Ottimizzazione della coltura di cellule epiteliali primarie del cristallino di topo: una guida completa alla tripsinizzazione

Riepilogo

Questo manoscritto delinea un protocollo video dettagliato per la coltura di cellule epiteliali primarie del cristallino (LEC), con l'obiettivo di migliorare la riproducibilità e aiutare la ricerca sulla cataratta e sull'opacizzazione della capsula posteriore (PCO). Offre istruzioni dettagliate sulla dissezione delle lenti, l'isolamento e la convalida dei LEC, fungendo da guida preziosa, soprattutto per i nuovi arrivati nel settore.

Abstract

Le cellule epiteliali del cristallino (LEC) svolgono molteplici ruoli importanti nel mantenimento dell'omeostasi e della normale funzione del cristallino. I LEC determinano la crescita, lo sviluppo, le dimensioni e la trasparenza delle lenti. Al contrario, i LEC disfunzionali possono portare alla formazione della cataratta e all'opacizzazione della capsula posteriore (PCO). Di conseguenza, la creazione di un solido sistema di coltura LEC primario è importante per i ricercatori impegnati nello sviluppo di lenti, nella biochimica, nelle terapie della cataratta e nella prevenzione della PCO. Tuttavia, la coltivazione di LEC primari ha presentato a lungo sfide a causa della loro disponibilità limitata, del lento tasso di proliferazione e della natura delicata.

Questo studio affronta questi ostacoli presentando un protocollo completo per la coltura LEC primaria. Il protocollo comprende fasi essenziali come la formulazione di un terreno di coltura ottimizzato, l'isolamento preciso delle capsule di lenti, le tecniche di tripsinizzazione, le procedure di sottocoltura, i protocolli di raccolta e le linee guida per lo stoccaggio e la spedizione. Durante tutto il processo di coltura, la morfologia cellulare è stata monitorata utilizzando la microscopia a contrasto di fase.

Per confermare l'autenticità dei LEC in coltura, sono stati condotti saggi di immunofluorescenza per rilevare la presenza e la distribuzione subcellulare di proteine lente critiche, vale a dire αA- e γ-cristalline. Questo protocollo dettagliato fornisce ai ricercatori una risorsa preziosa per coltivare e caratterizzare i LEC primari, consentendo progressi nella nostra comprensione della biologia del cristallino e nello sviluppo di strategie terapeutiche per i disturbi correlati al cristallino.

Introduzione

Il cristallino dell'occhio svolge un ruolo cruciale nella visione focalizzando la luce in entrata sulla retina. È costituito da una struttura trasparente e avascolare composta da cellule specializzate, tra le quali le cellule epiteliali del cristallino (LEC) sono protagoniste. I LEC si trovano sulla superficie anteriore del cristallino e sono responsabili del mantenimento della sua trasparenza, della regolazione dell'equilibrio idrico e della partecipazione alla crescita e allo sviluppo del cristallino ^1,2. I LEC sono un tipo unico di cellule situate nella parte anteriore del cristallino, che svolgono un ruolo....

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida dell'Associazione per la ricerca sulla visione e l'oftalmologia per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e sulla visione. L'approvazione procedurale è stata concessa dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Texas settentrionale Health Science Center (numero di protocollo: IACUC-2022-0008). In questi studi sono stati utilizzati topi giovani C57BL/6J, in genere di età inferiore alle 2 settimane.

1. Preparazione del terreno di coltura e dissezione delle lenti

1. Preparare il terreno di coltura aggiun....

Discussione

Il protocollo presentato in questo documento fornisce una guida completa e dettagliata per il successo dell'isolamento, della cultura e della sottocultura dei LEC primari, completa di documentazione video di accompagnamento. La guida visiva dettagliata, insieme alle istruzioni scritte, migliora la chiarezza e l'accessibilità del protocollo, promuovendone l'uso e la riproducibilità tra i ricercatori del settore. L'obiettivo finale è quello di contribuire all'espansione delle conoscenze che circondano il ruolo dei LEC n.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Thermo Fisher	#25300054	For LECs dissociation
Alexa Fluor 488 Secondary Antibody	Jackson ImmunoResearch	#715-545-150	For cell validation
Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-605-003	For cell validation
Antibody dilution buffer	Licor	#927-60001	For cell validation
Beaver safety knife	Beaver-Visitec International	#3782235	For lens dissection
Blocking buffer	Licor	#927-60001	For cell validation
Capsulorhexis forceps	Titan Medical Instruments	TMF-124	For lens capsule isolation
DMEM	Sigma Aldrich	D6429	For LECs culture medium
DMSO	Sigma Aldrich	#D2650	For making freezing medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher	#J67802	For lens dissection
Dumont tweezers	Roboz Surgical Instrument	RS-4976	For lens capsule isolation
EpiCGS-a (optional)	ScienCell	4182	For LECs culture medium
FBS	Sigma Aldrich	F2442	For LECs culture medium
Gentamicin (50 mg/mL)	Sigma-Aldrich	G1397	For LECs culture medium
Hoechst 33342 solution	Thermo Fisher	#62249	For cell validation
Micro-dissecting scissors	Roboz Surgical Instrument	RS-5983	For lens dissection
Micro-dissecting tweezers	Roboz Surgical Instrument	RS5137	For lens dissection
PROX1 antibody	Thermo Fisher	11067-2-AP	For cell validation
Vannas micro-dissecting spring scissors	Roboz Surgical Instrument	RS-5608	For lens capsule isolation
αA-crystallin antibody	Santa Cruz	sc-28306	For cell validation
γ-crystallin antibody	Santa Cruz	sc-365256	For cell validation