Микродиссекция и иммунофлуоресцентное окрашивание рукавов миокарда в легочных венах мышей

Резюме

Этот протокол демонстрирует изоляцию под контролем микроскопии и иммунофлуоресцентное окрашивание легочных вен мышей. Мы подготавливаем образцы тканей, содержащие левое предсердие, легочные вены и соответствующие легкие, и окрашиваем их на сердечные тропонины Т и коннексин 43.

Аннотация

Легочные вены (ЛВ) являются основным источником эктопических биений при предсердных аритмиях и играют решающую роль в развитии и прогрессировании фибрилляции предсердий (ФП). ПВ содержат рукава миокарда (МС), состоящие из кардиомиоцитов. Рассеянный склероз участвует в инициации и поддержании мерцательной аритмии, поскольку он сохраняет сходство с работающим миокардом сердца, включая способность генерировать эктопические электрические импульсы. Грызуны широко используются и могут представлять собой отличные животные модели для изучения миокарда легочной вены, поскольку кардиомиоциты широко представлены по всей стенке сосуда. Тем не менее, точное микровскрытие и приготовление мышиных ПВ является сложной задачей из-за небольшого размера органа и сложной анатомии.

Мы демонстрируем протокол микродиссекции под контролем микроскопии для изоляции левого предсердия мыши (ЛП) вместе с ЛВ. Иммунофлуоресцентное окрашивание с использованием сердечных антител к тропонину-Т (цТНТ) и коннексину 43 (Сх43) выполняется для визуализации ЛП и ЛП в полный рост. Визуализация при 10-кратном и 40-кратном увеличении обеспечивает всестороннее представление о структуре ФВ, а также детальное представление об архитектуре миокарда, в частности, подчеркивая присутствие коннексина 43 в МС.

Введение

Фибрилляция предсердий (ФП) является наиболее распространенной устойчивой аритмией¹. Распространенность мерцательной аритмии продолжает расти: ожидается, что в 2060 г. число пациентов в Европе составит ~17,9 млн^1. Мерцательная аритмия имеет большое клиническое значение, поскольку является существенным фактором риска развития инфаркта миокарда, сердечной недостаточности или инсульта, что приводит к огромному индивидуальному, социальному и социально-экономическому бремени1^. Несмотря на то, что мерцательная аритмия известна уже несколько десятилетий, патофизиология мерцательной аритмии до сих пор до ....

протокол

Уход за животными и все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с рекомендациями Комитета по уходу за животными и этике Мюнхенского университета им. Людвига-Максимилиана, а все процедуры с использованием мышей были одобрены Regierung von Oberbayern (ROB 55.2-2532. Vet_02-20-215, РОБ 55.2-2532. Vet_02-18-46, РОБ 55.2-2532. Vet_02-19-86, РОБ 55.2-2532. Vet_02-21-178, РОБ 55.2-2532. Vet_02-22-170). Мыши C57BL6/N были получены в промышленных масштабах.

1. Подготовка

1. Приготовьте 3% агарозный гель, смешав 3 мг агарозы и 100 мл 1x Tris-буферного физиологического раствора в колбе Эрленмейера объемом 500 мл.....

Результаты

Мы провели микродиссекцию, окрашивание и визуализацию ВП у 10 мышей в возрасте 12-16 недель. Следуя протоколу, мы успешно провели микропрепарирование ФВ вместе с ЛП у всех подопытных мышей и получили срезы с комплексным изображением ФВ у восьми мышей. Обзорные изображения были сделаны при .......

Обсуждение

С помощью этого протокола мы делимся методом различения и изоляции ВП сердца мыши и проведения на них иммунофлуоресцентного окрашивания. После забора органов сердце и легкие обезвоживали в стерилизованном растворе сахарозы с последующим отделением желудочков от предсердий и долей л?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion slides	Epredia	10149870
AF568-secondary antibody	Invitrogen	A11036	Host: Goat, Reactivity: Rabbit
Agarose	Biozym LE	840104
Alexa Fluor 488-secondary antibody	Cell Signaling Technology	4408S	Host: Goat, Reactivity: Mouse
Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody	Abcam	ab11370	Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit
Anti-cTNT antibody	Invitrogen	MA5-12960	Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A2153
Brush	Lukas	5486	size 6
Cover slips	Epredia		24 mm x 50 mm
Cryotome Cryo Star NX70	Epredia		Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C
DFC365FX camera	Leica
DM6 B fluorescence microscope	Leica
Dry ice
Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc.	Gibco	14040133	500 mL
Dumont #5FS Forceps	F.S.T.	91150-20	2 pieces needed
Fine Scissors	F.S.T.	14090-09
Fluorescence mounting medium	DAKO	S3023
Graefe Forceps	F.S.T.	11052-10
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Cell nuclei counterstaining
ImageJ	FIJI		analysis and processing software
LAS X	Leica		Imaging software for Leica DM6 B
Microtome blades S35	Feather	207500000
Microwave
Normal goat serum	Sigma-Aldrich	S26-M
O.C.T. compound	Tissue-Tek	4583
Paraformaldehyde 16%	Pierce	28908	methanol-free
Pasteur pipettes	VWR	612-1681
Petri dish	TPP	93100	100 mm diameter
Rocker 3D digital	IKA Schüttler	00040010000
Slide staining jars	EasyDip	M900-12
Specimen Molds	Tissue-Tek Cryomold	4557	25 mm x 20 mm x 5 mm
StainTray M920 staining system	StainTray	631-1923	Staining system for 20 slides
Sterican Needle	Braun	4657705	G 27 - used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol
Student Vannas Spring Scissors	F.S.T.	91500-09
Super PAP Pen Liquid Blocker	Super PAP Pen	N71310-N
Syringes	Braun	4606108V	10 mL
Tris base	Roche	TRIS-RO	component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS)
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287