Optimisation de la culture de cellules épithéliales primaires du cristallin de souris : un guide complet de la trypsinisation

Résumé

Ce manuscrit décrit un protocole vidéo détaillé pour la culture de cellules épithéliales primaires du cristallin (LEC), visant à améliorer la reproductibilité et à faciliter la recherche sur la cataracte et l’opacification de la capsule postérieure (PCO). Il offre des instructions étape par étape sur la dissection du cristallin, l’isolation et la validation des LEC, servant de guide précieux, en particulier pour les nouveaux arrivants dans le domaine.

Résumé

Les cellules épithéliales du cristallin (LEC) jouent de multiples rôles importants dans le maintien de l’homéostasie et de la fonction normale du cristallin. Les LEC déterminent la croissance, le développement, la taille et la transparence des lentilles. À l’inverse, un CLE dysfonctionnel peut entraîner la formation de cataracte et l’opacification de la capsule postérieure (OCP). Par conséquent, la mise en place d’un système de culture primaire LEC robuste est importante pour les chercheurs engagés dans le développement de lentilles, la biochimie, les traitements de la cataracte et la prévention du SOPK. Cependant, la culture des LEC primaires a longtemps présenté des défis en raison de leur disponibilité limitée, de leur faible taux de prolifération et de leur nature délicate.

Cette étude aborde ces obstacles en présentant un protocole complet pour la culture primaire des LEC. Le protocole comprend des étapes essentielles telles que la formulation d’un milieu de culture optimisé, l’isolement précis des capsules de lentilles, les techniques de trypsinisation, les procédures de sous-culture, les protocoles de récolte et les directives pour le stockage et l’expédition. Tout au long du processus de culture, la morphologie cellulaire a été surveillée à l’aide de la microscopie à contraste de phase.

Pour confirmer l’authenticité des LEC en culture, des tests d’immunofluorescence ont été effectués pour détecter la présence et la distribution subcellulaire de protéines critiques du cristallin, à savoir les αA- et γ-cristallins. Ce protocole détaillé fournit aux chercheurs une ressource précieuse pour cultiver et caractériser les LEC primaires, permettant des progrès dans notre compréhension de la biologie du cristallin et le développement de stratégies thérapeutiques pour les troubles liés au cristallin.

Introduction

Le cristallin de l’œil joue un rôle crucial dans la vision en concentrant la lumière entrante sur la rétine. Il s’agit d’une structure avasculaire transparente composée de cellules spécialisées, parmi lesquelles les cellules épithéliales du cristallin (LEC) sont des acteurs clés. Les LEC sont situés sur la surface antérieure du cristallin et sont responsables du maintien de sa transparence, de la régulation de l’équilibre hydrique et de la participation à la croissance et au développement du cristallin ^1,2. Les LEC sont un type unique de cellules situées dans la partie antérieure du cristallin, jouant un rôle ....

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux directives de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle. L’approbation procédurale a été accordée par le comité de protection et d’utilisation des animaux du Centre des sciences de la santé de l’Université du Nord du Texas (numéro de protocole : IACUC-2022-0008). De jeunes souris C57BL/6J, généralement âgées de moins de 2 semaines, ont été utilisées dans ces études.

1. Préparation du milieu de culture et dissection du cristallin

1. Préparer le milieu de cultu....

Discussion

Le protocole présenté dans ce document fournit un guide complet, étape par étape, pour réussir l’isolement, la culture et la sous-culture des ESL primaires, accompagné d’une documentation vidéo. Le guide visuel détaillé ainsi que les instructions écrites améliorent la clarté et l’accessibilité du protocole, favorisant son utilisation et sa reproductibilité auprès des chercheurs dans le domaine. L’objectif ultime est de contribuer à l’ensemble croissant des connaissances entourant le rôle des LE.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Thermo Fisher	#25300054	For LECs dissociation
Alexa Fluor 488 Secondary Antibody	Jackson ImmunoResearch	#715-545-150	For cell validation
Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-605-003	For cell validation
Antibody dilution buffer	Licor	#927-60001	For cell validation
Beaver safety knife	Beaver-Visitec International	#3782235	For lens dissection
Blocking buffer	Licor	#927-60001	For cell validation
Capsulorhexis forceps	Titan Medical Instruments	TMF-124	For lens capsule isolation
DMEM	Sigma Aldrich	D6429	For LECs culture medium
DMSO	Sigma Aldrich	#D2650	For making freezing medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher	#J67802	For lens dissection
Dumont tweezers	Roboz Surgical Instrument	RS-4976	For lens capsule isolation
EpiCGS-a (optional)	ScienCell	4182	For LECs culture medium
FBS	Sigma Aldrich	F2442	For LECs culture medium
Gentamicin (50 mg/mL)	Sigma-Aldrich	G1397	For LECs culture medium
Hoechst 33342 solution	Thermo Fisher	#62249	For cell validation
Micro-dissecting scissors	Roboz Surgical Instrument	RS-5983	For lens dissection
Micro-dissecting tweezers	Roboz Surgical Instrument	RS5137	For lens dissection
PROX1 antibody	Thermo Fisher	11067-2-AP	For cell validation
Vannas micro-dissecting spring scissors	Roboz Surgical Instrument	RS-5608	For lens capsule isolation
αA-crystallin antibody	Santa Cruz	sc-28306	For cell validation
γ-crystallin antibody	Santa Cruz	sc-365256	For cell validation