小鼠肺静脉心肌套的显微解剖和免疫荧光染色

摘要

该方案展示了小鼠肺静脉的显微镜引导分离和免疫荧光染色。我们制备包含左心房、肺静脉和相应肺的组织样本，并对它们进行心脏肌钙蛋白 T 和连接蛋白 43 染色。

摘要

肺静脉 （PV） 是房性心律失常中异位搏动的主要来源，在心房颤动 （AF） 的发生和进展中起着至关重要的作用。PV 包含由心肌细胞组成的心肌套管 （MS）。多发性硬化症与心房颤动的发生和维持有关，因为它们保留了与心脏工作心肌的相似性，包括产生异位电脉冲的能力。啮齿动物被广泛使用，并且可能代表研究肺静脉心肌的优秀动物模型，因为心肌细胞广泛存在于血管壁上。然而，由于器官体积小且解剖结构复杂，小鼠 PV 的精确显微解剖和制备具有挑战性。

我们展示了一种显微镜引导的显微解剖方案，用于将小鼠左心房 （LA） 与 PV 一起分离。 使用心脏肌钙蛋白-T （cTNT） 和连接蛋白 43 （Cx43） 抗体进行免疫荧光染色以全长观察 LA 和 PV。10 倍和 40 倍放大倍率的成像提供了 PV 结构的全面视图以及对心肌结构的详细见解，特别是突出了 MS 中连接蛋白 43 的存在。

引言

心房颤动 （AF） 是最常见的持续性心律失常¹。心房颤动的患病率进一步增加，预计 2060 年欧洲将有 ~1790 万患者¹。心房颤动在临床上非常重要，因为它是发生心肌梗死、心力衰竭或卒中的重要危险因素，可导致巨大的个人、社会和社会经济负担¹。尽管 AF 已为人所知数十年，但 AF 的病理生理学仍未完全了解²。

早在 1990 年代后期，研究表明肺静脉 （PV） 在启动和维持 AF 方面具有巨大影响，因为它们是触发 AF 的异位搏动的主要来源³。已经证明PV在结构上与其他血管不同。虽然典型的血管含有平滑肌细胞，但 PV 的被膜介质也含有心肌细胞⁴。在啮齿动物中，这种心脏肌肉组织普遍存在于整个 PV 中，包括肺内和肺外部分，以及孔口区域⁵。在人类中，PV 还含有心肌细胞，可以在左心房 （LA） 心肌的延伸部分（所谓的心肌套管 （MS）^6,7 内观察到。

MS 与心房心肌

研究方案

动物护理和所有实验程序均按照慕尼黑路德维希-马克西米利安大学动物护理和伦理委员会的指南进行，所有使用小鼠的程序均获得 Regierung von Oberbayern （ROB 55.2-2532） 的批准。Vet_02-20-215，ROB 55.2-2532。Vet_02-18-46，ROB 55.2-2532。Vet_02-19-86，ROB 55.2-2532。Vet_02-21-178，ROB 55.2-2532。Vet_02-22-170）。C57BL6/N小鼠是商业化获得的。

1. 准备工作

1. 通过在 500 mL 锥形瓶中混合 3 mg 琼脂糖和 100 mL 1x Tris 缓冲盐水来制备 3% 琼脂糖凝胶。在微波炉中以600W加热溶液2-3分钟，直到凝胶变得均匀。
2. 通过将凝胶轻轻倒入直径为100毫米的培养皿中来准备解剖皿。用凝胶填充培养皿的一半。清除凝胶中的气泡，以确保均匀的稠度。让解剖皿冷却，直到凝胶变成固体。
3. 根据 表1中提供的配方制备所需的所有缓冲液和溶液，包括固定溶液，透化溶液，封闭缓冲液和洗涤缓冲液。

2. 器官摘取和组织制备

注意：详细说明小鼠麻醉和收获心脏程序的广泛协....

讨论

通过该协议，我们分享了一种区分和分离小鼠心脏PV并对其进行免疫荧光染色的方法。摘取器官后，将心肺在灭菌蔗糖溶液中脱水，然后在显微镜引导下将心室与心房和肺叶分离。之后，准备心脏底座可视化 PV，然后将它们从肺门处的肺部切下。随后使用冷冻技术进行免疫荧光染色，将组织包埋在 O.C.T. 化合物中，用冷冻组切割，然后对 cTNT 和 Cx43 进行免疫荧光染色。

分离 PV .......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion slides	Epredia	10149870
AF568-secondary antibody	Invitrogen	A11036	Host: Goat, Reactivity: Rabbit
Agarose	Biozym LE	840104
Alexa Fluor 488-secondary antibody	Cell Signaling Technology	4408S	Host: Goat, Reactivity: Mouse
Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody	Abcam	ab11370	Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit
Anti-cTNT antibody	Invitrogen	MA5-12960	Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A2153
Brush	Lukas	5486	size 6
Cover slips	Epredia		24 mm x 50 mm
Cryotome Cryo Star NX70	Epredia		Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C
DFC365FX camera	Leica
DM6 B fluorescence microscope	Leica
Dry ice
Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc.	Gibco	14040133	500 mL
Dumont #5FS Forceps	F.S.T.	91150-20	2 pieces needed
Fine Scissors	F.S.T.	14090-09
Fluorescence mounting medium	DAKO	S3023
Graefe Forceps	F.S.T.	11052-10
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Cell nuclei counterstaining
ImageJ	FIJI		analysis and processing software
LAS X	Leica		Imaging software for Leica DM6 B
Microtome blades S35	Feather	207500000
Microwave
Normal goat serum	Sigma-Aldrich	S26-M
O.C.T. compound	Tissue-Tek	4583
Paraformaldehyde 16%	Pierce	28908	methanol-free
Pasteur pipettes	VWR	612-1681
Petri dish	TPP	93100	100 mm diameter
Rocker 3D digital	IKA Schüttler	00040010000
Slide staining jars	EasyDip	M900-12
Specimen Molds	Tissue-Tek Cryomold	4557	25 mm x 20 mm x 5 mm
StainTray M920 staining system	StainTray	631-1923	Staining system for 20 slides
Sterican Needle	Braun	4657705	G 27 - used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol
Student Vannas Spring Scissors	F.S.T.	91500-09
Super PAP Pen Liquid Blocker	Super PAP Pen	N71310-N
Syringes	Braun	4606108V	10 mL
Tris base	Roche	TRIS-RO	component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS)
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287