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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce manuscrit décrit un protocole vidéo détaillé pour la culture de cellules épithéliales primaires du cristallin (LEC), visant à améliorer la reproductibilité et à faciliter la recherche sur la cataracte et l’opacification de la capsule postérieure (PCO). Il offre des instructions étape par étape sur la dissection du cristallin, l’isolation et la validation des LEC, servant de guide précieux, en particulier pour les nouveaux arrivants dans le domaine.

Résumé

Les cellules épithéliales du cristallin (LEC) jouent de multiples rôles importants dans le maintien de l’homéostasie et de la fonction normale du cristallin. Les LEC déterminent la croissance, le développement, la taille et la transparence des lentilles. À l’inverse, un CLE dysfonctionnel peut entraîner la formation de cataracte et l’opacification de la capsule postérieure (OCP). Par conséquent, la mise en place d’un système de culture primaire LEC robuste est importante pour les chercheurs engagés dans le développement de lentilles, la biochimie, les traitements de la cataracte et la prévention du SOPK. Cependant, la culture des LEC primaires a longtemps présenté des défis en raison de leur disponibilité limitée, de leur faible taux de prolifération et de leur nature délicate.

Cette étude aborde ces obstacles en présentant un protocole complet pour la culture primaire des LEC. Le protocole comprend des étapes essentielles telles que la formulation d’un milieu de culture optimisé, l’isolement précis des capsules de lentilles, les techniques de trypsinisation, les procédures de sous-culture, les protocoles de récolte et les directives pour le stockage et l’expédition. Tout au long du processus de culture, la morphologie cellulaire a été surveillée à l’aide de la microscopie à contraste de phase.

Pour confirmer l’authenticité des LEC en culture, des tests d’immunofluorescence ont été effectués pour détecter la présence et la distribution subcellulaire de protéines critiques du cristallin, à savoir les αA- et γ-cristallins. Ce protocole détaillé fournit aux chercheurs une ressource précieuse pour cultiver et caractériser les LEC primaires, permettant des progrès dans notre compréhension de la biologie du cristallin et le développement de stratégies thérapeutiques pour les troubles liés au cristallin.

Introduction

Le cristallin de l’œil joue un rôle crucial dans la vision en concentrant la lumière entrante sur la rétine. Il s’agit d’une structure avasculaire transparente composée de cellules spécialisées, parmi lesquelles les cellules épithéliales du cristallin (LEC) sont des acteurs clés. Les LEC sont situés sur la surface antérieure du cristallin et sont responsables du maintien de sa transparence, de la régulation de l’équilibre hydrique et de la participation à la croissance et au développement du cristallin 1,2. Les LEC sont un type unique de cellules situées dans la partie antérieure du cristallin, jouant un rôle essentiel dans le maintien de la clarté et de la fonction du cristallin en produisant continuellement des fibres du cristallin tout au long de la vie.

La cataracte se caractérise par l’opacification progressive du cristallin, entraînant la distorsion et la diffusion de la lumière, ce qui compromet la vision 3,4. Les mécanismes précis sous-jacents à la formation de la cataracte sont complexes et multifactoriels, impliquant divers processus cellulaires et moléculaires tels que les rayons UV, les dommages oxydatifs et la glycation 5,6. Il a été constaté que les LEC contribuent de manière significative au développement de la cataracte, ce qui en fait un axe essentiel de recherche 1,2,7,8,9.

De plus, l’un des problèmes les plus urgents en ophtalmologie aujourd’hui est l’incidence relativement élevée de l’opacification de la capsule postérieure (OCP), également connue sous le nom de cataracte secondaire. Le SOPK reste la complication la plus fréquente après une chirurgie de la cataracte, touchant jusqu’à 20 à 40 % des patients adultes et 100 % des enfants dans les 5 ans suivant la chirurgie10. L’OCP est principalement causée par les LEC résiduels qui restent dans le sac capsulaire après l’extraction de la cataracte. Ces cellules subissent une transformation physiopathologique à multiples facettes impliquant non seulement la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), mais aussi la différenciation des LEC en fibres du cristallin, ce qui donne une population cellulaire qui est un mélange de LEC, de fibres et de myofibroblastes 11,12,13. Les cellules transformées prolifèrent et migrent à travers la capsule postérieure du cristallin, entraînant une déficience visuelle. Comprendre le comportement et les mécanismes de contrôle des LEC dans les modèles de culture peut fournir des informations précieuses sur la prévention et la gestion du PCO. Par conséquent, ce protocole de culture des LEC constitue un outil essentiel pour les chercheurs en ophtalmologie visant à étudier, comprendre et, en fin de compte, combattre cette complication postopératoire répandue.

Pour démêler les subtilités de la biologie du LEC et son rôle dans la formation de la cataracte et du PCO, il est essentiel d’établir des systèmes de culture cellulaire primaire in vitro robustes et reproductibles. La culture primaire de LEC fournit aux chercheurs un environnement contrôlé pour étudier les fonctions, la signalisation et les caractéristiques moléculaires des LEC. En outre, il permet d’étudier les processus cellulaires et les effets de différentes conditions expérimentales, fournissant des informations précieuses sur la physiologie et la pathologie du cristallin.

Des recherches antérieures ont enrichi notre compréhension des techniques de culture LEC 14,15,16,17,18,19,20. Bien que ces études aient utilisé diverses méthodologies et donné des résultats significatifs sur le comportement et les caractéristiques des LEC, il n’existe pas de protocole d’enregistrement vidéo complet et accessible pour la culture des LEC dans la littérature actuelle. Cette limitation peut entraver la capacité des chercheurs novices à reproduire fidèlement les techniques et peut entraîner des incohérences et des variations dans les résultats expérimentaux. En fournissant un protocole d’enregistrement vidéo, ce document de recherche vise à combler cette lacune et à fournir une ressource standardisée qui peut améliorer la reproductibilité et faciliter le transfert de connaissances dans le domaine de la culture LEC.

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Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux directives de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle. L’approbation procédurale a été accordée par le comité de protection et d’utilisation des animaux du Centre des sciences de la santé de l’Université du Nord du Texas (numéro de protocole : IACUC-2022-0008). De jeunes souris C57BL/6J, généralement âgées de moins de 2 semaines, ont été utilisées dans ces études.

1. Préparation du milieu de culture et dissection du cristallin

  1. Préparer le milieu de culture en ajoutant 50 mL de sérum fœtal bovin (FBS) et 0,1 mL de gentamicine à 50 mg/mL à 450 mL de DMEM.
  2. Euthanasier sans cruauté les souris C57BL/6J de moins de 2 semaines.
    REMARQUE : Nous avons euthanasié en utilisant la méthode d’inhalation de CO2 . Un débit optimal pour les systèmes d’euthanasie au CO2 doit déplacer 30 % à 70 % du volume de la chambre ou de la cage/min.
  3. Retirez délicatement les paupières à l’aide de ciseaux chirurgicaux et appliquez une pression délicate avec une pince à épiler incurvée sur les côtés opposés de l’orbite, ce qui fait saillir l’œil vers l’extérieur. Faites une incision soigneuse sur la cornée à l’aide du couteau à cataracte et extrayez soigneusement le cristallin à l’aide d’une pince à épiler incurvée, en veillant à ce que le cristallin ou sa capsule ne soit pas endommagé.
    REMARQUE : Soyez prudent lors de l’exécution de ces étapes pour maintenir l’intégrité de la capsule de lentille. En raison de la nature délicate de l’objectif, il est important d’utiliser des outils de dissection avec des pointes incurvées et émoussées pour minimiser le risque d’endommager l’objectif.
  4. Utiliser une pince à épiler incurvée à pointe émoussée pour transférer les lentilles dans une boîte de culture tissulaire en plastique de 60 mm remplie de 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) préchauffée et stérile contenant 10 μg/mL de gentamicine.
  5. Rincer délicatement les lentilles avec une solution DPBS contenant 10 μg/mL de gentamicine pour éliminer tout débris ou contaminant potentiel, préparer les lentilles pour un traitement ultérieur et maintenir un environnement de culture stérile.
  6. Pour obtenir un nombre suffisant de LEC, mettez en commun quatre lentilles pour une plaque de culture à 24 puits et six lentilles pour une plaque de culture à 6 puits.

2. Isolement des ESL

  1. Une fois le processus de rinçage terminé, placez l’objectif sur un morceau de papier filtre, en le laissant sécher.
  2. Une fois que la lentille est suffisamment sèche, transférez-la soigneusement sur le couvercle d’une boîte de Pétri en vue du retrait de la capsule de la lentille.
  3. Faites pivoter la lentille vers le haut, en vous assurant que le segment antérieur est orienté vers le haut. Lorsque vous utilisez la pince à épiler pour tenir la capsule antérieure, utilisez la pince capsulorhexis dans la main dominante pour créer une petite déchirure dans la capsule. Tirez doucement les deux outils dans des directions opposées pour retirer la capsule et placez-la dans DPBS jusqu’à ce que toutes les dissections de l’objectif soient terminées.
    REMARQUE : Pour éviter toute divergence, les chercheurs doivent disséquer rapidement chaque capsule épithéliale du cristallin et les stocker temporairement dans le DPBS. Ce n’est qu’après avoir terminé toutes les dissections que les capsules sont transférées collectivement à la trypsine maintenues à 37 °C, assurant une exposition synchronisée et uniforme.
  4. Transférez délicatement la capsule de lentille sur une plaque à 6 puits. Ajouter 1 mL de solution de trypsine à 0,05 % dans chaque puits pour amorcer le processus de digestion enzymatique.
  5. Agitez doucement la solution de trypsine pour assurer une perméation uniforme. Placer la plaque dans un incubateur de culture cellulaire et laisser la capsule être digérée pendant 8 à 10 minutes à 37 °C.
    REMARQUE : Cette étape facilite la dégradation du tissu de la capsule du cristallin et la libération ultérieure des cellules épithéliales individuelles.
  6. Après l’incubation, hachez soigneusement la capsule de lentille digérée à l’aide de ciseaux à dissection pour décomposer les amas de tissus restants et favoriser la séparation cellulaire.
    REMARQUE : La minutie du hachage des tissus est mise en avant pour assurer une libération efficace des cellules des capsules de lentilles digérées.
  7. Ajouter 0,5 mL du milieu de culture contenant 10 % de FBS pour éteindre la trypsine. Transférer les échantillons de tissus dans un tube de centrifugation et centrifuger à 1 000 × g pendant 5 min.
  8. Retirez délicatement le surnageant sans perturber la pastille cellulaire. Utilisez 1 mL de milieu de culture pour remettre les cellules en suspension et ensemencer les cellules dans une plaque à 24 puits.
  9. Changez le milieu de culture tous les 2-3 jours.

3. Sous-culture des LEC

  1. Une fois que les cellules ont atteint la confluence, retirez le milieu de la boîte de culture. Procéder au lavage des cellules 2x avec 1 mL de DPBS.
  2. Ajouter 200 μL de solution trypsine-EDTA et placer les cellules dans l’incubateur pendant 5 min.
  3. Après l’incubation, retirez les cellules de l’incubateur et inspectez-les au microscope pour confirmer qu’elles se sont détachées de la boîte de culture et ont commencé à flotter.
  4. Ajouter 1 mL de milieu de culture et pipeter doucement les cellules 3 à 5 fois pour détacher toutes les cellules.
  5. Transférer les cellules dans des tubes à centrifuger et centrifuger à 1 000 × g pendant 5 min.
  6. Retirez soigneusement le surnageant et remettez les cellules en suspension dans le milieu de croissance complet.
  7. Si nécessaire, comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
  8. Subdiviser la suspension cellulaire dans un rapport de 1:2 ou 1:3 à des fins de sous-culture.
  9. Lorsque la culture redevient confluente, répétez les procédures susmentionnées.
    REMARQUE : Les LEC s’épanouissent dans des conditions de culture à haute densité. Évitez de diluer excessivement les cellules, car cela pourrait entraver leur croissance.

4. Stockage et expédition

REMARQUE : Le numéro de cellule idéal pour le stockage est ~1 × 106.

  1. Lavez soigneusement les cellules 3x avec 1 mL de DPBS. Après le lavage, ajouter 1 mL de solution trypsine-EDTA et placer les cellules dans l’incubateur pendant 5 min.
  2. Ajouter 2 mL de milieu de culture complet et transférer la suspension cellulaire dans le tube à centrifuger et centrifuger à 1 000 × g pendant 5 min.
  3. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans un milieu de congélation composé de 90 % de FBS et de 10 % de DMSO, en visant une densité cellulaire de 1 × 106 cellules/mL. Transférer la suspension cellulaire dans le cryoflacon.
  4. Déplacer immédiatement les cellules dans un environnement à -20 °C pendant 1 h, puis à -80 °C pendant la nuit, avant de les stocker définitivement dans de l’azote liquide.
    REMARQUE : Si l’azote liquide n’est pas disponible, les cellules peuvent être stockées à -80 °C après une heure initiale à -20 °C.
  5. Si un envoi est nécessaire, expédiez les cellules dans le cryoflacon dans un colis avec de la glace carbonique pour une livraison le lendemain.
  6. À la réception des cellules, assurez-vous d’une récupération rapide et placez les cellules dans la sous-culture. Si la culture immédiate n’est pas possible, transférez les cellules dans de l’azote liquide pour un stockage prolongé.
    REMARQUE : Si les cellules doivent être expédiées, assurez-vous que les échantillons sont profondément enfouis dans la glace sèche pour éviter les dommages potentiels causés par les fluctuations de température.

5. Validation des ESL

  1. Placer les LEC dans des boîtes de culture de 35 mm avec des verres de couverture et les cultiver pendant environ 48 h.
  2. Laver les cellules 2x avec du PBS et fixer les cellules avec du méthanol froid pendant 10 min à -20 °C.
  3. Laver les cellules fixes pendant 3 x 5 min avec du PBS et incuber les cellules fixes avec un tampon de blocage pendant 1 h à température ambiante pour éviter une liaison non spécifique.
  4. Après le blocage, incuber les cellules pendant la nuit à 4 °C avec les anticorps primaires (αA-cristallin, γ-cristallin et anticorps PROX1) dilués individuellement dans un rapport de 1:50 dans un tampon diluant.
  5. Laver les cellules pendant 3 x 5 min avec du PBS et incuber les cellules avec l’anticorps secondaire dilué 1:100 dans un tampon de diluant pendant 1 h.
  6. Laver les cellules pendant 3 x 5 min avec du PBS et colorer les cellules avec 5 μg/mL Hoechst 33342 dans du PBS pendant 10 min à température ambiante pour visualiser les noyaux.
  7. Lavez les cellules pendant 2 x 5 minutes avec du PBS pour éliminer l’excès de solution de coloration et capturez des images fluorescentes des cellules à l’aide d’un microscope à fluorescence utilisant le canal DAPI pour les noyaux et le canal FITC pour les αA-, γ-cristallins et PROX1.

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Résultats

Comme le montre la figure 2, en suivant ce protocole, les LEC primaires des souris C57BL/6J ont adhéré aux antennes dans un délai de 4 h. Notamment, il y avait des restes visibles d’autres tissus tels que des sections de la capsule postérieure et des cellules de fibre du cristallin. Cependant, ces éléments non intentionnels ne se fixaient pas à la boîte et pouvaient donc être supprimés en changeant le milieu de culture. Par la suite, entre le troisième et le cinquième jour, les...

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Discussion

Le protocole présenté dans ce document fournit un guide complet, étape par étape, pour réussir l’isolement, la culture et la sous-culture des ESL primaires, accompagné d’une documentation vidéo. Le guide visuel détaillé ainsi que les instructions écrites améliorent la clarté et l’accessibilité du protocole, favorisant son utilisation et sa reproductibilité auprès des chercheurs dans le domaine. L’objectif ultime est de contribuer à l’ensemble croissant des connaissances entourant le rôle des LE...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par NEI R21EY033941 (à Hongli Wu) ; le ministère de la Défense W81XWH2010896 (à Hongli Wu) ; R15GM123463-02 (à Kayla Green et Hongli Wu)

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% Trypsin-EDTAThermo Fisher#25300054For LECs dissociation
Alexa Fluor 488 Secondary Antibody Jackson ImmunoResearch#715-545-150For cell validation
Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch111-605-003For cell validation
Antibody dilution bufferLicor#927-60001For cell validation
Beaver safety knifeBeaver-Visitec International#3782235For lens dissection
Blocking bufferLicor#927-60001For cell validation
Capsulorhexis forcepsTitan Medical InstrumentsTMF-124For lens capsule isolation
DMEMSigma AldrichD6429For LECs culture medium
DMSOSigma Aldrich#D2650For making freezing medium 
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher#J67802For lens dissection
Dumont tweezersRoboz Surgical InstrumentRS-4976For lens capsule isolation
EpiCGS-a (optional)ScienCell4182For LECs culture medium
FBSSigma AldrichF2442For LECs culture medium
Gentamicin (50 mg/mL)Sigma-AldrichG1397For LECs culture medium
Hoechst 33342 solutionThermo Fisher#62249For cell validation
Micro-dissecting scissorsRoboz Surgical Instrument RS-5983For lens dissection
Micro-dissecting tweezersRoboz Surgical Instrument RS5137 For lens dissection
PROX1 antibodyThermo Fisher11067-2-APFor cell validation
Vannas micro-dissecting spring scissorsRoboz Surgical InstrumentRS-5608For lens capsule isolation
αA-crystallin antibodySanta Cruzsc-28306For cell validation 
γ-crystallin antibodySanta Cruzsc-365256For cell validation

Références

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