优化小鼠原晶状体上皮细胞培养：胰蛋白酶消化综合指南

摘要

本手稿概述了用于培养原晶状体上皮细胞 （LEC） 的详细视频方案，旨在提高可重复性并帮助白内障和后囊混浊 （PCO） 的研究。它提供了有关晶状体解剖、LEC 分离和验证的分步说明，可作为有价值的指南，尤其是对于该领域的新手而言。

摘要

晶状体上皮细胞（LECs）在维持晶状体的稳态和正常功能方面发挥着多种重要作用。LEC 决定了晶状体的生长、发育、尺寸和透明度。相反，功能失调的 LEC 可导致白内障形成和后囊混浊 （PCO）。因此，建立强大的原代LEC培养系统对于从事晶状体开发、生物化学、白内障治疗和PCO预防的研究人员非常重要。然而，由于原代LECs的可用性有限、增殖速度慢且性质脆弱，其培育长期以来一直面临挑战。

本研究通过提出原代 LEC 培养的综合方案来解决这些障碍。该方案包含基本步骤，例如配制优化的培养基、晶状体胶囊的精确分离、胰蛋白酶消化技术、传代培养程序、收获方案以及储存和运输指南。在整个培养过程中，使用相差显微镜监测细胞形态。

为了确认培养的LEC的真实性，进行了免疫荧光测定以检测关键晶状体蛋白（即αA和γ晶状体蛋白）的存在和亚细胞分布。这一详细的方案为研究人员提供了培养和表征原发性 LEC 的宝贵资源，从而促进了我们对晶状体生物学的理解和晶状体相关疾病治疗策略的开发。

引言

眼睛的晶状体通过将入射光聚焦到视网膜上，在视觉中起着至关重要的作用。它由透明的无血管结构组成，由特化细胞组成，其中晶状体上皮细胞 （LEC） 是关键参与者。LEC 位于晶状体的前表面，负责保持其透明度、调节水平衡并参与晶状体生长和发育 ^1,2。LEC 是位于晶状体前部的一种独特类型的细胞，通过在整个生命周期中持续产生晶状体纤维，在维持晶状体清晰度和功能方面发挥着关键作用。

白内障的特征是晶状体逐渐混浊，导致光线失真和散射，导致视力受损 ^3,4。白内障形成的确切机制是复杂和多因素的，涉及各种细胞和分子过程，如紫外线辐射、氧化损伤和糖基化 ^5,6。已发现 LEC 对白内障的发展有显着贡献，使其成为研究的重要焦点 1,2,7,8,9。

研究方案

所有动物实验均按照视觉和眼科研究协会关于在眼科和视觉研究中使用动物的指南进行。程序批准由北德克萨斯大学健康科学中心动物护理和使用委员会（协议编号：IACUC-2022-0008）授予。这些研究使用了通常低于2周龄的年轻C57BL / 6J小鼠。

1.培养基制备及晶状体解剖

1. 通过向 450 mL DMEM 中加入 50 mL 胎牛血清 （FBS） 和 0.1 mL 50 mg/mL 庆大霉素来制备培养基。
2. 人道地对小于2周的C57BL / 6J小鼠实施安乐死。
   注意：我们使用 CO₂ 吸入法实施安乐死。CO₂ 安乐死系统的最佳流速应位移 30% 至 70% 的腔室或笼容积/分钟。
3. 用手术剪刀轻轻取下眼睑，并用弯曲的镊子在眼窝的两侧轻轻按压，使眼睛向外突出。使用白内障刀在角膜上仔细切开，然后用弯曲的镊子小心地取出晶状体，确保不会损坏晶状体或其囊。
   注意： 执行这些步骤时要小心，以保持镜头囊的完整性。由于镜片的脆弱性，使用带有弯曲和钝头的解剖工具非常重要，以最大限度地降低镜片损坏的风险。
4. 使用带有钝头的弯曲镊子将镜片转移到 60 mm 塑料组织培养皿中，该培养皿中装满了 5 mL 预热和无菌的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 溶液，其中含有 10 μg/mL 庆大霉素。
5. 用含有 ....

讨论

本文介绍的方案为成功分离、培养和传代 LEC 提供了全面的分步指南，并附有视频文档。详细的视觉指南和书面说明增强了协议的清晰度和可访问性，促进了该领域研究人员的使用和可重复性。最终目的是促进围绕 LEC 在白内障形成和 PCO（白内障手术后普遍存在的并发症）中的作用的知识体系的扩展。

当将原代 LEC 与晶状体上皮细胞系（如 HLE-B3 和 SRA01/04）进行比较时，每种?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Thermo Fisher	#25300054	For LECs dissociation
Alexa Fluor 488 Secondary Antibody	Jackson ImmunoResearch	#715-545-150	For cell validation
Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-605-003	For cell validation
Antibody dilution buffer	Licor	#927-60001	For cell validation
Beaver safety knife	Beaver-Visitec International	#3782235	For lens dissection
Blocking buffer	Licor	#927-60001	For cell validation
Capsulorhexis forceps	Titan Medical Instruments	TMF-124	For lens capsule isolation
DMEM	Sigma Aldrich	D6429	For LECs culture medium
DMSO	Sigma Aldrich	#D2650	For making freezing medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher	#J67802	For lens dissection
Dumont tweezers	Roboz Surgical Instrument	RS-4976	For lens capsule isolation
EpiCGS-a (optional)	ScienCell	4182	For LECs culture medium
FBS	Sigma Aldrich	F2442	For LECs culture medium
Gentamicin (50 mg/mL)	Sigma-Aldrich	G1397	For LECs culture medium
Hoechst 33342 solution	Thermo Fisher	#62249	For cell validation
Micro-dissecting scissors	Roboz Surgical Instrument	RS-5983	For lens dissection
Micro-dissecting tweezers	Roboz Surgical Instrument	RS5137	For lens dissection
PROX1 antibody	Thermo Fisher	11067-2-AP	For cell validation
Vannas micro-dissecting spring scissors	Roboz Surgical Instrument	RS-5608	For lens capsule isolation
αA-crystallin antibody	Santa Cruz	sc-28306	For cell validation
γ-crystallin antibody	Santa Cruz	sc-365256	For cell validation