Microdisección y tinción con inmunofluorescencia de mangas miocárdicas en venas pulmonares murinas

Resumen

Este protocolo demuestra el aislamiento guiado por microscopía y la tinción por inmunofluorescencia de las venas pulmonares murinas. Preparamos muestras de tejido que contienen la aurícula izquierda, las venas pulmonares y los pulmones correspondientes y las teñimos para troponina T cardíaca y conexina 43.

Resumen

Las venas pulmonares (VP) son la principal fuente de latidos ectópicos en las arritmias auriculares y desempeñan un papel crucial en el desarrollo y la progresión de la fibrilación auricular (FA). Los VP contienen mangas miocárdicas (EM) compuestas por cardiomiocitos. Los SM están implicados en el inicio y mantenimiento de la FA, ya que conservan similitudes con el miocardio cardíaco que funciona, incluida la capacidad de generar impulsos eléctricos ectópicos. Los roedores son ampliamente utilizados y pueden representar excelentes modelos animales para estudiar el miocardio de la vena pulmonar, ya que los cardiomiocitos están ampliamente presentes en toda la pared del vaso. Sin embargo, la microdisección y preparación precisas de las VP murinas es un reto debido al pequeño tamaño de los órganos y a la intrincada anatomía.

Demostramos un protocolo de microdisección guiada por microscopía para aislar la aurícula izquierda murina (AI) junto con los VPs. Se realiza una tinción de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos cardíacos contra la troponina-T (cTNT) y la conexina 43 (Cx43) para visualizar los AL y los VPs en toda su longitud. Las imágenes con aumentos de 10x y 40x proporcionan una visión completa de la estructura de la VP, así como información detallada sobre la arquitectura miocárdica, destacando especialmente la presencia de la conexina 43 dentro de la EM.

Introducción

La fibrilación auricular (FA) es la arritmia sostenida más frecuente¹. La prevalencia de la FA está aumentando aún más, con un número esperado de ~17,9 millones de pacientes en Europa en 2060¹. La FA es clínicamente muy importante, ya que es un factor de riesgo esencial para el desarrollo de infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca o accidente cerebrovascular, lo que resulta en una enorme carga individual, social y socioeconómica¹. A pesar de que la FA se conoce desde hace décadas, la fisiopatología de la FA aún no se comprende completamente².

Protocolo

El cuidado de los animales y todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo siguiendo las directrices del Comité de Ética y Cuidado de los Animales de la Universidad Ludwig-Maximilians de Múnich, y todos los procedimientos con ratones fueron aprobados por el Regierung von Oberbayern (ROB 55.2-2532. Vet_02-20-215, ROB 55.2-2532. Vet_02-18-46, ROB 55.2-2532. Vet_02-19-86, ROB 55.2-2532. Vet_02-21-178, ROB 55.2-2532. Vet_02-22-170). Los ratones C57BL6/N se obtuvieron comercialmente.

1. Preparación

1. Prepare un gel de agarosa al 3% mezclando 3 mg de agarosa y 100 ml de solución salina tamponada con 1x Tris e....

Discusión

Con este protocolo, compartimos un método para distinguir y aislar las VPs del corazón del ratón y realizar tinciones de inmunofluorescencia sobre ellas. Después de la extracción de órganos, el corazón y los pulmones se deshidrataron en una solución de sacarosa esterilizada, seguida de la separación de los ventrículos de la aurícula y los lóbulos pulmonares bajo guía microscópica. Posteriormente, se preparó la base del corazón para visualizar los VP y luego se cortaron de los pulmones en el hilio. La post.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion slides	Epredia	10149870
AF568-secondary antibody	Invitrogen	A11036	Host: Goat, Reactivity: Rabbit
Agarose	Biozym LE	840104
Alexa Fluor 488-secondary antibody	Cell Signaling Technology	4408S	Host: Goat, Reactivity: Mouse
Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody	Abcam	ab11370	Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit
Anti-cTNT antibody	Invitrogen	MA5-12960	Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A2153
Brush	Lukas	5486	size 6
Cover slips	Epredia		24 mm x 50 mm
Cryotome Cryo Star NX70	Epredia		Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C
DFC365FX camera	Leica
DM6 B fluorescence microscope	Leica
Dry ice
Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc.	Gibco	14040133	500 mL
Dumont #5FS Forceps	F.S.T.	91150-20	2 pieces needed
Fine Scissors	F.S.T.	14090-09
Fluorescence mounting medium	DAKO	S3023
Graefe Forceps	F.S.T.	11052-10
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Cell nuclei counterstaining
ImageJ	FIJI		analysis and processing software
LAS X	Leica		Imaging software for Leica DM6 B
Microtome blades S35	Feather	207500000
Microwave
Normal goat serum	Sigma-Aldrich	S26-M
O.C.T. compound	Tissue-Tek	4583
Paraformaldehyde 16%	Pierce	28908	methanol-free
Pasteur pipettes	VWR	612-1681
Petri dish	TPP	93100	100 mm diameter
Rocker 3D digital	IKA Schüttler	00040010000
Slide staining jars	EasyDip	M900-12
Specimen Molds	Tissue-Tek Cryomold	4557	25 mm x 20 mm x 5 mm
StainTray M920 staining system	StainTray	631-1923	Staining system for 20 slides
Sterican Needle	Braun	4657705	G 27 - used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol
Student Vannas Spring Scissors	F.S.T.	91500-09
Super PAP Pen Liquid Blocker	Super PAP Pen	N71310-N
Syringes	Braun	4606108V	10 mL
Tris base	Roche	TRIS-RO	component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS)
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287