使用二氢乙锓 （DHE） 荧光染料生成活性氧 （ROS） 的高通量筛选评估

摘要

该方案描述了一种使用二氢乙铵（DHE）作为荧光染料探针，使用高通量筛选方法定量细胞内活性氧（ROS）的新方法。该方案描述了三种不同肝细胞癌细胞系中细胞内活性氧（ROS）的定量评估方法。

摘要

活性氧（ROS）在生理和病理过程中调节细胞代谢中起着关键作用。生理 ROS 的产生在正常细胞功能（如增殖、信号传导、细胞凋亡和衰老）的空间和时间调节中起着核心作用。相比之下，慢性 ROS 过量生产会导致多种疾病，例如癌症、心血管疾病和糖尿病等。因此，以准确和可重复的方式量化ROS水平对于了解正常的细胞功能至关重要。基于荧光成像的方法来表征细胞内 ROS 物种是一种常用的方法。文献中的许多成像 ROS 方案使用 2'-7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯 （DCFH-DA） 染料。然而，这种染料在使用和可解释性方面存在重大局限性。目前的实验方案演示了使用二氢乙铓（DHE）荧光探针作为在高通量环境中量化ROS总产量的替代方法。高通量成像平台CX7 Cellomics用于测量和量化ROS的产生。这项研究是在三种肝细胞癌细胞系 HepG2、JHH4 和 HUH-7 中进行的。该协议深入描述了评估细胞内ROS所涉及的各种程序，包括- DHE溶液的制备，用DHE溶液孵育细胞以及表征ROS生产所需的DHE强度的测量。该方案表明，DHE荧光染料是一种稳健且可重复的选择，可以以高通量方式表征细胞内ROS的产生。用于测量 ROS 产生的高通量方法可能有助于各种研究，例如毒理学、药物筛选和癌症生物学。

引言

活性氧 （ROS） 是一组天然存在的、高反应性的、时间不稳定的化学自由基，是细胞正常细胞代谢的一部分。ROS 在调节细胞中发生的正常生理和生化过程中起着关键和必不可少的作用 ^1,2。细胞中ROS产生的主要来源是线粒体电子传递链（ETC）途径，作为正常生物能量循环的一部分。ROS产生的重要其他来源包括酶促反应，例如细胞中的细胞NADPH氧化酶。食物分子（例如葡萄糖）的代谢通过线粒体基质中的氧化磷酸化途径发生。ROS产生的基线水平对于调节正常的生理细胞信号传导过程至关重要。已知许多属于葡萄糖代谢信号通路的关键蛋白质分子（例如 Akt 和 PTEN）对细胞内 ROS 水平有反应。此外，ROS 由各种细胞内酶产生，例如黄嘌呤氧化酶、一氧化氮合酶和过氧化物酶体成分，作为细胞酶途径^{的一部分 1,2}。与活性氧的天然来源相比，某些环境因素，如外源性物质、传染性病原体、紫外线、污染、吸烟和辐射，也会导致活性氧的过量产生，而活性氧是细胞内氧化应激的关键驱动因素^1,3。细胞氧化应激升高可对细胞内的天然生物分子（如脂质、蛋白质和 DNA）造成损害，导致各种疾病，如癌症、糖尿病、心血管疾病、慢性炎症和神经退行性疾病 ^1,3,4。因此，ROS的准确测量对于了解氧化应激诱导的疾病病理生理学所涉及的细胞机制至关重要。

由于细胞内 ROS 产生和消除的时间很短，因此对各种 ROS 自由基的定量测量仍然是一个挑战。电子顺磁共振 （EPR）⁵、高压液相色谱 （HPLC） 和基于荧光探针的成像等方法用于测量各种细胞 ROS⁶。虽然 EPR 和 HPLC 等方法可产生定量准确的估计，但这些方法涉及细胞空间形态的破坏，并且通常采用样品的全局和批量测量形式。相比之下，基于成像的方法（例如基于荧光探针的方法）保留了ROS生成的细胞形态和空间背景。然而，各种荧光探针对不同类型 ROS 自由基的特异性尚未得到充分证实 ^7,8。几种荧光探针，如二氢乙铵 （DHE）、二氯二氢荧光素二乙酸酯 （DCFH-DA）、二氢罗丹明 （DHR）、二甲基蒽 （DMA）、2,7 二氯二氢荧光素 （DCFH）、1,3-二苯基苯并呋喃 （DPBF） 和 MitoSox 可用于商业 ROS 检测。在过去的几十年中，DHE、MitoSox 和 DCFH-DA 是测量细胞和组织中 ROS 的常用荧光染料 ^8,9。DCFH-DA 是一种广泛使用的染料，用于检测细胞内 H、₂、O₂ 和氧化应激。尽管 DCFH-DA 很受欢迎，但之前的多项研究表明，它不能可靠地用于测量细胞内 H₂O₂ 和其他 ROS 水平^{8、9、10、11、12、13、14}。

相反，荧光探针二氢乙锾 （DHE） 显示出对细胞内超氧自由基 （O₂^-） 的特异性反应。虽然超氧自由基是在细胞中观察到的许多 ROS 物质之一，但它是一种重要的自由基，参与过渡金属的还原、转化为过氧硝酸盐和氢过氧化物的形成，以及其他细胞内效应。DHE迅速被细胞吸收，并在红色波长^范围15内具有荧光发射。在与超氧自由基发生特异性反应时，DHE形成红色荧光产物2-羟基乙锭（2-OH-E⁺）。因此，DHE可以被认为是用于超氧化物检测的特异性探针。然而，DHE也可以与ONOO^-或OH^.、H₂O 2和细胞色素c进行非特异性氧化_，形成第二种荧光产物乙锭E^+，其可以干扰测量的2-OH-E⁺水平。然而，当用 DHE 染色时，这些 2-OH E⁺ 和 E⁺ 产物组合在一起，代表了细胞内观察到的总细胞 ROS 物质的主要部分。E⁺ 插入 DNA，大大增强其荧光^{8、9、10、11、13、14、15、16}。由于乙锭和2-羟基乙锭的荧光光谱仅略有不同，因此可以使用DHE荧光产物检测和测量继发于超氧化物产生的细胞中观察到的大多数ROS水平。使用 480 nm 波长激发和 610 nm 波长发射 15,16,17 鉴定这些 ROS 物质。

除了选择特定的荧光ROS检测探针外，选择一种灵敏的检测方法来测量细胞内ROS也很重要。因此，准确评估细胞内 ROS 水平是识别患病细胞或暴露于各种环境应激源（如辐射、毒理化合物和遗传毒性物质）的细胞中发生的氧化还原平衡状态紊乱的关键¹⁸。由于 ROS 是细胞中常见的现象，负责调节各种细胞信号传导活动，因此可靠的 ROS 检测方法至关重要。为了能够对细胞内的ROS产生进行这种高通量评估，该协议使用高内涵筛选（HCS）平台来测量ROS种类。目前的方案允许对细胞内ROS的产生进行高通量分析，这在许多毒理学研究中至关重要¹⁹。该协议旨在提供一种简单且通用的解决方案来检测和测量贴壁性肝细胞癌细胞中的细胞内ROS。H₂O₂ 和甲萘醌的化学试剂用作有效的 ROS 刺激剂，以测量受控和高通量环境中 ROS 产生的相对水平。根据需要，可以对该方案进行微调，以在适当条件下测量贴壁和非贴壁细胞中ROS的产生。

研究方案

1. 细胞培养

1. 将测试细胞（HepG2、HUH7 和 JHH4 肝细胞癌细胞）以 10,000 个细胞/孔的接种密度接种到 96 孔板中，最终接种体积为每孔 200 μL。
   1. 在培养HepG 2细胞之前，在室温（RT）下用IV型胶原（50μg/ mL）涂覆96个板孔2小时。为避免原液凝固，将原液放入冰中，然后开始稀释过程至所需浓度。
   2. 孵育期2小时后，吸出多余的胶原蛋白，并用1x PBS洗涤孔三次。
2. 在37°C和5%CO₂ 浓度下，在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中培养细胞过夜。
3. 第二天，或达到80%-90%汇合度时，以较早者为准，分别用H₂O₂（未处理，250μM，500μM，750μM和1000μM）和甲萘醌（未处理，25μM，50μM，75μM，100μM）处理细胞30分钟以诱导代表性氧化应激。
4. 或者，选择使用能够在细胞内诱导氧化应激的所需测试物质来测试细胞。

2. 细胞DHE染色的储备和稀释溶液制备

1. 通过将 5 mg DHE 溶解到 1 mL DMSO 中来制备 DHE 储备溶液（5 mg/mL 或 15.9 mM）。
2. 用双蒸压水稀释DHE储备溶液至最终浓度为100μM。
3. 为了避免染料的冻融过程（随着时间的推移可能会破坏荧光特性），在浓度为100μM的1.5mL离心管中制备几种等分试样，并将其储存在-20°C。
4. 为了达到10μM的最终工作浓度，使用100μMDHE浓度的等分试样，并用预热的DMEM培养基稀释。
   注意：工作溶液必须在实验当天新鲜制备。
5. 将工作荧光染料溶液涡旋5-10秒，以确保染料的适当混合。

3.DHE染色工艺

1. 从每个孔中取出含有药物或测试物质的培养基，并用 1x PBS 或 DMEM 轻轻洗涤一次。
   注意：在实验中执行添加或洗涤步骤时，避免细胞与移液器之间的直接接触至关重要。这可以通过沿着孔的侧面轻轻移液 PBS 来实现，以尽量减少对细胞的任何潜在机械损伤。确保移液器不直接接触细胞将有助于在实验期间保持细胞的完整性和活力。
2. 向每个孔中加入100μL含有10μM DHE（工作溶液）的DMEM培养基，并在37°C孵育30分钟。
3. 孵育期30分钟后，除去含DHE的培养基，并用1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）轻轻洗涤每个孔三次。这可以使用多通道移液器进行，以确保快速周转。
4. 在室温下向每个孔中加入 200 μL 1x PBS，用 Hoechst 33342 核染色染料 10 分钟。
5. 从孔中取出 Hoechst 33342 核染色溶液，并向每个孔中加入 200 μL 1x PBS。
   注意：要获得固定细胞，请遵循与活细胞相同的方案，在处理和DHE染色后加入4%PFA5分钟。除去PFA溶液，用1x PBS洗涤细胞。然后，将细胞与核染色染料孵育10分钟。
6. 将板移至高内涵筛选平台、荧光显微镜或酶标仪，以尽快进行图像采集。

4. 图像采集和强度测量

1. 板加载
   1. 打开 Cellomics CX7 高内涵筛选 （HCS） 软件进行数据采集。
   2. 根据制造商的规格，使用特定的 96 孔板提前仔细校准成像平台，以避免数据中出现任何朦胧或模糊的图像。
      注意：来自不同供应商的多孔板可能具有不同的材料特性，并可能影响获得的最终图像的质量。
   3. 校准后，将特定于板品牌的系统参数保存在仪器数据库中，并在将来的数据采集中重复使用。
   4. 小心地将装有制备样品的板放在HCS成像系统的加热台上。确保孔板位置牢固且方向正确，以便在微孔板支架上成像（即，在读板载物台上找到标有 A1 的标签，然后旋转微孔板，使孔 A1 的位置与贴纸的角相匹配）。
   5. 轻轻按压微孔板，确保其平放在载物台上。HCS 系统中板的不均匀调平会导致图像采集错误。
   6. 板就位后，按住 Ctrl 键，然后在软件的“板加载/卸载”对话框中单击 Ctrl-OK 。
2. 选择成像参数
   1. 在HCS成像系统中，在Cellomics生物应用界面中打开 靶标激活 模式，并使用与（a）核染色和（b）DHE荧光探针数据采集兼容的双通道设置方案创建新方案。在当前方案中，过滤器 386_BGSRS_BGSRS、480_BGS_RS 和 386_BGS_RS 分别用于 （a） Hoechst 33342 核染色、（b） 总 ROS 产生和 （c） 超氧自由基检测。这些过滤器的选择是由作为该协议一部分的每种染料（DAPI和DHE）的发射特性的特定重叠驱动的。
      注：滤光片的命名约定，例如386-23_BGRFRN_BGRFRN，是指用带宽为23nm的386 nm光激发样品，然后是二向色滤光片，该滤光片在特定波长范围内通过蓝色（B），绿色（G），红色（R），远红外（FR）和近红外（N）光，386_BGS_RS是指在二向色性之后通过BGS和RS发射波长光的发射滤光片。
   2. 根据需要，在软件协议界面中指定图像采集过程的目标，例如 10 倍或 20 倍放大倍率。
   3. 根据所需的成像细节水平和实验所需的分辨率选择合适的物镜放大倍率。但是，每个目标的分辨率都是固定的。更高分辨率的细节将需要改变平台上的目标。在当前协议中，使用20x，0.45 NA物镜，这是该协议中使用的高内涵筛选平台的一部分。
      注意：20倍物镜代表了成像分辨率细节和捕获ROS随时间变化所需的采集速度之间的良好权衡。可以选择更高放大倍率的物镜（例如，40倍），但是，这将导致采集时间增加。
   4. 根据协议的具体要求，指定图像采集相机的曝光设置，如曝光时间、相机像素合并、z-stack间隔等。
      注意：曝光时间（通常以毫秒为单位）根据所用特定荧光团的信号强度和灵敏度而变化。根据染料浓度和染色质量，这也可能因实验而异。在当前协议中，采集参数固定如下 - 目标百分比 - 35%，图像采集模式 - 1104 x 1104（2x2 像素合并），物镜 20x，0.45 NA。这些参数可以根据具体的实验条件进行设置。
3. 映像配置参数
   注意： 设置成像参数后，可以使用软件界面启动图像采集过程。
   1. 图像采集参数
      1. 使用仪器中可用的不同算法（光学 - 等值数据、固定和三角形）识别感兴趣的主要跟踪对象（细胞核）。
         注意：本协议中使用用于识别和标记主要物体的等值数据方法。
      2. 按形状或强度参数对对象（如果有）进行分割。
      3. 根据每种细胞类型特有的所需大小、形状和强度参数验证主对象。
      4. 然后，定义此主要对象周围的“感兴趣区域”（ROI）。
         注意：ROI是数据采集的一个关键参数，它定义了荧光染料强度被鉴定为在不同细胞类型中一致且可重复的位置。ROI 定义了关键参数（例如染料的强度），这些参数是针对仪器不同通道中的每个主要跟踪对象（即细胞）测量的。ROI可以以围绕每个细胞核的圆圈或环的形式定义。HCS 软件在通道 2 中自动获取 DHE 荧光染料标记物的强度，该强度在以自动方式分割和分析的每个细胞的 ROI 范围内。
      5. 在主要物体（原子核）周围设置一个 20 μm 的圆圈。本研究根据本方案中使用的各种细胞系（HepG2、JHH-4 和 HUH-7）的近似大小选择了 20 μm 的距离。细胞周围的 20 μm 环 ROI 以一致且可重复的方式获得荧光强度。
         注意 选择 ROI 的关键参数是充分覆盖单元区域的能力;圆形 ROI 的大小取决于单元格大小。较大的单元可能需要更大的投资回报率，反之亦然，投资回报率较低。这些参数必须提前确定每种细胞类型和感兴趣的荧光染料。
4. 种群特征和选择要存储的要素
   1. 在 HCS 成像协议中定义各种采集参数后，将 HCS 系统设置为数据采集模式。
   2. 该协议的图像采集参数设置如下：扫描限制为 1000 个细胞/孔，每个区域至少要求 10 个物体（细胞）。
      注意：每孔评估的字段数是根据达到 1000 个的最终细胞计数确定的。HCS系统继续搜索孔内的各个位置，直到获得1000个细胞/孔的目标群体。因此，采集速度取决于 96 孔板的每个孔中的汇合度和总细胞数。在目前的方案中，从每个孔中收集通道2的总强度和平均强度（代表超氧自由基和总ROS产量），用于进一步的下游分析。
5. 图像捕获、处理和分析
   1. 调整并最终确定图像采集参数后，启动每个 96 孔板的扫描过程。
      注：Cellomics CX7 成像系统能够对各种参数的样品进行高内涵筛选和自动分析，包括以高通量方式在细胞内产生 ROS。除了 ROS 生产外，HCS 系统还能够提供有关各种参数的额外有价值的信息，例如细胞形态、亚细胞定位和许多其他感兴趣的细胞特征。一旦针对采集进行了优化，HCS 成像平台就可以以稳健的方式对细胞参数进行全面、定性和定量表征。
   2. 扫描过程完成后，启动 视图分析 软件并以.csv格式导出各种定量数据参数以进行其他分析。
   3. 使用第三方软件，复制并粘贴各种感兴趣的定量值，以便进行其他下游分析。
      注意：在当前协议中，GraphPad Prism软件用于分析DHE强度值，以响应由于H₂O₂ 和甲萘醌暴露引起的氧化应激。
6. 数据和统计分析
   1. 计算通道 2 的平均平均强度（代表总 ROS 值和超氧自由基）。
      注意：所有计算强度值的实验重复三次，每个条件在每个剂量水平重复 6 次。
   2. 执行单因素方差分析或 t 检验，以测量各种测试条件之间强度值的差异。

结果

二氢乙铵 （DHE） 是一种超氧化物响应荧光染料，可提供有关细胞内 ROS 状态的特定信息。DHE染料本质上在细胞质中发出蓝色荧光。然而，在与超氧自由基相互作用时，它被转化为 2-羟基乙鎓，其发出红色波长 （>550 nm） 的荧光（图 1）。DHE染料很容易转运到细胞和细胞核中。发射的荧光可以通过许多实验室中常见的荧光显微镜装置进行可视化。在本研究中，在高内涵筛选平?...

讨论

在这项研究中，在高内涵筛选系统上建立了使用二氢乙锭 （DHE） 荧光染料评估超氧化物驱动的细胞内活性氧 （ROS） 产生的方案。文献中现有的大多数当前方案都使用DCFH-DA作为荧光成像探针来量化ROS物种。然而，多项研究表明，DCFH-DA并不是测量细胞内ROS的理想探针。DCFH-DA不适合作为探针的各种原因包括：（i）DCFH-DA不与H₂O₂发生直接反应，这使其成为评估细胞内H₂O₂

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tubes	VWR	20170-038
96- well plate	Corning Costar	07-200-90
Cellomics Cx7	ThermoFisher	HCSDCX7LEDPRO
Collagen	Advanced Biomatrix	5056
DHE (Dihydroethidium)	ThermoFisher	D1168
DMEM	Sigma	6046
FBS	VWR	97068-085
GraphPad Prism	GraphPad	Version 6.0
HepG2 cell line	ATCC
Hoechst	ThermoFisher	33342
HUH7 cell line	ATCC
Hydrogen Peroxide	Sigma	88597
JHH4 cell line	ATCC
Menadione	Sigma	M5625