JoVE Logo
Autores
Entre em contato

Entrar

É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Este manuscrito descreve um protocolo de vídeo detalhado para a cultura de células epiteliais primárias do cristalino (LECs), com o objetivo de melhorar a reprodutibilidade e auxiliar a pesquisa em catarata e opacificação da cápsula posterior (PCO). Ele oferece instruções passo a passo sobre dissecção de lentes, isolamento de LECs e validação, servindo como um guia valioso, especialmente para recém-chegados no campo.

Resumo

As células epiteliais do cristalino (LECs) desempenham múltiplos papéis importantes na manutenção da homeostase e da função normal do cristalino. Os LECs determinam o crescimento, o desenvolvimento, o tamanho e a transparência das lentes. Por outro lado, as CLEs disfuncionais podem levar à formação de catarata e opacificação da cápsula posterior (PCO). Consequentemente, o estabelecimento de um sistema de cultura LEC primário robusto é importante para pesquisadores envolvidos no desenvolvimento de lentes, bioquímica, terapêutica de catarata e prevenção de PCO. No entanto, o cultivo de LECs primárias há muito tempo apresenta desafios devido à sua disponibilidade limitada, taxa de proliferação lenta e natureza delicada.

Este estudo aborda esses obstáculos apresentando um protocolo abrangente para cultura LEC primária. O protocolo engloba etapas essenciais, como a formulação de um meio de cultura otimizado, isolamento preciso das cápsulas do cristalino, técnicas de tripsinização, procedimentos de subcultivo, protocolos de colheita e diretrizes para armazenamento e embarque. Durante todo o processo de cultivo, a morfologia celular foi monitorada por meio de microscopia de contraste de fase.

Para confirmar a autenticidade das LECs cultivadas, ensaios de imunofluorescência foram conduzidos para detectar a presença e a distribuição subcelular de proteínas críticas do cristalino, ou seja, αA- e γ-cristalinos. Este protocolo detalhado fornece aos pesquisadores um recurso valioso para cultivar e caracterizar LECs primárias, permitindo avanços em nossa compreensão da biologia do cristalino e o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para distúrbios relacionados ao cristalino.

Introdução

A lente do olho desempenha um papel crucial na visão, concentrando a luz recebida na retina. Consiste em uma estrutura avascular transparente composta por células especializadas, entre as quais as células epiteliais do cristalino (LECs) são peças-chave. As CLEs estão localizadas na superfície anterior do cristalino e são responsáveis por manter sua transparência, regular o balanço hídrico e participar do crescimento e desenvolvimento do cristalino 1,2. LECs são um tipo único de células localizadas na parte anterior da lente, desempenhando um papel crítico na manutenção da clareza e função da lente, produzindo continuamente fibras da lente ao longo da vida.

A catarata caracteriza-se pela turvação progressiva do cristalino, resultando em distorção e espalhamento da luz, levando ao comprometimento da visão 3,4. Os mecanismos precisos subjacentes à formação da catarata são complexos e multifatoriais, envolvendo vários processos celulares e moleculares, como radiação UV, dano oxidativo e glicação 5,6. Descobriu-se que as LECs contribuem significativamente para o desenvolvimento da catarata, tornando-as um foco vital de pesquisa 1,2,7,8,9.

Além disso, uma das questões mais prementes em oftalmologia atualmente é a incidência relativamente alta de opacificação da cápsula posterior (PCO), também conhecida como catarata secundária. A PCO continua sendo a complicação mais comum após a cirurgia de catarata, afetando até 20-40% dos pacientes adultos e 100% das crianças dentro de 5 anos após a cirurgia10. A PCO é causada principalmente pelas LECs residuais que permanecem na bolsa capsular após a extração da catarata. Essas células sofrem uma transformação fisiopatológica multifacetada, envolvendo não apenas a transição epitélio-mesenquimal (EMT), mas também a diferenciação das LECs em fibras do cristalino, resultando em uma população celular que é uma mistura de LECs, fibras e miofibroblastos11,12,13. As células transformadas proliferam e migram através da cápsula posterior do cristalino, levando à deficiência visual. A compreensão do comportamento e dos mecanismos de controle das LECs em modelos de cultura pode fornecer informações valiosas sobre a prevenção e o manejo da PCO. Portanto, este protocolo de cultivo de LECs apresenta-se como uma ferramenta vital para os pesquisadores oftalmológicos com o objetivo de estudar, compreender e, finalmente, combater essa complicação pós-operatória prevalente.

Para desvendar os meandros da biologia LEC e seu papel na formação de catarata e PCO, é essencial estabelecer sistemas de cultura de células primárias robustos e reprodutíveis. A cultura primária de LEC fornece aos pesquisadores um ambiente controlado para estudar as funções, sinalização e características moleculares de LECs. Além disso, permite a investigação de processos celulares e dos efeitos de diferentes condições experimentais, fornecendo informações valiosas sobre a fisiologia e patologia do cristalino.

Pesquisas anteriores enriqueceram nosso entendimento sobre as técnicas de cultura LEC 14,15,16,17,18,19,20. Embora esses estudos tenham empregado várias metodologias e produzido achados significativos sobre o comportamento e as características do LEC, um protocolo de videogravação abrangente e acessível para a cultura de LECs está ausente na literatura atual. Essa limitação pode dificultar a capacidade de pesquisadores iniciantes em reproduzir com precisão as técnicas e pode levar a inconsistências e variações nos resultados experimentais. Ao fornecer um protocolo de gravação de vídeo, este artigo de pesquisa visa preencher essa lacuna e fornecer um recurso padronizado que possa aumentar a reprodutibilidade e facilitar a transferência de conhecimento no campo da cultura LEC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes da Association for Research in Vision and Ophthalmology for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. A aprovação do procedimento foi concedida pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Norte do Texas (número de protocolo: IACUC-2022-0008). Camundongos C57BL/6J jovens, tipicamente com menos de 2 semanas de idade, foram usados nesses estudos.

1. Preparo do meio de cultura e dissecção do cristalino

  1. Preparar o meio de cultura adicionando 50 mL de soro fetal bovino (SFB) e 0,1 mL de 50 mg/mL de gentamicina a 450 mL de DMEM.
  2. Eutanasiar humanamente camundongos C57BL/6J com menos de 2 semanas.
    OBS: Nós sacrificamos usando o método de inalação de CO2 . Uma taxa de fluxo ótima para sistemas de eutanásia por CO2 deve deslocar 30% a 70% do volume da câmara ou gaiola/min.
  3. Remova suavemente as pálpebras usando tesouras cirúrgicas e aplique uma pressão delicada com pinças curvas em lados opostos da cavidade ocular, fazendo com que o olho se projete para fora. Faça uma incisão cuidadosa na córnea usando a faca de catarata e extraia cuidadosamente o cristalino usando pinças curvas, garantindo que não haja danos ao cristalino ou à sua cápsula.
    NOTA: Tenha cuidado ao executar estas etapas para manter a integridade da cápsula da lente. Devido à natureza delicada da lente, é importante usar ferramentas de dissecação com pontas curvas e rombas para minimizar o risco de danos à lente.
  4. Utilize pinças curvas com pontas rombas para transferir as lentes para uma placa de cultura de tecido plástico de 60 mm preenchida com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (DPBS) pré-aquecida e estéril de Dulbecco contendo 10 μg/mL de gentamicina.
  5. Enxaguar suavemente as lentes com solução de DPBS contendo 10 μg/mL de gentamicina para remover quaisquer detritos ou contaminantes potenciais, preparar as lentes para processamento posterior e manter um ambiente de cultura estéril.
  6. Para obter um número adequado de LECs, agrupe quatro lentes para uma placa de cultura de 24 poços e seis lentes para uma placa de cultura de 6 poços.

2. Isolamento de LECs

  1. Após concluir o processo de enxágue, coloque a lente em um pedaço de papel de filtro, deixando-a secar.
  2. Quando a lente estiver adequadamente seca, transfira-a cuidadosamente para a tampa de uma placa de Petri em preparação para a remoção da cápsula da lente.
  3. Gire a lente para cima, garantindo que o segmento anterior esteja voltado para cima. Ao usar a pinça para segurar a cápsula anterior, empregue a pinça capsulorrexis na mão dominante para criar uma pequena ruptura na cápsula. Puxe suavemente as duas ferramentas em direções opostas para remover a cápsula e coloque-a em DPBS até que todas as dissecações da lente sejam concluídas.
    NOTA: Para evitar discrepâncias, os pesquisadores devem dissecar prontamente cada cápsula epitelial do cristalino e armazená-las temporariamente em DPBS. Somente após o término de todas as dissecções, as cápsulas são transferidas coletivamente para tripsina mantidas a 37 °C, garantindo uma exposição sincronizada e uniforme.
  4. Transfira cuidadosamente a cápsula da lente para uma placa de 6 poços. Adicionar 1 mL de solução de tripsina a 0,05% em cada poço para iniciar o processo de digestão enzimática.
  5. Agite suavemente a solução de tripsina para garantir uma permeação uniforme. Coloque a placa em uma incubadora de cultura celular e deixe a cápsula ser digerida por 8-10 min a 37 °C.
    NOTA: Esta etapa facilita a quebra do tecido da cápsula do cristalino e a subsequente liberação de células epiteliais individuais.
  6. Após a incubação, pique cuidadosamente a cápsula do cristalino digerido usando uma tesoura dissecante para quebrar quaisquer aglomerados de tecido restantes e promover a separação celular.
    NOTA: O rigor na picagem do tecido é enfatizado para garantir a liberação eficiente de células das cápsulas da lente digerida.
  7. Adicionar 0,5 mL do meio de cultura contendo FBS a 10% para extinguir a tripsina. Transfira as amostras de tecido para um tubo de centrifugação e centrifugação a 1.000 × g por 5 min.
  8. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular. Use 1 mL de meio de cultura para ressuspender as células e semear as células em uma placa de 24 poços.
  9. Troque o meio de cultura a cada 2-3 dias.

3. Subcultura de LECs

  1. Assim que as células atingirem a confluência, retire o meio da placa de cultura. Proceder à lavagem das células 2x com 1 mL de DPBS.
  2. Adicionar 200 μL de solução de tripsina-EDTA e colocar as células na incubadora durante 5 minutos.
  3. Após a incubação, remova as células da incubadora e inspecione-as ao microscópio para confirmar se elas se desprenderam da placa de cultura e começaram a flutuar.
  4. Adicionar 1 mL de meio de cultura e pipetar suavemente as células 3-5x para separar todas as células.
  5. Transfira as células para tubos de centrífuga e centrifugação a 1.000 × g por 5 min.
  6. Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda as células no meio de crescimento completo.
  7. Se necessário, conte o número de células usando um hemocitômetro.
  8. Subdividir a suspensão celular na proporção de 1:2 ou 1:3 para fins de subcultivo.
  9. Quando a cultura voltar a se tornar confluente, repita os procedimentos supracitados.
    NOTA: LECs florescem em condições de cultura de alta densidade. Evite diluir excessivamente as células, pois isso pode dificultar seu crescimento.

4. Armazenamento e expedição

NOTA: O número de célula ideal para armazenamento é ~1 × 106.

  1. Lave bem as células 3x com 1 mL de DPBS. Após a lavagem, adicionar 1 mL de solução de tripsina-EDTA e colocar as células na incubadora por 5 min.
  2. Adicionar 2 mL de meio de cultura completo e transferir a suspensão celular para o tubo de centrífuga e centrifugar a 1.000 × g por 5 min.
  3. Eliminar o sobrenadante e ressuspender as células em meio de congelamento composto por SFB 90% e DMSO 10%, visando densidade celular de 1 × 106 células/mL. Transfira a suspensão celular para o criovial.
  4. Mover imediatamente as células para um ambiente de -20 °C por 1 h, seguido de -80 °C durante a noite, antes do armazenamento permanente em nitrogênio líquido.
    NOTA: Se o azoto líquido não estiver disponível, as células podem ser armazenadas a -80 °C após uma hora inicial a -20 °C.
  5. Se for necessário um envio, envie as células no criovial em um pacote com gelo seco para entrega durante a noite.
  6. Após o recebimento das células, garanta a rápida recuperação e coloque as células na subcultura. Se a cultura imediata não for viável, transferir as células para nitrogênio líquido para armazenamento prolongado.
    NOTA: Se as células forem enviadas, certifique-se de que as amostras estejam profundamente enterradas no gelo seco para evitar danos potenciais causados por flutuações de temperatura.

5. Validação de LECs

  1. Placa LECs em pratos de cultura de 35 mm com copos de cobertura e cultivá-los por aproximadamente 48 h.
  2. Lave as células 2x com PBS e fixe as células com metanol frio por 10 min a -20 °C.
  3. Lavar as células fixas por 3 x 5 min com PBS e incubar as células fixas com tampão de bloqueio por 1 h à temperatura ambiente para evitar ligação inespecífica.
  4. Após o bloqueio, incubar as células durante a noite a 4 °C com os anticorpos primários (αA-cristalino, γ-cristalino e anticorpos PROX1) diluídos individualmente na proporção de 1:50 em tampão diluente.
  5. Lavar as células por 3 x 5 min com PBS e incubar as células com o anticorpo secundário diluído 1:100 em tampão diluente por 1 h.
  6. Lavar as células por 3 x 5 min com PBS e corá-las com 5 μg/mL Hoechst 33342 em PBS por 10 min à temperatura ambiente para visualizar os núcleos.
  7. Lavar as células por 2 x 5 min com PBS para remover o excesso de solução corante e capturar imagens fluorescentes das células usando um microscópio de fluorescência usando o canal DAPI para núcleos e canal FITC para αA-, γ-cristalinos e PROX1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Como mostrado na Figura 2, seguindo esse protocolo, LECs primárias de camundongos C57BL/6J aderiram às placas em um período de 4 h. Notadamente, havia resquícios visíveis de outros tecidos, como cortes da cápsula posterior e células de fibras do cristalino. No entanto, esses elementos não intencionais não se prenderam ao prato e, portanto, poderiam ser removidos com a mudança do meio de cultura. Posteriormente, entre o terceiro e o quinto dia, as LECs iniciaram sua fase de prolifer...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

O protocolo apresentado neste artigo fornece um guia passo a passo abrangente para o isolamento, a cultura e a subcultura bem-sucedidos de LECs primários, completo com a documentação em vídeo que o acompanha. O guia visual detalhado, juntamente com as instruções escritas, aumenta a clareza e a acessibilidade do protocolo, promovendo seu uso e reprodutibilidade entre os pesquisadores da área. O objetivo final é contribuir para a expansão do corpo de conhecimento em torno do papel das CELs na formação da catarat...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo NEI R21EY033941 (para Hongli Wu); Departamento de Defesa W81XWH2010896 (para Hongli Wu); R15GM123463-02 (para Kayla Green e Hongli Wu)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% Trypsin-EDTAThermo Fisher#25300054For LECs dissociation
Alexa Fluor 488 Secondary Antibody Jackson ImmunoResearch#715-545-150For cell validation
Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch111-605-003For cell validation
Antibody dilution bufferLicor#927-60001For cell validation
Beaver safety knifeBeaver-Visitec International#3782235For lens dissection
Blocking bufferLicor#927-60001For cell validation
Capsulorhexis forcepsTitan Medical InstrumentsTMF-124For lens capsule isolation
DMEMSigma AldrichD6429For LECs culture medium
DMSOSigma Aldrich#D2650For making freezing medium 
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher#J67802For lens dissection
Dumont tweezersRoboz Surgical InstrumentRS-4976For lens capsule isolation
EpiCGS-a (optional)ScienCell4182For LECs culture medium
FBSSigma AldrichF2442For LECs culture medium
Gentamicin (50 mg/mL)Sigma-AldrichG1397For LECs culture medium
Hoechst 33342 solutionThermo Fisher#62249For cell validation
Micro-dissecting scissorsRoboz Surgical Instrument RS-5983For lens dissection
Micro-dissecting tweezersRoboz Surgical Instrument RS5137 For lens dissection
PROX1 antibodyThermo Fisher11067-2-APFor cell validation
Vannas micro-dissecting spring scissorsRoboz Surgical InstrumentRS-5608For lens capsule isolation
αA-crystallin antibodySanta Cruzsc-28306For cell validation 
γ-crystallin antibodySanta Cruzsc-365256For cell validation

Referências

  1. Bermbach, G., Mayer, U., Naumann, G. O. Human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 52 (2), 113-119 (1991).
  2. Reddy, V. N., Lin, L. R., Arita, T., Zigler, J. S. Jr, Huang, Q. L. Crystallins and their synthesis in human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 47 (3), 465-478 (1988).
  3. Lee, C. M., Afshari, N. A. The global state of cataract blindness. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (1), 98-103 (2017).
  4. Khairallah, M., et al. Number of people blind or visually impaired by cataract worldwide and in world regions, 1990 to 2010. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6762-6769 (2015).
  5. Beebe, D. C., Holekamp, N. M., Shui, Y. B. Oxidative damage and the prevention of age-related cataracts. Ophthalmic Research. 44 (3), 155-165 (2010).
  6. Lou, M. F. Redox regulation in the lens. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (5), 657-682 (2003).
  7. Charakidas, A., et al. Lens epithelial apoptosis and cell proliferation in human age-related cortical cataract. European Journal of Ophthalmology. 15 (2), 213-220 (2005).
  8. Lou, M. F. Glutathione and glutaredoxin in redox regulation and cell signaling of the lens. Antioxidants (Basel). 11 (10), 1973(2022).
  9. Wilhelm, J., Smistik, Z., Mahelkova, G., Vytasek, R. Redox regulation of proliferation of lens epithelial cells in culture. Cell Biochemistry & Function. 25 (3), 317-321 (2007).
  10. Zhang, Y., et al. Research progress concerning a novel intraocular lens for the prevention of posterior capsular opacification. Pharmaceutics. 14 (7), 1343(2022).
  11. Konopinska, J., Mlynarczyk, M., Dmuchowska, D. A., Obuchowska, I. Posterior capsule opacification: A review of experimental studies. Journal of Clinical Medicine. 10 (13), 2847(2021).
  12. Pandey, S. K., Apple, D. J., Werner, L., Maloof, A. J., Milverton, E. J. Posterior capsule opacification: A review of the aetiopathogenesis, experimental and clinical studies and factors for prevention. Indian Journal of Ophthalmology. 52 (2), 99-112 (2004).
  13. Wei, Z., et al. Aged lens epithelial cells suppress proliferation and epithelial-mesenchymal transition-relevance for posterior capsule opacification. Cells. 11 (13), 2001(2022).
  14. Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Miller, G. G., Blair, D. G., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture--iv. Some characteristics of the process, including possible in vitro models for pathogenic processes in cataractogenesis. Vision Research. 21 (1), 25-35 (1981).
  15. Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture. (i) effects of cell density, medium and embryonic age of initial culture. Differentiation. 6 (3), 155-167 (1976).
  16. Ibaraki, N., Ohara, K., Shimizu, H. Explant culture of human lens epithelial cells from senile cataract patients. Japanese Journal of Ophthalmology. 37 (3), 310-317 (1993).
  17. Sundelin, K., Petersen, A., Soltanpour, Y., Zetterberg, M. In vitro growth of lens epithelial cells from cataract patients - association with possible risk factors for posterior capsule opacification. The Open Ophthalmology Journal. 8, 19-23 (2014).
  18. Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178(2022).
  19. Andjelic, S., et al. Morphological and proliferative studies on ex vivo cultured human anterior lens epithelial cells - relevance to capsular opacification. Acta Ophthalmologica. 93 (6), e499-e506 (2015).
  20. Andjelic, S., et al. A simple method for establishing adherent ex vivo explant cultures from human eye pathologies for use in subsequent calcium imaging and inflammatory studies. Journal of Immunology Research. 2014, 232659(2014).
  21. Andley, U. P., Rhim, J. S., Chylack, L. T. Jr, Fleming, T. P. Propagation and immortalization of human lens epithelial cells in culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (7), 3094-3102 (1994).
  22. Zhou, M., Leiberman, J., Xu, J., Lavker, R. M. A hierarchy of proliferative cells exists in mouse lens epithelium: Implications for lens maintenance. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2997-3003 (2006).
  23. Wolffe, A. P., Glover, J. F., Tata, J. R. Culture shock. Synthesis of heat-shock-like proteins in fresh primary cell cultures. Experimental Cell Research. 154 (2), 581-590 (1984).
  24. Haykin, V., et al. Bioimage analysis of cell physiology of primary lens epithelial cells from diabetic and non-diabetic cataract patients. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 35 (1), 170-178 (2021).
  25. Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens. Developmental Biology. 103 (1), 129-141 (1984).
  26. Zelenka, P. S., Gao, C. Y., Saravanamuthu, S. S. Preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation. Journal of Visualized Experiments. (31), 1591(2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

Este m s em JoVEEdi o 208Cultura de c lulas prim riasC lulas epiteliais do cristalinoDissec o do cristalinoC psula do cristalinoCatarataOpacifica o da c psula posterior

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Entre em contato

recomende à biblioteca

Newsletter

Pesquisa

Educação

Autores

Bibliotecários

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados