Murin Pulmoner Venlerde Miyokard Kılıflarının Mikrodiseksiyonu ve İmmünofloresan Boyanması

Özet

Bu protokol, murin pulmoner venlerinin mikroskopi kılavuzluğunda izolasyonunu ve immünofloresan boyamasını gösterir. Sol atriyum, pulmoner venler ve ilgili akciğerleri içeren doku örnekleri hazırlıyoruz ve bunları kardiyak Troponin T ve Connexin 43 için boyuyoruz.

Özet

Pulmoner venler (PV'ler) atriyal aritmilerde ektopik atımların ana kaynağıdır ve atriyal fibrilasyonun (AF) gelişiminde ve ilerlemesinde çok önemli bir rol oynar. PV'ler, kardiyomiyositlerden oluşan miyokardiyal kılıflar (MS) içerir. MS, ektopik elektriksel uyarılar üretme yeteneği de dahil olmak üzere kardiyak çalışan miyokard ile benzerlikleri korudukları için AF'nin başlatılması ve sürdürülmesinde rol oynar. Kemirgenler yaygın olarak kullanılır ve kardiyomiyositler damar duvarının her yerinde yaygın olarak bulunduğundan, pulmoner ven miyokardını incelemek için mükemmel hayvan modellerini temsil edebilir. Bununla birlikte, küçük organ boyutu ve karmaşık anatomi nedeniyle murin PV'lerinin hassas mikrodiseksiyonu ve hazırlanması zordur.

PV'ler ile birlikte murin sol atriyumunu (LA) izole etmek için mikroskopi kılavuzluğunda bir mikrodiseksiyon protokolü gösterdik. LA ve PV'leri tam uzunlukta görüntülemek için kardiyak Troponin-T (cTNT) ve konneksin 43 (Cx43) antikorları kullanılarak immünofloresan boyama yapılır. 10x ve 40x büyütmede görüntüleme, PV yapısının kapsamlı bir görünümünün yanı sıra miyokard mimarisine ilişkin ayrıntılı bilgiler sağlar, özellikle MS içinde connexin 43'ün varlığını vurgular.

Giriş

Atriyal fibrilasyon (AF) en sık görülen sürekli aritmidir¹. AF prevalansı, 2060 yılında Avrupa'da beklenen ~17,9 milyon hasta sayısıyla daha da artmaktadır¹. AF, miyokard enfarktüsü, kalp yetmezliği veya inme gelişimi için önemli bir risk faktörü olduğu ve muazzam bir bireysel, sosyal ve sosyoekonomik yüke neden olduğu için klinik olarak oldukça önemlidir¹. AF onlarca yıldır bilinmesine rağmen, AF'nin patofizyolojisi hala tam olarak anlaşılamamıştır².

Zaten 1990'ların sonlarında, çalışmalar pulmoner venlerin (PV'ler) AF'yi başlatmada ve sürdürmede büyük etkisini göstermiştir, çünkü bunlar AF'yi tetikleyen ektopik atımların^{ana kaynağıdır 3}. PV'lerin yapısal olarak diğer kan damarlarından farklı olduğu gösterilmiştir. Tipik kan damarları düz kas hücreleri içerirken, PV'lerin tunika ortamı da kardiyomiyositler^{içerir 4}. Kemirgenlerde, bu kardiyak kas sistemi, intra ve ekstrapulmoner kısımların yanı sıra orifis bölgesi⁵ dahil olmak üzere tüm PV'ler boyunca her yerde bulunur. İnsanlarda, PV'ler ayrıca sol atriyal (LA) miyokard olarak adlandırılan miyokard kılıflarının (MS) uzantılarında gözlenebilen kardiyomiyositler ^içerir6,7.

MS, atriyal miyokard⁸ ile morfolojik benzerliklere sahiptir. Atriyal ve PV kardiyomiyositlerin şekli ve boyutu birbirleri arasında önemli ölçüde farklılık göstermez ve karşılaştırılabilir elektrofizyolojik özellikler gösterir⁸. PV içindeki elektrofizyolojik kayıtlar MS'in elektriksel aktivitesini kanıtlamıştır ve anjiyografik görüntüleme kalp atışı^ile senkronize kasılmaları ortaya koymuştur ^9,10.

Boşluk bağlantıları, iyonların ve küçük moleküllerin geçişine izin veren altı conneksin alt biriminden oluşan gözenek oluşturan protein kompleksleridir¹¹. Hücreden hücreye atamalarda boşluk bağlantıları bulunur, komşu kardiyomiyositleri birbirine bağlar ve kardiyomiyositler^12,13 arasında hücreler arası bir elektriksel bağlantı sağlar. Kalpte birkaç konneksin izoformu eksprese edilir, konneksin 43 (Cx43) kalbin tüm bölgelerinde ifade edilen en yaygın izoformdur¹⁴. Önceki çalışmalar, PV'lerin^15,16 kardiyomiyositlerinde Cx43'ün ekspresyonu için kanıt sağlar.

Özellikle küçük hayvan modellerinde, hassas yapıları nedeniyle bozulmamış PV'lerde MS'i araştırmak zor olmaya devam etmektedir. Burada, mikroskopi kılavuzluğunda mikrodiseksiyon kullanarak farelerde PV'lerin LA ve akciğer lobları ile birlikte nasıl tanımlanacağını ve izole edileceğini gösteriyoruz. Ek olarak, kardiyomiyositleri ve PV'ler içindeki ara bağlantılarını görselleştirmek için PV'lerin immünofloresan (IF) boyamasını gösteriyoruz.

Protokol

Hayvan bakımı ve tüm deneysel prosedürler, Münih Ludwig-Maximilians-Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Etik Komitesi'nin yönergelerine göre gerçekleştirildi ve farelerin kullanıldığı tüm prosedürler Regierung von Oberbayern tarafından onaylandı (ROB 55.2-2532. Vet_02-20-215, ROB 55.2-2532. Vet_02-18-46, SOYGUN 55.2-2532. Vet_02-19-86, SOYGUN 55.2-2532. Vet_02-21-178, ROB 55.2-2532. Vet_02-22-170). C57BL6 / N fareleri ticari olarak elde edildi.

1. Hazırlık

1. 500 mL'lik bir Erlenmeyer şişesinde 3 mg agaroz ve 100 mL 1x Tris tamponlu salini karıştırarak% 3'lük bir agaroz jeli hazırlayın. Çözeltiyi bir mikrodalgada 600 W'ta 2-3 dakika jel homojen hale gelene kadar ısıtın.
2. Jeli 100 mm çapında bir Petri kabına yavaşça dökerek diseksiyon kabını hazırlayın. Petri kabının yarısını jel ile doldurun. Homojen bir kıvam sağlamak için jeldeki kabarcıkları temizleyin. Jel katılaşana kadar diseksiyon kabını soğumaya bırakın.
3. Sabitleme solüsyonu, geçirgenleştirme solüsyonu, bloke tamponu ve yıkama tamponu dahil olmak üzere gerekli tüm tamponları ve solüsyonları Tablo 1'de verilen tariflere göre hazırlayın.

2. Organ toplama ve doku hazırlama

NOT: Fare anestezisi ve kalbin alınması prosedürünü detaylandıran kapsamlı bir protokol daha önce yayınlanmıştır^17,18. Bu nedenle, bu bölümün sadece kısa bir açıklamasını sunuyoruz. Deneyler 12 ila 16 haftalık C57BL6 fareleri (altı erkek, dört dişi) üzerinde yapıldı. Erkeğin vücut ağırlığı 26 g'dan 28 g'a ve dişinin vücut ağırlığı 19 g'dan 22 g'a kadar uzanıyordu. Aşağıdaki adımlar önceden sistemik heparin enjeksiyonu yapılmadan gerçekleştirildi.

1. Fareyi izofluran (%5, %95 oksijen, Akış: 1 L/dk) ile uyuşturun ve yeterli anestezi derinliğini sağlayın.
2. Fareyi sırtüstü pozisyonda konumlandırarak operasyon masasına aktarın. Narkozu izofluran inhalasyonu (% 2,% 98 oksijen, Akış: 1 L / dak) ile bir anestezi maskesi ile koruyun ve fareyi ekstremitelerinde bantla sabitleyin. Analjezi için fentanil enjekte edin (0.1 mg / 25 g vücut ağırlığı i.p.).
3. Kürkü ksifoidal işlemde kaldırın ve enine 2 mm'lik bir kesim ayarlayın. Künt diseksiyon (makasın arka tarafı) kullanarak kürkü deri altı fasyadan ayırın ve göğüs kafesi ortaya çıkarmak için kesiği kraniyal ve yanal olarak uzatın.
4. Karın kaudalini kostal kemere dikkatlice açın. Diyaframı kaudalden kesmek ve akciğerlerin çökmesini sağlamak için ksifoidal işlemi hafifçe kaldırın. Daha sonra diyaframı herhangi bir organa zarar vermeden soldan sağa doğru kesin ve kalbi ortaya çıkarmak için göğüs kafesini iki taraflı olarak açın.
5. Fareyi kan durumuna düşürmek için kalp hala atarken inferior vena kava'yı (IVC) kesin ve 27 G'lik bir iğne ile sol ventriküle nüfuz ederek ve 10 mL buz gibi soğuk 1x fosfat tamponlu salin (PBS) enjekte ederek kalbi perfüze etmeye devam edin.
6. Fare kalbindeki kanı temizledikten sonra aort arkını, superior vena kava'yı (SVC) ve trakeayı bulun. Onları kalp tabanının ~ 3 mm yukarısından kesin ve bağlı akciğerlerle birlikte kalbi alın.
7. Hasat edilen organları, 2 mL sterilize edilmiş% 30 sükroz çözeltisi içeren 10 mL'lik konik bir tüpe daldırın. Numunelerin 4 °C'de 24 saat kurumasına izin verin.

3. LA ve PV'lerin mikroskopi kılavuzluğunda hazırlanması

1. Susuz kalmış kalbi ve akciğerleri 40-50 mL 1x PBS içeren bir diseksiyon kabına yerleştirin. 10x büyütmeli parlak alan mikroskobunun altına koyun ve aydınlatmayı ayarlayın. Kalbi dorsal yüzeyi ile diseksiyon kabına yerleştirin. Ventriküler ve atriyal duvar arasındaki geçişi belirleyin ve cerrahi makas kullanarak ventrikülleri atriyumdan dikkatlice ayırın.
   NOT: Bazı ventriküler dokuları tutmak için kulakçıklardan yaklaşık 1 mm aşağı kesin. Bu, daha sonra kalp tabanındaki yapılara zarar vermeden kulakçıkları diseksiyon kabına sabitlemek için gerekli olacaktır. Pozitif kontrol numunesi olarak kullanılabildikleri için ventrikülleri tutmanızı öneririz. Ventriküler dokuyu gömmek için, Bölüm 4'te açıklandığı gibi PV'lerin gömülmesi için özetlenen prosedürün aynısını izleyin.
2. Ayrılmış kulakçıkları ventriküler kesme yüzeyi (adım 3.1) ile kalp tabanı yukarı bakacak şekilde diseksiyon kabına yerleştirin. Kulakçıkları, akciğer lobları arkada, LA ve sol atriyal apendiks (LAA) sağda ve sağ atriyum (RAA) ve sağ atriyal apendiks (RAA) solda olacak şekilde yönlendirin. Kalan sol ventrikül dokusunu diseksiyon kabına sabitleyerek preparatı sabitleyin. Akciğer loblarını aşırı kuvvet uygulamadan nazikçe açın ve diseksiyon kabına sabitleyin (Şekil 1A).
3. Kalp tabanındaki anatomik işaretlere genel bir bakış edinin.
   1. Kalp tabanının merkezinde aort kemeri olan aortu bulun.
   2. Pulmoner gövdeyi (PT) doğrudan aortun sağından tespit edin ve pulmoner arterleri (PA'lar) ayırt etmek için posteriora doğru seyrini takip edin. Karşılık gelen akciğer hilusunu (LH) bulmak için sol lob ve sağ üst / orta loblara kadar olan rotalarını takip ederek konumlarını doğrulayın.
   3. Aortun arkasında yer alan trakea ve/veya sol ve sağ ana bronşların (L Br, R Br) pozisyonunu belirleyin ve LH'ye doğru seyrini takip ederek konumlarını doğrulayın (Şekil 1A).
   4. Aortun solundaki SVC'yi bulun ve RAA'nın yanındaki RA'ya doğru seyrini takip ederek doğrulayın.
4. Yukarıda belirtilen tüm tanımlanmış yer işaretlerini korurken kalp tabanının etrafındaki bağ ve yağ dokusunu çıkarın. Ek olarak, kalp tabanını serbestçe görebilmek için aort arkını ve trakeayı çıkarın (Şekil 1B).
5. İnce forseps kullanarak künt diseksiyon ile PA'ları atriyumun üst yüzeyinden nazikçe ayırın. Daha sonra, onları LH'de kesin ve sol atriyal serbest duvarı (LAFW) ve PV'leri tam boyutlarında ortaya çıkarmak için yana çevirin. Ana bronşları LH'den kesin ve bronş dokusunu çıkarın (Şekil 1C).
   NOT: LH, hem PA'lar hem de akciğerlere giden hava yolları için ortak giriş noktası ve PV'ler için çıkış noktası olarak hizmet eder. PV'lere herhangi bir zarar vermemek için LH'deki her prosedürün dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmesi önemlidir.
6. LA/RA ile sol ve sağ ventrikülü (LV, RV) ayırmak için, RA'yı ön taraftan açmak için kalan RV'nin ön kısmından başlayarak triküspit kapaktan (TV) SVC'nin ön tarafına kadar bir kesim yapın. RA ve LA'yı ayırmak için interatriyal septumun yanındaki posterior RA serbest duvarı (RAFW) kesin. LV ve RV'yi tamamen kesmek için interventriküler septumun yanındaki posterior sağ ventrikül duvarını kesin.
   NOT: Sağ atriyumun hazırlanması ve izolasyonu prosedürünü ayrıntılı olarak açıklayan kapsamlı bir protokol daha önce yayınlanmıştır¹⁹. RA'nın ayrılması, istenmeyen dokuyu LA-PV doku kompleksinden çıkarmak ve ek deneyler için doku toplamak için yararlıdır.
7. Bazal akciğer dokusunun bir kısmını keserek akciğer loblarının boyutunu küçültün, böylece yaklaşık 3-4 mm akciğer dokusu kalır.
   NOT: Akciğer loblarının apislerini, sonraki gömme adımları sırasında şamandıra görevi gördükleri için koruyun ve PV'lerin OCT bileşiğine yatay olarak gömülmesine izin verin.

4. Doku gömme

1. LA ve PV'ler de dahil olmak üzere preparatı, kalp tabanının ve akciğer tepesinin yukarı baktığından emin olarak bir kriyokalıba aktarın. Bunları fizyolojik bir konfigürasyonda düzenleyin - PV'lerin bükülmediğinden veya çevrilmediğinden emin olun.
2. Kriyokalıbı OCT bileşiği ile doldurun ve kalan havayı çıkarmak için PV'leri ince forseps ile hafifçe sıkıştırın. Süreç boyunca fizyolojik konfigürasyonlarını değiştirmeden koruyun.
3. O.C.T. bileşiğini dondurmak için gömülü doku ile birlikte kriyokalıbı kuru buz üzerine koyun. Numuneleri ileride kullanmak üzere -80 °C'de saklayın.
   NOT: Sonraki prosedürler için tam uzunlukta PV içeren bölümlerin elde edilmesini sağlamak için PV'leri yatay konumda tutmak çok önemlidir.

5. Donmuş doku kesitlerinin kesilmesi ve toplanması

NOT: Doku bloklarını kesmek için makine ayarları -18 °C numune sıcaklığına ve -25 °C bıçak sıcaklığına ayarlanmıştır.

1. Doku bloğu ile numune tutucu arasına bir O.C.T. bileşiği tabakası uygulayarak numune tutucuya bir doku bloğu takın. 3-4 dakika dondurun.
2. Numune kafasını bloke edin ve numune tutucuyu, numune tutucuyu numune başlığındaki doku bloğu ile birlikte numune aynası serbest bırakma kolunu kapatarak yükleyin. İnce ayar düğmelerini kullanarak doku bloğunun konumunu hassas bir şekilde ayarlayın.
3. Kriyokalıbı numuneden çıkarın. Numune kafasının ve kriyostatın elektrikli freninin blokajını kaldırın.
4. Kriyostatı 30 μm ile 50 μm arasında bir trim boyutuyla trim moduna ayarlayın. PV'ler görünür hale gelene kadar doku örneğini kesin.
5. İnce kesit kesme moduna geçin ve kalınlığı 10 μm'ye ayarlayın. PV'ler ve bağlı akciğer ve atriyal doku dahil olmak üzere bölümleri toplamaya başlayın. Yuvarlanma önleyici bir plaka kullanarak veya her bölümün serbest ucunu ince bir soğuk fırça ile bıçak tutucuya sabitleyerek bölümleri toplayın ve yayın.
6. Bölümün yanına bir slayt (oda sıcaklığında tutulan) yerleştirin. Donmuş bölüm ve O.C.T. bileşiği daha sıcak slayt yüzeyine dokunulduğunda erirken, bölümün slayta doğal olarak yapışmasına izin vererek bölümü dikkatlice fırçadan ayırın.
   NOT: Kesitlerde herhangi bir yırtılma veya kıvrımı önlemek için kesit alma işlemi sırasında sabit ve nazik bir durum sağlayın. Gerekirse bıçağı yeni bir bıçakla değiştirin.
7. Her slaytta en fazla üç bölüm toplayın. Slaytları etiketleyin ve -20 °C'de saklayın.
   NOT: Her PV için en az beş bölüm (iki slayta eşdeğer) toplamanızı öneririz.

6. PV'lerden kriyoseksiyonların immünofloresan boyaması

1. Donmuş slaytları bir boyama sistemi üzerine yerleştirin ve bölümlerin oda sıcaklığında yaklaşık 20 dakika çözülmesine izin verin.
   NOT: Numuneleri nemli tutmak için boyama sistemini suyla doldurun. Dokunun kurutulması antijenlere zarar verebilir, bu da boyama prosedürleri sırasında spesifik olmayan antikor bağlanmasına ve aşırı lekelenme artefaktlarına neden olabilir.
2. 20 dakika çözüldükten sonra, dokuyu oda sıcaklığında 10 dakika boyunca slaytlara sabitlemek için bölümleri birkaç damla sabitleme solüsyonu (% 4 paraformaldehit [PFA], Tablo 1) ile örtün.
3. Sabitlemeden sonra, slaytları dikey slayt rafına aktarın ve 1x PBS ile dolu bir kaba daldırın. Kabı düşük hızda bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin ve slaytları 5 dakika yıkayın. Her seferinde taze 1x PBS kullanarak bu yıkama döngüsünü iki kez daha tekrarlayın.
4. Yıkadıktan sonra, her slayttaki her bir bölümü ksilol içeren bir sıvı engelleyici kalemle daire içine alın. Boyama sistemindeki slaytları yeniden düzenleyin ve bir Pasteur pipeti ile her numuneye 1 veya 2 damla geçirgenlik solüsyonu (%0.1 Triton X-100, Tablo 1) uygulayın. Hücre ve hücre organel zarlarına nüfuz etmesi için bölümlerin oda sıcaklığında 10 dakika inkübe etmesine izin verin.
5. Geçirgenlikten sonra, Adım 6.3'te açıklanan prosedürün aynısını izleyerek, slaytları 1x PBS'de 3 x 5 dakika yıkayarak% 0.1 Triton X-100 çözeltisini çıkarın.
6. Yıkadıktan sonra, boyama sistemi üzerindeki slaytları yeniden düzenleyin ve her bölüme 1 veya 2 damla Blokaj Tamponu (Tablo 1) uygulayın ve bloke edici tampon ile tamamen kaplandığından emin olun. Slaytların oda sıcaklığında 1 saat inkübe etmesine izin verin.
7. 5 μL fare anti-cTNT antikoru (1:200 seyreltilmiş) ve 1 μL tavşan anti-Cx43 antikoru (1:1.000 seyreltilmiş) 994 μL Bloke Edici Tampon ile doldurulmuş 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyerek 1 mL birincil antikor karışımı hazırlayın. İyice karıştırmayı sağlamak için karışımı yukarı ve aşağı pipetleyin.
   NOT: Uygulanan antikor karışımının miktarını bölümün boyutuna göre ayarlayın. Bölümlerin antikor karışımı ile tamamen kaplandığından emin olun. Antikorların konsantrasyonu, inkübasyon süresi ve optimal inkübasyon sıcaklığı, antikor tipi, antikor klonları ve doku özellikleri gibi faktörlere bağlı olarak değişebilir. Her antikor için boyama koşullarının ayrı ayrı test edilmesini ve optimize edilmesini öneririz.
8. Bloke etme adımından sonra (adım 6.6), kalan bloke edici tamponu çıkarın ve her bölüme doğrudan 2 veya 3 damla primer antikor karışımı uygulayın. Slaytların gece boyunca 4 °C'de inkübe etmesine izin verin.
9. Birincil antikor inkübasyonundan sonra, slaytları 3 x 5 dakika boyunca Yıkama Tamponu ile hafifçe çalkalayarak yıkayın (Tablo 1).
10. 1 μL AF488 konjuge keçi antifare ikincil antikoru (1: 1.000 seyreltilmiş) ve 1 μL AF568 konjuge keçi antitavşan ikincil antikoru (1: 1.000 seyreltilmiş) 998 μL Yıkama Tamponu ile doldurulmuş 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne pipetleyerek 1 mL ikincil antikor karışımı hazırlayın. İyice karıştırmak için karışımı yukarı ve aşağı pipetleyin.
11. Yıkama adımından sonra (adım 6.9), boyama sistemindeki slaytları yeniden düzenleyin ve her bölüme bir pipetle 2 veya 3 damla ikincil antikor karışımı uygulayın. Floroforun söndürülmesini önlemek için numuneleri ışıktan korurken antikorların oda sıcaklığında 45 dakika inkübe etmesine izin verin. İkincil antikor inkübasyonundan sonra, slaytları 3 x 5 dakika boyunca Yıkama Tamponu ile hafifçe çalkalayarak yıkayın (Tablo 1).
12. Boyama sistemindeki slaytları yeniden düzenleyin. Her bölüme 2 ila 3 damla Hoechst-33342 solüsyonu uygulayarak bölümleri Hoechst-33342 ile (1x PBS'de 1:1.000 seyreltmede) karşı boyayın. Slaytların oda sıcaklığında 10 dakika inkübe etmesine izin verin.
13. İnkübasyondan sonra, slaytları 3 x 5 dakika Yıkama Tamponu ile hafifçe çalkalayarak yıkayın (Tablo 1). Her kızağa 1 veya 2 damla floresan montaj ortamı uygulayarak kızakları monte edin. Slaytları lamel ile örtün.
    NOT: Yerleştirirken lamellerin düz olduğundan emin olun. Herhangi bir hava kabarcığı varsa, bunları çıkarmak için kabarcığın yan tarafına hafifçe baskı uygulayın.
14. Monte edilmiş slaytları 4 °C'de bir slayt koruyucuda saklayın.
    NOT: Slaytların mümkün olduğunca erken görüntülenmesi önerilir. Bu protokol sadece bahsedilen antikorlar için geçerli değildir. Hedef antijenler ve antikorlar, bireysel deney gereksinimlerine veya alternatif antijen tespit stratejilerine göre değiştirilebilir veya değiştirilebilir.

7. İmmünofloresan boyama dilimlerinin görüntülenmesi

1. Mikroskobu kurun.
   1. Mikroskobu, üreticinin kılavuzunu izleyerek lazer ışık kaynağı, bağlı bilgisayar ve beraberindeki yazılımla başlatın.
   2. Yapılandırma menüsüne girin. Floresan görüntüleme için uygun kamera tipini seçmek için tıklayın (örn. DFC365FX siyah beyaz kamera).
   3. Al menüsüne girin ve üç kanal oluşturun.
   4. Hoechst-33342'nin tespiti için FCr1 kanalını seçin, etiketleyin ve seçim bölümünde DAP filtre küpünü seçin. Pozlama süresini 200 ms'ye, elektronik kazancı 2'ye ve ışık yoğunluğunu %17'ye ayarlayın.
   5. cTNT'nin tespiti için FCr2 kanalını seçin (AF488 konjuge antikor ile boyanmış), etiketleyin ve seçim bölümünde L5 filtre küpünü seçin. Pozlama süresini 200-300 ms'ye, elektronik kazancı 1,8'e ve ışık yoğunluğunu %100'e ayarlayın.
   6. Cx43'ün (AF568 konjuge antikor ile boyanmış) tespiti için FCr3 kanalını seçin, etiketleyin ve seçim bölümünde TXR filtre küpünü seçin. Pozlama süresini 150 ms'ye, elektronik kazancı 2'ye ve ışık yoğunluğunu %100'e ayarlayın.
      NOT: Filtre küplerinin spektral özellikleri Tablo 2'de listelenmiştir.
2. Slaytı mikroskop tablasına yükleyin.
3. 10x büyütmede genel bakış görüntüleme gerçekleştirin:
   1. 10x objektifi seçin ve Canlı'ya tıklayarak lazer deklanşörünü açın. FCr1 kanalı seçiliyken, bir sinyal algılanana kadar slaytta gezinmek için gezgin işlevini kullanın. Hücre çekirdekleri ayırt edilebilir hale gelene kadar numuneyi kabaca odaklayın.
   2. Numunenin tam bir önizlemesini yakalamak için spiral tarama modunu başlatın. Numuneyi korumak için düğmeye tekrar tıklayarak canlıyı devre dışı bırakın. LA, PV'ler ve akciğer dokusunu tanımlayın.
   3. Sonraki döşeme taraması için ilgi alanını tanımlayın; İlgilendiğiniz alanda birden fazla netleme noktası seçin. FCr1 kanalında Canlı'ya tıklayın ve her netleme noktası için odağı ayarlayın. Her netleme noktası için tam netleme konumunu temsil eden ilgili Z konumlarını kaydedin. Numunenin eksiksiz bir genel bakış görüntüsünü yakalamak için döşeme taramasını 10x büyütmede başlatın.
   4. Tarama tamamlandıktan sonra, döşeme taramasını açın ve tek tek görüntüleri birleştirin. Tek kanalların parlaklığını ve kontrastını artırmak için, bunları nesne çubuğunda seçin ve sinyal aralıklarını kaydırıcılarla istediğiniz gibi ayarlayın.
4. 40x büyütmede yakınlaştırılmış görüntüler elde edin:
   1. 40x reklam verme amacını seçin. Her kanal için pozlama süresini ve kazanç ayarlarını aşağıdaki gibi yapın: FCr1: DAP filtre küpü: pozlama süresi: 50 ms, kazanç: 1,5; FCr2: L5 filtre küpü: pozlama süresi: 80 ms, kazanç: 1.8; FCr3: TXR filtre küpü: pozlama süresi: 20 ms, kazanç: 2.
   2. PV deliğinin (PVO) yanı sıra ekstrapulmoner ve intrapulmoner PV (PV_ex, PV_in) bölgelerini bulmak için adım 7.3'ün genel bakış görüntüsünü kullanın. Taranacak bu alanı tanımlayın.
   3. Image alt menüsünü açın ve Z-Stack'i etkinleştirmek için z'ye tıklayın.
      1. FCr1 kanalını seçin ve canlı bir önizleme elde etmek için lazer deklanşörünü açın.
      2. Z-Stack alt menüsüne gidin ve focus ince ayar düğmesini genel sinyal odağını kaybetmeye başlayana kadar saat yönünde ve saat yönünün tersine çevirerek Z-Stack başlangıç ve bitiş noktalarını belirleyin.
      3. Odak aralığını ayarladıktan sonra, Sistem İçin Optimize Edilmiş Z-Stack modunu seçin ve genişletilmiş alan derinliği görüntülerini hesapla (EDF) seçeneğini etkinleştirin. Dokunun ne kadar düz olduğuna bağlı olarak, yaklaşık 0,5 μm'lik bir adım aralığına sahip yaklaşık 20 katman bekleyin.
   4. Kutucuk taramasını başlatın. Taradıktan sonra, döşeme taramasını açın ve yalnızca EDF görüntüsünü birleştirin. Tek kanalların parlaklığını ve kontrastını artırmak için, bunları nesne çubuğunda seçin ve sinyal aralıklarını kaydırıcılarla istediğiniz gibi ayarlayın (bkz. adım 7.3.4).
5. Görüntüleri oluşturduktan sonra projeyi kaydedin ve her görüntünün hem birleştirilmiş sürümünü hem de ham kanallarını bir TIFF dosyası olarak dışa aktarın.
   NOT: Dosyaları ImageJ tarafından okunabilir TIFF olarak kaydetmek, ImageJ'in orijinal döşeme boyutunu piksel yerine μm cinsinden içe aktarmasına olanak tanır. İkincil antikorların fotoağartılmasını önlemek için bir lazer sinyaline ihtiyaç duyulmadığında her zaman lazer deklanşörünü kapatın.

8. ImageJ ile görüntü düzenleme

1. İlgili ham kanal dosyalarını ImageJ'e yükleyin. Resmin üzerine tıklayın | Renk | Birleştirin ve her kanal için istediğiniz rengi seçin.
2. Analiz | Araçlar | Ölçek Çubuğu ve sağ alt köşeye yapıştırın. Görüntü gereksinimlerine göre daha fazla işleme ve analize devam edin. İşiniz bittiğinde birleştirilen görüntüleri kaydedin.

Sonuçlar

10 adet 12-16 haftalık farede PV'lerin mikrodiseksiyonu, boyanması ve görüntülenmesi yapıldı. Protokolü takiben, tüm deneysel farelerde PV'leri LA ile birlikte başarılı bir şekilde mikrodiseke ettik ve sekiz farede PV'lerin kapsamlı bir görünümüne sahip kesitler elde ettik. LA-PV bileşkesindeki PV deliği (PVO) bölgesini, ekstrapulmoner PV'leri (PV_ex) (akciğer hilumu ile LA-PV bileşkesi arasındaki PV'ler) ve intrapulmoner PV'leri (PV_girişi) (akciğer dokusu ile çevrili PV'le...

Tartışmalar

Bu protokolle, fare kalbinin PV'lerini ayırt etmek ve izole etmek ve üzerlerinde immünofloresan boyama yapmak için bir yöntemi paylaşıyoruz. Organ toplandıktan sonra, kalp ve akciğerler sterilize edilmiş sükroz çözeltisinde kurutuldu, ardından ventriküller mikroskobik kılavuzluk altında atriyum ve akciğer loblarından ayrıldı. Daha sonra, kalp tabanı PV'leri görselleştirmek için hazırlandı ve ardından hilustaki akciğerlerden kesildi. Daha sonraki immünofloresan boyama, dokuyu OCT bileşiğine...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion slides	Epredia	10149870
AF568-secondary antibody	Invitrogen	A11036	Host: Goat, Reactivity: Rabbit
Agarose	Biozym LE	840104
Alexa Fluor 488-secondary antibody	Cell Signaling Technology	4408S	Host: Goat, Reactivity: Mouse
Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody	Abcam	ab11370	Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit
Anti-cTNT antibody	Invitrogen	MA5-12960	Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A2153
Brush	Lukas	5486	size 6
Cover slips	Epredia		24 mm x 50 mm
Cryotome Cryo Star NX70	Epredia		Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C
DFC365FX camera	Leica
DM6 B fluorescence microscope	Leica
Dry ice
Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc.	Gibco	14040133	500 mL
Dumont #5FS Forceps	F.S.T.	91150-20	2 pieces needed
Fine Scissors	F.S.T.	14090-09
Fluorescence mounting medium	DAKO	S3023
Graefe Forceps	F.S.T.	11052-10
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Cell nuclei counterstaining
ImageJ	FIJI		analysis and processing software
LAS X	Leica		Imaging software for Leica DM6 B
Microtome blades S35	Feather	207500000
Microwave
Normal goat serum	Sigma-Aldrich	S26-M
O.C.T. compound	Tissue-Tek	4583
Paraformaldehyde 16%	Pierce	28908	methanol-free
Pasteur pipettes	VWR	612-1681
Petri dish	TPP	93100	100 mm diameter
Rocker 3D digital	IKA Schüttler	00040010000
Slide staining jars	EasyDip	M900-12
Specimen Molds	Tissue-Tek Cryomold	4557	25 mm x 20 mm x 5 mm
StainTray M920 staining system	StainTray	631-1923	Staining system for 20 slides
Sterican Needle	Braun	4657705	G 27 - used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol
Student Vannas Spring Scissors	F.S.T.	91500-09
Super PAP Pen Liquid Blocker	Super PAP Pen	N71310-N
Syringes	Braun	4606108V	10 mL
Tris base	Roche	TRIS-RO	component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS)
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287