マウス肺静脈における心筋スリーブの微小解剖および免疫蛍光染色

要約

このプロトコルはマウスの肺静脈の顕微鏡検査導かれた隔離そしてimmunofluorescenceの汚損を示す。左心房、肺静脈、および対応する肺を含む組織サンプルを調製し、心臓トロポニンTおよびコネキシン43について染色します。

要約

肺静脈(PV)は、心房性不整脈における異所性拍動の主要な原因であり、心房細動(AF)の発症と進行に重要な役割を果たします。PVには、心筋細胞で構成される心筋スリーブ(MS)が含まれています。MSは、異所性電気インパルスを生成する能力など、心臓の働く心筋との類似性を維持するため、AFの開始と維持に関与しています。げっ歯類は広く使用されており、心筋細胞は血管壁全体に広く存在するため、肺静脈心筋を研究するための優れた動物モデルを表す可能性があります。しかし、マウスPVの正確なマイクロダイセクションと調製は、臓器のサイズが小さく、解剖学的構造が複雑なため、困難です。

マウスの左心房(LA)をPVとともに単離するための顕微鏡ガイド下顕微解剖プロトコルを実証します。 心臓トロポニン-T(cTNT)およびコネキシン43(Cx43)抗体を使用して免疫蛍光染色を行い、LAとPVの全長を可視化します。10倍および40倍の倍率でのイメージングは、PV構造の包括的なビューと心筋構造への詳細な洞察を提供し、特にMS内のコネキシン43の存在を強調しています。

概要

心房細動(AF)は、最も一般的な持続性不整脈^です1。心房細動の有病率はさらに増加しており、2060年にはヨーロッパで~1,790万人の患者数が見込まれ^{ています1。}心房細動は、心筋梗塞、心不全、脳卒中の発症に不可欠な危険因子であり、個人的、社会的、社会経済的に多大な負担をもたらすため、臨床的に^{非常に重要です1。}心房細動は何十年も前から知られていますが、心房細動の病態生理学はまだ完全には理解されていません²。

すでに1990年代後半には、肺静脈(PV)が心房細動を誘発する異所性拍動の主な発生源であるため、心房細動の開始と維持に大きな影響を与えることが研究で実証されています³。PVは他の血管とは構造的に異なることが実証されています。一般的な血管には平滑筋細胞が含まれていますが、PVのチュニカ培地には心筋細胞^{も含まれています4}。げっ歯類では、この心臓の筋肉組織は、肺内および肺外部分、ならびに開口部領域を含むPV全体に遍在^する5。ヒトでは、PVには心筋細胞も含まれており、左心房(LA)の心筋、いわゆる心筋スリーブ(MS)の延長部内で観察することができます<....

プロトコル

動物の飼育とすべての実験手順は、ミュンヘンのルートヴィヒ・マクシミリアン大学の動物管理および倫理委員会のガイドラインに従って実施され、マウスを使用したすべての手順は、Regierung von Oberbayern(ROB 55.2-2532)によって承認されました。Vet_02-20-215、ロブ55.2-2532。Vet_02-18-46、ロブ55.2-2532。Vet_02-19-86、ROB 55.2-2532。Vet_02-21-178、ロブ55.2-2532。Vet_02-22-170)です。C57BL6/Nマウスを市販した。

1. 事前準備

1. 500 mL三角フラスコに3 mgのアガロースと1xトリス緩衝生理食塩水100 mLを混合して、3%アガロースゲルを調製します。ゲルが均一になるまで、溶液を600Wの電子レンジで2〜3分間加熱します。
2. 直径100mmのシャーレにゲルを静かに流し込んで、解剖ディッシュを準備します。ペトリ皿の半分をゲルで満たします。ゲルから気泡を取り除き、均質な粘稠度を確保します。ゲルが固まるまで解剖皿を冷ましておきます。
3. 固定液、透過処理液、ブロッキング液、洗浄液など、必要なすべての緩衝液と溶液を、 表 1 のレシピに従って調製します。

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ディスカッション

このプロトコルでは、マウス心臓のPVを区別して単離し、免疫蛍光染色を行う方法を共有しています。臓器摘出後、心臓と肺を滅菌したスクロース溶液で脱水し、続いて顕微鏡ガイド下で心室を心房と肺葉から分離しました。その後、心臓ベースを準備してPVを視覚化し、肺門からPVを切除しました。その後の免疫蛍光染色は、組織をO.C.T.化合物に包埋し、クライオトームで切断し、cTNTとCx43?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion slides	Epredia	10149870
AF568-secondary antibody	Invitrogen	A11036	Host: Goat, Reactivity: Rabbit
Agarose	Biozym LE	840104
Alexa Fluor 488-secondary antibody	Cell Signaling Technology	4408S	Host: Goat, Reactivity: Mouse
Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody	Abcam	ab11370	Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit
Anti-cTNT antibody	Invitrogen	MA5-12960	Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A2153
Brush	Lukas	5486	size 6
Cover slips	Epredia		24 mm x 50 mm
Cryotome Cryo Star NX70	Epredia		Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C
DFC365FX camera	Leica
DM6 B fluorescence microscope	Leica
Dry ice
Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc.	Gibco	14040133	500 mL
Dumont #5FS Forceps	F.S.T.	91150-20	2 pieces needed
Fine Scissors	F.S.T.	14090-09
Fluorescence mounting medium	DAKO	S3023
Graefe Forceps	F.S.T.	11052-10
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Cell nuclei counterstaining
ImageJ	FIJI		analysis and processing software
LAS X	Leica		Imaging software for Leica DM6 B
Microtome blades S35	Feather	207500000
Microwave
Normal goat serum	Sigma-Aldrich	S26-M
O.C.T. compound	Tissue-Tek	4583
Paraformaldehyde 16%	Pierce	28908	methanol-free
Pasteur pipettes	VWR	612-1681
Petri dish	TPP	93100	100 mm diameter
Rocker 3D digital	IKA Schüttler	00040010000
Slide staining jars	EasyDip	M900-12
Specimen Molds	Tissue-Tek Cryomold	4557	25 mm x 20 mm x 5 mm
StainTray M920 staining system	StainTray	631-1923	Staining system for 20 slides
Sterican Needle	Braun	4657705	G 27 - used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol
Student Vannas Spring Scissors	F.S.T.	91500-09
Super PAP Pen Liquid Blocker	Super PAP Pen	N71310-N
Syringes	Braun	4606108V	10 mL
Tris base	Roche	TRIS-RO	component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS)
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287