren, wertvolle Einblicke in die Immunmikroumgebung der Gebärmutter.

Daher zielte das Protokoll darauf ab, eine digitale immunhistochemische Bildanalyseplattform zu entwickeln und zu validieren, um Immunzellen des Endometriums, einschließlich uNK-Zellen, Tregs, Makrophagen, DCs und zytotoxischer T-Zellen, während der mittleren Lutealphase bei RM-Patienten quantitativ zu analysieren.

Protokoll

Der Forschungsinhalt und das Protokoll wurden von der Forschungsethikkommission des Shenzhen Zhongshan Urology Hospital ethisch geprüft und genehmigt. Alle Frauen (20 bis 40 Jahre), die an der Studie teilnahmen, gaben eine informierte Einwilligung für die Probenentnahme und -verwendung.

1. Gewinnung von pathologischem Gewebe

1. Bereiten Sie die Werkzeuge für die Gewebeentnahme vor, nämlich Messlineal, Pinzette, Einbettkassette, Einbettpapier und Taschentuchkorb.
2. Beobachten Sie, ob die Menge an Endometriumgewebe (größer als eine Mungobohne), die mit einem Standardansatz mit einem Pipellenkatheter entnommen wird, ausreichend ist.
3. Übertragen Sie das Endometriumgewebe von Formalin mit einer Pinzette auf das Einbettpapier und messen Sie die Abmessungen des Endometriumgewebes mit einem Lineal.
4. Wickeln Sie das Endometriumgewebe mit Einbettpapier ein und legen Sie es in eine Einbettkassette.
5. Legen Sie die Einbettkassette zur Dehydrierung in den Taschentuchkorb.

2. Austrocknung des Gewebes

1. Stellen Sie den Gewebekorb in die Reaktionskammer des Dörrgeräts (siehe Materialtabelle) und starten Sie das Verfahren zur routinemäßigen Gewebedehydrierung: Formalin für 100 Minuten; Formalin für 100 min; 75% Alkohol für 60 min; 85% Alkohol für 60 min; 95% Alkohol für 60 min; 100% Alkohol für 60 min; 100% Alkohol für 60 min; 100% Alkohol für 60 min; Xylol für 35 min; Xylol für 20 min; Xylol für 20 min; Wachs für 80 min; Wachs für 80 min; 80 Min. wachs lassen. Der Vorgang dauert ca. 15 h.
2. Öffnen Sie am Ende der Gewebetrocknung die Reaktionskammer des Dörrgeräts und entfernen Sie den Gewebekorb.

3. Einbettung von Gewebe

1. Nehmen Sie eine geeignete Einbettform entsprechend der Größe der Probe heraus und füllen Sie sie bei 70 °C mit Paraffinwachs.
2. Legen Sie das Gewebe schnell in die Form und stellen Sie es vorsichtig so ein, dass sich das Gewebe in der Mitte der Form befindet.
3. Bewegen Sie die Form sanft auf die Kühlplatte und drücken Sie das Gewebe vorsichtig an, während das Paraffin am Boden aushärtet.
4. Legen Sie die Einbettkassette auf die Form und füllen Sie sie mit mehr Wachs auf.
5. Stellen Sie die Form auf die Kühlplatte, und wenn das Paraffin vollständig erstarrt ist, entfernen Sie den Block mit der angebrachten Kassette von der Form.

4. Gewebeschnitte

1. Setzen Sie den Block in die Probenklammer des Mikrotoms ein, setzen Sie die Klinge in die Halterung, stellen Sie den Winkel zwischen der Ebene des Blocks und der Klinge ein, stellen Sie die Dicke des Abschnitts auf 4 μm ein, drehen Sie das Handrad und beginnen Sie mit dem Schneiden.
2. Legen Sie die entsprechende Gewebeoberfläche frei, indem Sie einige dünne Abschnitte aus dem Block schneiden. Nehmen Sie die durchgehenden und vollständigen Abschnitte mit der Bürste heraus.
3. Wenn genügend Abschnitte geschnitten sind, hören Sie auf, das Handrad zu drehen, entfernen Sie die unqualifizierten Abschnitte am vorderen Ende mit einer Pinzette und schwimmen Sie die Abschnitte auf der Oberfläche von 42 °C heißem Wasser im Wasserbad mit Pinzette und Bürste.
4. Nachdem die Abschnitte vollständig abgeflacht sind, die Abschnitte auf Anti-Ablösungs-Objektträgern aufnehmen und 60 Minuten lang auf einem Objektträgerwärmer bei 65 °C backen.
5. Wenn das Backen beendet ist, nehmen Sie die Glasträger aus dem Objektträgerwärmer.

5. Immunhistochemische Färbung

1. Verdünnen Sie den Primärantikörper in eine Arbeitslösung mit Antikörperverdünnungsmittel. Weitere Informationen finden Sie in Tabelle 1 .
2. Geben Sie die verdünnte Antikörperlösung in eine spezielle Reagenzflasche und das Detektionskit in das Reagenzfach eines automatischen IHC-Färbegeräts (siehe Materialtabelle).
3. Legen Sie die Objektträger auf einen Objektträgerhalter, der mit einer speziellen Abdeckung bedeckt ist, und setzen Sie sie in das experimentelle Reaktionsfach des Geräts ein.
4. Nachdem das Gerät das Reagenz und die experimentellen Informationen auf dem Objektträger automatisch erkannt hat, klicken Sie auf die Schaltfläche Start , um die immunhistochemische Färbung zu starten. Das Experiment dauert ca. 3 h.

6. Entwässerung und Versiegelung des Objektträgers

1. Nehmen Sie nach der immunhistochemischen Färbung den Objektträgerhalter heraus, nehmen Sie die spezielle Abdeckung ab, legen Sie den gefärbten Objektträger in den Objektträgerhalter und waschen Sie den restlichen Farbstoff auf dem Objektträger mit klarem Wasser ab.
2. Füllen Sie den Objektträgerhalter in einen automatischen Eindeckbehälter (siehe Materialtabelle), wählen Sie den Trocknungs- und Versiegelungsvorgang aus und führen Sie ihn aus.
3. Nehmen Sie die Objektträger nach dem Trocknen und Versiegeln heraus.

7. Objektträger scannen

1. Legen Sie die Objektträger auf die Objektträgerablage des pathologischen Panorama-Bildscanners (siehe Materialtabelle) und legen Sie sie in das Objektträger-Scanfach des Instruments, um pathologische Panoramabilder zu scannen. Der Scanvorgang dauert 2 Minuten. Siehe Abbildung 1.

8. Analyse von Bildern

1. Bild importieren
   1. Öffnen Sie die pathologische Bildanalyse-Software (siehe Materialtabelle) und legen Sie einen neuen Ordner an. Importieren Sie immunhistochemische Bilder, die analysiert werden sollen.
2. Erstellen eines Gewebeklassifikators
   1. Markieren Sie mehrere Gewebe und leere Annotationen, um einen Klassifikator zur Identifizierung des Gewebes bzw. des leeren Bereichs zu trainieren und einzurichten.
   2. Verwenden Sie Echtzeit-Tuning, um die Erkennungskapazität der Software während der Markierungsannotation in Echtzeit zu beobachten. Wenn die Erkennung nicht rechtzeitig erfolgt, markieren Sie die Annotation und trainieren Sie erneut, bis die Gewebeerkennung korrekt ist.
3. Analysealgorithmus erstellen
   1. Wählen Sie den Standardalgorithmus in der Software entsprechend der Art des Experiments aus: Multiplex-IHC.
   2. Legen Sie die Farbparameter der Zellerkennung fest, indem Sie typische negative und positive Pixel auswählen.
      Stellen Sie auf dieser Grundlage die Parameter von Zellkern, Zytoplasma und Zellmembran ein und beobachten Sie die Zellerkennungssituation in Echtzeit, bis die für das Bild am besten geeigneten Parameter gefunden sind.
   3. Stellen Sie die positive Zellerkennungsschwelle ein und beobachten Sie die Erkennungssituation in Echtzeit, bis die entsprechende Schwelle angepasst ist.
   4. Wählen Sie den Gewebeklassifikator im Algorithmus aus und überprüfen Sie den Gewebeteil im Gewebeklassifikator, um Zellen anhand von Geweben zu identifizieren. An dieser Stelle ist die Etablierung eines Analysealgorithmus abgeschlossen.
4. Ausführen der Bildanalyse
   1. Wählen Sie den Analysebereich aus. Verwenden Sie den etablierten Algorithmus, um Bilder zu analysieren.
5. Nachdem die Softwareanalyse abgeschlossen ist, überprüfen Sie manuell, ob die Bilderkennung korrekt ist, einschließlich Gewebeerkennung, negativer und positiver Zellerkennung.
6. Wenn die Bilderkennung nicht genau ist, passen Sie den Algorithmus und den Parameterschwellenwert erneut an, und führen Sie die Bildanalyse erneut aus, bis Sie erfolgreich sind. Exportieren Sie die Ergebnisse der Analyse. Siehe Abbildung 1.
7. Auch andere Immunzellen können nach den oben genannten Schritten analysiert werden (siehe Abbildung 1). Stellen Sie verschiedene Analyseparameter entsprechend der tatsächlichen Expression verschiedener Endometrium-Immunmarker (CD56+uNK-Zellen, Foxp3+Tregs, CD68+-Makrophagen, CD163+M2-Makrophagen, CD1a+DCs und CD8⁺T-Zellen^25,26) ein.
8. Durch die Berechnung der Software erhalten Sie den Anteil der Endometrium-Immunzellen (siehe Tabelle 2). Verwenden Sie dies, um die Konzentrationen verschiedener Immunzellen in der Gebärmutterschleimhaut von Patientinnen mit wiederholten Fehlgeburten zu bewerten.

Ergebnisse

Um endometriale Immunzellen quantitativ zu bewerten und die durch vom Menschen verursachte Instabilität zu reduzieren, haben wir eine digitale quantitative Analyseplattform für Endometrium-Immunzellen etabliert, indem wir einen automatischen immunhistochemischen Nachweis und ein digitales quantitatives Auswertungssystem verwenden. Eine immunhistochemische Bildanalyseplattform wurde etabliert, um Immunzellen des Endometriums von Patientinnen mit wiederholten Fehlgeburten (RM) im Implantationsfenster quantitativ zu analy...

Diskussion

Mit diesem Protokoll wurde eine digitale immunhistochemische Bildanalyseplattform zur quantitativen Analyse von Immunzellen des Endometriums von RM-Patientinnen etabliert. Hier wurden sechs Endometrium-Immunmarker detektiert, um die Mikroumgebung des Endometriumimmuns bei RM-Patientinnen zu bewerten.

Ein rezeptives Endometrium während der mittleren Lutealphase ist der Schlüssel für eine erfolgreiche Einnistung und Schwangerschaft^27,28

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automated coverslipper	Sakuraus	DRS-Prisma-P-JCS&Film-JC2
CD163	GrowGn Biotechnology	NCL-L-CD163
CD1a	Gene Tech	GM357129
CD56	Gene Tech	GT200529
CD8	Novocastra	NCL-L-CD8-4B11
Dehydrator	Thermo Fisher	Excelsior ES
Digital pathology and	Indica labs	HALO
Foxp3	YILIFANG biological	14-477-82
IHC stainer	Leica	BOND III
Image analysis platform	Indica labs	HALO
Slide Scanner	Olympus life science	VS200