使用二氢乙锓 （DHE） 荧光染料生成活性氧 （ROS） 的高通量筛选评估

摘要

该方案描述了一种使用二氢乙铵（DHE）作为荧光染料探针，使用高通量筛选方法定量细胞内活性氧（ROS）的新方法。该方案描述了三种不同肝细胞癌细胞系中细胞内活性氧（ROS）的定量评估方法。

摘要

活性氧（ROS）在生理和病理过程中调节细胞代谢中起着关键作用。生理 ROS 的产生在正常细胞功能（如增殖、信号传导、细胞凋亡和衰老）的空间和时间调节中起着核心作用。相比之下，慢性 ROS 过量生产会导致多种疾病，例如癌症、心血管疾病和糖尿病等。因此，以准确和可重复的方式量化ROS水平对于了解正常的细胞功能至关重要。基于荧光成像的方法来表征细胞内 ROS 物种是一种常用的方法。文献中的许多成像 ROS 方案使用 2'-7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯 （DCFH-DA） 染料。然而，这种染料在使用和可解释性方面存在重大局限性。目前的实验方案演示了使用二氢乙铓（DHE）荧光探针作为在高通量环境中量化ROS总产量的替代方法。高通量成像平台CX7 Cellomics用于测量和量化ROS的产生。这项研究是在三种肝细胞癌细胞系 HepG2、JHH4 和 HUH-7 中进行的。该协议深入描述了评估细胞内ROS所涉及的各种程序，包括- DHE溶液的制备，用DHE溶液孵育细胞以及表征ROS生产所需的DHE强度的测量。该方案表明，DHE荧光染料是一种稳健且可重复的选择，可以以高通量方式表征细胞内ROS的产生。用于测量 ROS 产生的高通量方法可能有助于各种研究，例如毒理学、药物筛选和癌症生物学。

引言

活性氧 （ROS） 是一组天然存在的、高反应性的、时间不稳定的化学自由基，是细胞正常细胞代谢的一部分。ROS 在调节细胞中发生的正常生理和生化过程中起着关键和必不可少的作用 ^1,2。细胞中ROS产生的主要来源是线粒体电子传递链（ETC）途径，作为正常生物能量循环的一部分。ROS产生的重要其他来源包括酶促反应，例如细胞中的细胞NADPH氧化酶。食物分子（例如葡萄糖）的代谢通过线粒体基质中的氧化磷酸化途径发生。ROS产生的基线水平对于调节正常的生理细胞信号传导过程至关重要。已知许多属于葡萄糖代谢信号通路的关键蛋白质分子（例如 Akt 和 PTEN）对细胞内 ROS 水平有反应。此外，ROS 由各种细胞内酶产生，例如黄嘌呤氧化酶、一氧化氮合酶和过氧化物酶体成分，作为细胞酶途径^{的一部分 1,2}。与活性氧的天然来源相比，某些环境因素，如外源性物质、传染性病原体、紫外线、污染、吸烟和辐射，也会导致活性氧的过量产生，而活性氧是细胞内氧化应激的关键驱动因素^1,3。细胞氧化应激升高可对细胞内的天然生物分子（如脂质、蛋白质和 DNA）造成损害，导致各种疾病，如癌症、糖尿病、心血管疾病、慢性炎症和神经退行....

研究方案

1. 细胞培养

1. 将测试细胞（HepG2、HUH7 和 JHH4 肝细胞癌细胞）以 10,000 个细胞/孔的接种密度接种到 96 孔板中，最终接种体积为每孔 200 μL。
   1. 在培养HepG 2细胞之前，在室温（RT）下用IV型胶原（50μg/ mL）涂覆96个板孔2小时。为避免原液凝固，将原液放入冰中，然后开始稀释过程至所需浓度。
   2. 孵育期2小时后，吸出多余的胶原蛋白，并用1x PBS洗涤孔三次。
2. 在37°C和5%CO₂ 浓度下，在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中培养细胞过夜。
3. 第二天，或达到80%-90%汇合度时，以较早者为准，分别用H₂O₂（未处理，250μM，500μM，750μM和1000μM）和甲萘醌（未处理，25μM，50μM，75μM，100μM）处理细胞30分钟以诱导代表性氧化应激。
4. 或者，选择使用能够在细胞内诱导氧化应激的所需测试物质来测试细胞。

2. 细胞DHE染色的储备和稀释溶液制备

1. 通过将 5 mg DHE 溶解到 1 mL DMSO 中来制备 DHE 储备溶液（5 mg/mL 或 15.9 mM）。
2. 用双蒸压水稀....

讨论

在这项研究中，在高内涵筛选系统上建立了使用二氢乙锭 （DHE） 荧光染料评估超氧化物驱动的细胞内活性氧 （ROS） 产生的方案。文献中现有的大多数当前方案都使用DCFH-DA作为荧光成像探针来量化ROS物种。然而，多项研究表明，DCFH-DA并不是测量细胞内ROS的理想探针。DCFH-DA不适合作为探针的各种原因包括：（i）DCFH-DA不与H₂O₂发生直接反应，这使其成为评估细胞内H₂O₂

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tubes	VWR	20170-038
96- well plate	Corning Costar	07-200-90
Cellomics Cx7	ThermoFisher	HCSDCX7LEDPRO
Collagen	Advanced Biomatrix	5056
DHE (Dihydroethidium)	ThermoFisher	D1168
DMEM	Sigma	6046
FBS	VWR	97068-085
GraphPad Prism	GraphPad	Version 6.0
HepG2 cell line	ATCC
Hoechst	ThermoFisher	33342
HUH7 cell line	ATCC
Hydrogen Peroxide	Sigma	88597
JHH4 cell line	ATCC
Menadione	Sigma	M5625