Оптимизация культуры эпителиальных клеток первичного хрусталика мыши: подробное руководство по трипсинизации

Резюме

В этой рукописи описывается подробный видеопротокол культивирования первичных эпителиальных клеток хрусталика (LEC), направленный на улучшение воспроизводимости и помощь в исследованиях катаракты и помутнения задней капсулы (ПКЯ). Он предлагает пошаговые инструкции по препарированию хрусталика, изоляции и валидации LEC, что служит ценным руководством, особенно для новичков в этой области.

Аннотация

Эпителиальные клетки хрусталика (LEC) играют несколько важных ролей в поддержании гомеостаза и нормального функционирования хрусталика. LEC определяют рост, развитие, размер и прозрачность хрусталика. И наоборот, дисфункциональные ЛЭК могут привести к образованию катаракты и помутнению задней капсулы (ПКЯ). Следовательно, создание надежной системы первичного культивирования LEC важно для исследователей, занимающихся разработкой хрусталиков, биохимией, терапией катаракты и профилактикой ПКЯ. Тем не менее, культивирование первичных ЛЭК уже давно представляет собой проблему из-за их ограниченной доступности, медленной скорости распространения и деликатного характера.

Данное исследование направлено на устранение этих препятствий путем представления комплексного протокола для первичной культуры LEC. Протокол включает в себя такие важные этапы, как разработка оптимизированной питательной среды, точная изоляция капсул хрусталика, методы трипсинизации, процедуры субкультуры, протоколы сбора урожая и рекомендации по хранению и транспортировке. На протяжении всего процесса культивирования морфологию клеток контролировали с помощью фазово-контрастной микроскопии.

Для подтверждения подлинности культивируемых ЛЭК были проведены иммунофлуоресцентные анализы для выявления наличия и субклеточного распределения критических белков хрусталика, а именно αA- и γ-кристаллинов. Этот подробный протокол предоставляет исследователям ценный ресурс для культивирования и характеристики первичных ЛЭК, что позволяет продвинуться в понимании биологии хрусталика и разработке терапевтических стратегий для расстройств, связанных с хрусталиком.

Введение

Хрусталик глаза играет решающую роль в зрении, фокусируя входящий свет на сетчатке. Он состоит из прозрачной аваскулярной структуры, состоящей из специализированных клеток, среди которых ключевыми игроками являются эпителиальные клетки хрусталика (LEC). ЛЭК располагаются на передней поверхности хрусталика и отвечают за поддержание его прозрачности, регулирование водного баланса и участие в росте и развитии хрусталика ^1,2. LEC — это уникальный тип клеток, расположенных в передней части хрусталика, играющих важнейшую роль в поддержании четкости и функции хрусталика путем непрерывного производства волокон хрустал....

протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с рекомендациями Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии для использования животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения. Процедурное одобрение было предоставлено Комитетом по уходу за животными и использованию Научного центра здоровья Университета Северного Техаса (номер протокола: IACUC-2022-0008). В этих исследованиях использовали молодых мышей C57BL/6J, как правило, в возрасте до 2 недель.

1. Подготовка питательной среды и диссекция хрусталика

1. Приготовьте питательную среду, добавив 50 мл фетальной бычьей сыворотки (FB....

Результаты

Как показано на рисунке 2, следуя этому протоколу, первичные ЛЭК мышей C57BL/6J прилипали к чашкам в течение 4 ч. Примечательно, что были видны остатки других тканей, таких как срезы задней капсулы и клетки волокон хрусталика. Однако эти непредусмотренные элементы не прикрепл.......

Обсуждение

Протокол, представленный в этом документе, представляет собой всеобъемлющее, пошаговое руководство по успешной изоляции, культуре и субкультуре первичных LEC, дополненное сопроводительной видеодокументацией. Подробное визуальное руководство вместе с письменными инструкциями повыша?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Thermo Fisher	#25300054	For LECs dissociation
Alexa Fluor 488 Secondary Antibody	Jackson ImmunoResearch	#715-545-150	For cell validation
Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-605-003	For cell validation
Antibody dilution buffer	Licor	#927-60001	For cell validation
Beaver safety knife	Beaver-Visitec International	#3782235	For lens dissection
Blocking buffer	Licor	#927-60001	For cell validation
Capsulorhexis forceps	Titan Medical Instruments	TMF-124	For lens capsule isolation
DMEM	Sigma Aldrich	D6429	For LECs culture medium
DMSO	Sigma Aldrich	#D2650	For making freezing medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher	#J67802	For lens dissection
Dumont tweezers	Roboz Surgical Instrument	RS-4976	For lens capsule isolation
EpiCGS-a (optional)	ScienCell	4182	For LECs culture medium
FBS	Sigma Aldrich	F2442	For LECs culture medium
Gentamicin (50 mg/mL)	Sigma-Aldrich	G1397	For LECs culture medium
Hoechst 33342 solution	Thermo Fisher	#62249	For cell validation
Micro-dissecting scissors	Roboz Surgical Instrument	RS-5983	For lens dissection
Micro-dissecting tweezers	Roboz Surgical Instrument	RS5137	For lens dissection
PROX1 antibody	Thermo Fisher	11067-2-AP	For cell validation
Vannas micro-dissecting spring scissors	Roboz Surgical Instrument	RS-5608	For lens capsule isolation
αA-crystallin antibody	Santa Cruz	sc-28306	For cell validation
γ-crystallin antibody	Santa Cruz	sc-365256	For cell validation