JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשנית לכימות מיני חמצן תגובתי תוך-תאי (ROS) באמצעות דיהידרואתידיום (DHE) כבדיקת צבע פלואורסצנטי באמצעות גישת סינון בתפוקה גבוהה. הפרוטוקול מתאר את השיטות להערכה כמותית של מיני חמצן תגובתי תוך-תאי (ROS) בשלושת קווי תאי הקרצינומה ההפטוצלולרית השונים.

Abstract

מיני חמצן תגובתי (ROS) ממלאים תפקיד מפתח בוויסות חילוף החומרים התאי בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים. ייצור ROS פיזיולוגי ממלא תפקיד מרכזי באפנון המרחבי והזמני של תפקודים תאיים נורמליים כגון התפשטות, איתות, אפופטוזיס והזדקנות. לעומת זאת, ייצור יתר כרוני של ROS אחראי למגוון רחב של מחלות, כגון סרטן, מחלות לב וכלי דם וסוכרת, בין היתר. לכן, כימות רמות ROS באופן מדויק וניתן לשחזור חיוני להבנת הפונקציונליות התאית הרגילה. שיטות מבוססות הדמיה פלואורסצנטית לאפיון מיני ROS תוך-תאיים היא גישה נפוצה. רבים מפרוטוקולי ההדמיה ROS בספרות משתמשים בצבע 2'-7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). עם זאת, צבע זה סובל ממגבלות משמעותיות בשימוש וביכולת הפרשנות שלו. הפרוטוקול הנוכחי מדגים את השימוש בגשושית פלואורסצנטית דיהידרואתידיום (DHE) כשיטה חלופית לכימות הייצור הכולל של ROS בסביבה של תפוקה גבוהה. פלטפורמת ההדמיה בעלת התפוקה הגבוהה, CX7 Cellomics, שימשה למדידה וכימות של ייצור ROS. מחקר זה נערך בשלושה קווי תאים של סרטן הכבד - HepG2, JHH4 ו- HUH-7. פרוטוקול זה מספק תיאור מעמיק של ההליכים השונים המעורבים בהערכת ROS בתוך התאים, כולל - הכנת תמיסת DHE, דגירה של תאים עם תמיסת DHE, ומדידת עוצמת DHE הדרושה לאפיון ייצור ROS. פרוטוקול זה מדגים כי צבע פלואורסצנטי DHE הוא בחירה חזקה וניתנת לשחזור לאפיון ייצור ROS תוך תאי באופן בתפוקה גבוהה. גישות תפוקה גבוהה למדידת ייצור ROS עשויות להיות מועילות במגוון מחקרים, כגון טוקסיקולוגיה, סינון תרופות וביולוגיה של סרטן.

Introduction

מיני חמצן תגובתי (ROS) הם קבוצה של רדיקלים כימיים טבעיים, תגובתיים מאוד ובלתי יציבים באופן זמני הנוצרים כחלק מחילוף החומרים התאי הרגיל בתאים. ROS ממלא תפקיד מפתח וחיוני באפנון תהליכים פיזיולוגיים וביוכימיים נורמליים המתרחשים בתאים 1,2. המקור העיקרי לייצור ROS בתאים הוא ממסלול שרשרת הובלת האלקטרונים המיטוכונדריאלית (ETC) כחלק מהמחזור הביו-אנרגטי הרגיל. מקורות משמעותיים נוספים לייצור ROS כוללים תגובות אנזימטיות כגון NADPH אוקסידאזות תאיות בתאים. חילוף החומרים של מולקולות מזון (למשל, גלוקוז) מתרחש דרך מסלול הזרחן החמצוני במטריצה המיטוכונדריאלית. רמה בסיסית של ייצור ROS חיונית לוויסות תהליכי איתות פיזיולוגיים תקינים. מולקולות חלבון מפתח רבות שהן חלק ממסלולי האיתות המטבולי של גלוקוז (למשל, Akt ו-PTEN) ידועות כמגיבות לרמות ROS תוך-תאיות. נוסף על כך, ROS מיוצר על-ידי אנזימים תוך-תאיים שונים, כגון קסנטין אוקסידאז, תחמוצת החנקן סינתאז ומרכיבים פרוקסיזומליים, כחלק מהמסלולים האנזימטיים התאיים 1,2. בניגוד למקורות הטבעיים של ROS, גורמים סביבתיים מסוימים, כגון קסנוביוטים, גורמים זיהומיים, אור UV, זיהום, עישון סיגריות וקרינה, מובילים גם לייצור יתר של ROS, שהם גורם מפתח לעקה חמצונית תוך-תאית 1,3. עקה חמצונית תאית מוגברת עלולה לגרום נזק לביומומולקולות טבעיות בתוך התא, כגון שומנים, חלבונים ודנ"א, ולגרום למחלות שונות כגון סרטן, סוכרת, מחלות לב וכלי דם, דלקת כרונית והפרעות נוירודגנרטיביות 1,3,4. לכן, מדידות מדויקות של ROS חיוניות להבנת המנגנונים התאיים המעורבים בפתופיזיולוגיה של מחלות הנובעות מעקה חמצונית.

בשל לוחות הזמנים הקצרים של ייצור ROS וסילוקם בתוך תאים, מדידות כמותיות של רדיקלי ROS שונים נותרו אתגר. שיטות כגון תהודה פאראמגנטית אלקטרונית (EPR)5, כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC) והדמיה מבוססת בדיקה פלואורסצנטית משמשות למדידת ROS6 התאיים השונים. בעוד ששיטות כגון EPR ו- HPLC מניבות הערכות מדויקות מבחינה כמותית, שיטות אלה כרוכות בהרס המורפולוגיה המרחבית התאית והן בדרך כלל בצורה של מדידות גלובליות ובתפזורת של דגימה. לעומת זאת, שיטות מבוססות הדמיה כגון שיטות מבוססות בדיקה פלואורסצנטית שומרות על המורפולוגיה התאית וההקשר המרחבי של דור ה-ROS. עם זאת, הספציפיות של בדיקות פלואורסצנטיות שונות עבור סוגים שונים של רדיקלים ROS לא התבססה היטב 7,8. מספר בדיקות פלואורסצנטיות כגון dihydroethidium (DHE), dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA), dihydrorhodamine (DHR), dimethyl anthracene (DMA), 2,7 dichlorodihydroflurescein (DCFH), 1,3-Diphenylisobenzofuran (DPBF) ו- MitoSox זמינים לזיהוי ROS באופן מסחרי. בעשורים האחרונים, DHE, MitoSox ו-DCFH-DA הם הצבעים הפלואורסצנטיים הנפוצים למדידת ROS בתאים וברקמות 8,9. DCFH-DA הוא צבע נפוץ לזיהוי H2O2 תוך תאי ועקה חמצונית. למרות הפופולריות של DCFH-DA, מחקרים קודמים רבים הראו כי לא ניתן להשתמש בו באופן אמין כדי למדוד רמות תוך-תאיות H2O2 ורמות ROS אחרות 8,9,10,11,12,13,14.

לעומת זאת, הבדיקה הפלואורסצנטית דיהידרואתידיום (DHE) מראה תגובה ספציפית לרדיקל הסופראוקסיד התוך-תאי (O2-). בעוד רדיקל סופראוקסיד הוא אחד ממיני ROS רבים שנצפו בתאים, הוא רדיקל חשוב המעורב בהפחתת מתכות מעבר, המרה לפרוקסיניטרט והיווצרות הידרופרוקסידים, בין השפעות תוך-תאיות אחרות. DHE נקלט במהירות על ידי התאים ויש לו פליטה פלואורסצנטית בתחום אורכי הגל האדומים15. בתגובה עם רדיקל סופראוקסיד באופן ספציפי, DHE יוצר תוצר פלואורסצנטי אדום, 2-הידרוקסי אתידיום (2-OH-E+). לפיכך, DHE עשוי להיחשב כבדיקה ספציפית לגילוי סופראוקסיד. עם זאת, DHE יכול גם לעבור חמצון לא ספציפי עם ONOO- או OH., H2O2, וציטוכרום C כדי ליצור מוצר פלואורסצנטי שני, אתידיום E+, אשר יכול להפריע לרמות 2-OH-E+ הנמדדות. עם זאת, מוצרי 2-OH E+ ו-E+ אלה, בשילוב, מייצגים חלק עיקרי מכלל מיני ה-ROS התאיים שנצפו בתוך התא כאשר הם מוכתמים ב-DHE. E+ מתחבר לדנ"א, ומשפר מאוד את הפלואורסצנטיות שלו 8,9,10,11,13,14,15,16. מאחר שהספקטרום הפלואורסצנטי של אתידיום ואתידיום 2-הידרוקסי שונה רק במקצת, ניתן לזהות ולמדוד את רוב רמות ה-ROS הנראות בתא משני לייצור סופראוקסיד באמצעות תוצרי פלואורסצנטיות של DHE. מיני ROS אלה מזוהים באמצעות עירור אורך גל של 480 ננומטר ופליטת אורך גל של 610 ננומטר 15,16,17.

בנוסף לבחירת בדיקה ספציפית לזיהוי ROS פלואורסצנטי, חשוב לבחור שיטת זיהוי רגישה למדידת ROS תוך תאי. הערכה מדויקת של רמות ROS תוך-תאיות היא אפוא המפתח לזיהוי מצבי איזון חמצון-חיזור מופרעים המתרחשים בתאים חולים או בתאים שנחשפו לגורמי עקה סביבתיים שונים כגון קרינה, תרכובות טוקסיקולוגיות וחומרים גנוטוקסיים18. מאחר ש-ROS היא תופעה נפוצה בתאים שאחראית על ויסות מגוון פעילויות איתות תאי, שיטות חזקות לזיהוי ROS הן חיוניות. כדי לאפשר הערכה כזו של תפוקה גבוהה של ייצור ROS בתוך תאים, פרוטוקול זה משתמש בפלטפורמת סינון תוכן גבוה (HCS) כדי למדוד את מיני ROS. הפרוטוקול הנוכחי מאפשר ניתוח בתפוקה גבוהה של ייצור ROS תוך תאי, שהוא בעל חשיבות קריטית במחקרי טוקסיקולוגיה רבים19. פרוטוקול זה נועד לספק פתרון קל ורב-תכליתי לזיהוי ומדידה של ROS תוך-תאי בתאי קרצינומה הפטוצלולרית דבקים. הריאגנטים הכימיים של H2, O, 2 ומנדיון משמשים כממריצי ROS רבי עוצמה כדי למדוד את הרמות היחסיות של ייצור ROS בסביבה מבוקרת ותפוקה גבוהה. פרוטוקול זה עשוי להיות מכוונן כדי למדוד את ייצור ROS בתאים דבקים ולא דבקים בתנאים מתאימים, לפי הצורך.

Protocol

1. תרבית תאים

  1. זרעו את תאי הבדיקה (HepG2, HUH7 ותאי קרצינומה הפטוצלולרית JHH4) לצלחת בת 96 בארות בצפיפות זריעה של 10,000 תאים לבאר בנפח זריעה סופי של 200 מיקרוליטר לבאר.
    1. לפני תרבית תאי HepG2, צפו את 96 בארות הצלחת בקולגן מסוג IV (50 מיקרוגרם/מ"ל) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר (RT). כדי למנוע התמצקות של הקולגן המלאי, הניחו את תמיסת הציר בקרח ולאחר מכן, התחילו בתהליך הדילול לריכוז הרצוי.
    2. לאחר תקופת דגירה של שעתיים, שאפו את עודפי הקולגן ושטפו את הבארות שלוש פעמים עם PBS 1x.
  2. טפחו את התאים במדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) למשך הלילה בריכוז של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 באינקובטור לח.
  3. למחרת, או עם ההגעה למפגש של 80%-90%, המוקדם מביניהם, טפלו בתאים עם H2O2 (לא מטופל, 250 מיקרומטר, 500 מיקרומטר, 750 מיקרומטר ו-1000 מיקרומטר) ומנדיון (לא מטופל, 25 מיקרומטר, 50 מיקרומטר, 75 מיקרומטר, 100 מיקרומטר), בהתאמה למשך 30 דקות כדי לגרום לעקה החמצונית המייצגת.
  4. לחלופין, בחרו לבדוק את התאים עם חומר הבדיקה הרצוי המסוגל לגרום לעקה חמצונית בתוך התאים.

2. הכנת מלאי ותמיסה מדוללת לצביעת DHE של תאים

  1. הכינו תמיסת מלאי DHE (5 מ"ג/מ"ל או 15.9 מ"ל) על ידי המסת 5 מ"ג DHE ב-1 מ"ל DMSO.
  2. יש לדלל את תמיסת מלאי ה-DHE במים אוטוקלאביים מזוקקים פעמיים עד לריכוז הסופי של 100 מיקרומטר.
  3. כדי למנוע את תהליך ההקפאה וההפשרה של הצבע (שעלול לפגוע בתכונות הפלואורסצנטיות לאורך זמן), הכינו מספר אליציטוטים בצינורות צנטריפוגה של 1.5 מ"ל בריכוז של 100 מיקרומטר ואחסנו אותם בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  4. כדי להשיג ריכוז עבודה סופי של 10 מיקרומטר, השתמש באליציטוט של ריכוז DHE של 100 מיקרומטר ודלל אותו עם מדיה DMEM שחוממה מראש.
    הערה: יש להכין את פתרון העבודה טרי ביום הניסוי.
  5. מערבולת את תמיסת הצבע הפלואורסצנטי העובדת למשך 5-10 שניות כדי להבטיח ערבוב נכון של הצבע.

3. תהליך צביעת DHE

  1. הסר את המדיה המכילה תרופות או חומרי בדיקה מכל באר ושטוף אותה בעדינות פעם אחת עם PBS או DMEM 1x.
    הערה: בעת ביצוע שלבי ההוספה או השטיפה בניסוי, חשוב להימנע ממגע ישיר בין התאים לבין הפיפטר. ניתן להשיג זאת על ידי פיפטציה עדינה של PBS לאורך צידי הבארות כדי למזער כל נזק מכני פוטנציאלי לתאים. הקפדה על כך שהפיפטור לא ייגע ישירות בתאים תסייע לשמור על שלמות התא ועל יכולת הקיום שלו למשך הניסוי.
  2. הוסף 100 μL של מדיה DMEM המכיל 10 μM DHE (פתרון עבודה) לתוך כל באר לדגור ב 37 ° C במשך 30 דקות.
  3. לאחר תקופת דגירה של 30 דקות, הסירו את המדיה המכילה DHE ושטפו כל באר בעדינות שלוש פעמים עם מלח חוצץ פוספט 1x (PBS). זה יכול להתבצע עם pipettor רב ערוצי כדי להבטיח תפנית מהירה.
  4. הוסף 200 μL של 1x PBS לכל באר עם צבע צביעה גרעיני Hoechst 33342 למשך 10 דקות ב- RT.
  5. הסר את תמיסת הצביעה הגרעינית Hoechst 33342 מהבאר והוסף 200 μL של 1x PBS לכל באר.
    הערה: כדי להשיג תאים קבועים, פעל לפי אותו פרוטוקול כמו עבור התאים החיים, עם שלב אחד נוסף של הוספת 4% PFA למשך 5 דקות לאחר הטיפול וצביעת DHE. הסר את תמיסת ה- PFA ושטוף תאים עם PBS 1x. לאחר מכן, לדגור את התאים עם צבע מכתים גרעיני במשך 10 דקות.
  6. העבר את הצלחת לפלטפורמת סינון התוכן הגבוה, למיקרוסקופ פלואורסצנטי או לקורא לוחות לרכישת תמונה במהירות האפשרית.

4. רכישת תמונה ומדידת עוצמה

  1. טעינת צלחת
    1. פתח את תוכנת Cellomics CX7 High-Content Screening (HCS) לרכישת נתונים.
    2. כייל בקפידה את פלטפורמת ההדמיה בהתאם למפרטי היצרן מראש עם לוח 96 בארות ספציפי לבחירה לשימוש כדי למנוע תמונות מעורפלות או מטושטשות בנתונים.
      הערה: לוחות מרובי בארות מספקים שונים עשויים להיות בעלי תכונות חומר שונות ויכולים להשפיע על איכות התמונות הסופיות המתקבלות.
    3. לאחר הכיול, שמור את פרמטרי המערכת הספציפיים למותג הצלחת במסד הנתונים של המכשירים והשתמש בהם שוב לרכישות נתונים עתידיות.
    4. מניחים בזהירות את הצלחת עם הדגימות המוכנות על השלב המחומם של מערכת ההדמיה HCS. ודא שהלוח ממוקם היטב ובכיוון הנכון להדמיה על מחזיק המיקרו-לוחית (כלומר, אתר את התווית המסומנת A1 על במת הקורא, ולאחר מכן סובב את לוח המיקרו כך שהמיקום של באר A1 יתאים לפינה עם המדבקה).
    5. לחץ בעדינות כלפי מטה על לוח המיקרו כדי להבטיח שהוא מונח שטוח על הבמה. פילוס לא אחיד של הצלחת במערכת HCS יכול להוביל לשגיאות ברכישת תמונה.
    6. לאחר שהלוחית נמצאת במקומה, לחץ והחזק את מקש Ctrl ולאחר מכן לחץ על Ctrl-OK בתיבת הדו-שיח טעינה/ביטול טעינה של צלחת בתוכנה.
  2. בחירת פרמטרי הדמיה
    1. במערכת ההדמיה HCS, פתח את מצב הפעלת המטרה בממשק היישומים הביולוגיים של Cellomics וצור פרוטוקול חדש באמצעות פרוטוקול ההתקנה הדו-ערוצי התואם ל- (א) צביעה גרעינית ו- (ב) איסוף נתוני בדיקה פלואורסצנטית DHE. בפרוטוקול הנוכחי, המסננים 386_BGSRS_BGSRS, 480_BGS_RS ו-386_BGS_RS שימשו עבור (א) צביעה גרעינית Hoechst 33342, (ב) ייצור ROS כולל ו-(ג) גילוי רדיקלים סופראוקסידים, בהתאמה. הבחירה במסננים אלה נבעה מהחפיפה הספציפית לתכונות הפליטה של כל צבע (DAPI ו-DHE) המשמשות כחלק מפרוטוקול זה.
      הערה: מוסכמת מתן השמות של מסננים, למשל, 386-23_BGRFRN_BGRFRN, מתייחסת לעירור של הדגימה עם אור 386 ננומטר עם רוחב פס של 23 ננומטר, ואחריו מסנן דיכרואי שמעביר כחול (B), ירוק (G), אדום (R), אדום רחוק (FR) ואור אינפרא אדום קרוב (N) בטווחי אורכי גל ספציפיים וה 386_BGS_RS מתייחס למסנן פליטה שמעביר אור באורכי גל של פליטת BGS ו-RS אחרי הדיכרואיק.
    2. ציין את המטרות לתהליך רכישת התמונה בממשק פרוטוקול התוכנה, כגון הגדלה של 10x או 20x, לפי הצורך.
    3. בחר את ההגדלה האובייקטיבית המתאימה בהתאם לרמת פרטי ההדמיה הרצויה והרזולוציות הדרושות לניסוי. עם זאת, הרזולוציה של כל מטרה קבועה. פירוט ברזולוציה גבוהה יותר יחייב שינוי המטרה בפלטפורמה. בפרוטוקול הנוכחי נעשה שימוש במטרה של 20x, 0.45 NA, שהיא חלק מפלטפורמת סינון התוכן הגבוה המשמשת בפרוטוקול זה.
      הערה: המטרה של 20x מייצגת פשרה טובה בין פירוט רזולוציית ההדמיה לבין מהירות הרכישה הדרושה ללכידת שינויי ROS לאורך זמן. ניתן לבחור יעדי הגדלה גבוהים יותר (למשל, פי 40), עם זאת, הדבר יוביל לזמני רכישה ארוכים יותר.
    4. ציין את הגדרות החשיפה של מצלמת רכישת התמונה, כגון זמן החשיפה, שילוב המצלמה ומרווח מחסנית z, בהתאם לדרישות הספציפיות של הפרוטוקול.
      הערה: זמן החשיפה (לעתים קרובות באלפיות השנייה) משתנה בהתאם לעוצמת האות ולרגישות של הפלואורופורים הספציפיים שבהם נעשה שימוש. זה עשוי גם להיות שונה מעט מניסוי לניסוי בהתבסס על ריכוז הצבע ואיכות הצביעה. בפרוטוקול הנוכחי, הפרמטרים של הרכישה קבועים כדלקמן - יעד % - 35%, מצב רכישת תמונה - 1104 x 1104 (עם 2x2 binning), ויעד 20x, 0.45 NA. פרמטרים אלה עשויים להיקבע בהתאם לתנאי הניסוי הספציפיים.
  3. פרמטרים של תצורת הדמיה
    הערה: לאחר הגדרת פרמטרי ההדמיה, ניתן להתחיל בתהליך איסוף התמונות באמצעות ממשק התוכנה.
    1. פרמטרים של אוסף תמונות
      1. זהה את אובייקט המעקב העיקרי המעניין (גרעין התאים) באמצעות אלגוריתמים שונים הזמינים במכשיר (אופטיקה - איזודאטה, קבוע ומשולש).
        הערה: שיטת isodata לזיהוי וסימון של האובייקט הראשי משמשת בפרוטוקול זה.
      2. פלח את האובייקט (אם קיים) לפי צורה או פרמטר עוצמה.
      3. אמת את האובייקט הראשי בהתבסס על פרמטרי הגודל, הצורה והעוצמה הרצויים הייחודיים לכל סוג תא.
      4. לאחר מכן, הגדר את 'אזור העניין' (ROI) סביב אובייקט ראשי זה.
        הערה: החזר ההשקעה הוא פרמטר מרכזי של איסוף נתונים המגדיר את המיקום שבו עוצמת הצבע הפלואורסצנטי מזוהה כעקבית וניתנת לחזרה על פני סוגי תאים. החזר ההשקעה מגדיר את הפרמטרים העיקריים (כגון עוצמת הצבע), הנמדדים עבור כל אובייקט מעקב ראשוני (כלומר, תא) בערוצים שונים של המכשיר. החזר ההשקעה יכול להיות מוגדר בצורה של מעגל או טבעת סביב הגרעין של כל תא. תוכנת HCS מקבלת באופן אוטומטי את עוצמת סמן הצבע הפלואורסצנטי DHE בערוץ 2 בגבול החזר ההשקעה עבור כל תא שמקוטע ומנותח באופן אוטומטי.
      5. הגדר מעגל של 20 מיקרומטר סביב האובייקט העיקרי (גרעין). המרחק של 20 מיקרומטר נבחר במחקר זה בהתבסס על הגדלים המשוערים של קווי התאים השונים המשמשים בפרוטוקול זה (HepG2, JHH-4 ו-HUH-7). החזר ההשקעה על טבעת 20 מיקרומטר סביב התאים השיג את עוצמת הפלואורסצנטיות באופן עקבי וניתן לחזור עליו.
        הערה הפרמטר המרכזי בבחירת החזר השקעה הוא היכולת לכסות כראוי את שטח התא; גודל החזר ההשקעה המעגלי תלוי בגודל התא. תאים גדולים יותר עשויים לדרוש החזר השקעה גדול יותר ולהיפך עבור החזר השקעה קטן יותר. פרמטרים אלה חייבים להיקבע מראש עבור כל סוג תא וצבע פלואורסצנטי מעניין.
  4. אפיון אוכלוסייה ובחירת תכונות לאחסון
    1. לאחר הגדרת פרמטרי הרכישה השונים בפרוטוקול הדמיה HCS, הגדר את מערכת HCS למצב רכישת נתונים.
    2. פרמטרי רכישת התמונה עבור פרוטוקול זה נקבעו כדלקמן: מגבלת סריקה של 1000 תאים / באר, עם דרישה מינימלית של 10 אובייקטים (תאים) לכל שדה.
      הערה: מספר השדות שהוערך עבור כל באר נקבע בהתבסס על ספירת התאים הסופית שהגיעה למספר 1000. מערכת HCS ממשיכה לחפש במקומות שונים בתוך הבאר עד שהיא משיגה את אוכלוסיית היעד של 1000 תאים/באר. מהירות הרכישה תלויה אפוא במפגש ובמספרי התאים הכוללים הקיימים בכל באר של לוח 96 הקידוחים. בפרוטוקול הנוכחי, העוצמה הכוללת והממוצעת של ערוץ 2 (המייצגת את רדיקלי הסופראוקסיד ואת סך ייצור ה-ROS) נאספו מכל באר לצורך ניתוחים נוספים במורד הזרם.
  5. לכידה, עיבוד וניתוח של תמונות
    1. לאחר התאמה וסיום של פרמטרי רכישת התמונה, התחל את תהליך הסריקה עבור כל לוח בן 96 בארות.
      הערה: מערכת ההדמיה Cellomics CX7 מאפשרת סינון תוכן גבוה וניתוח אוטומטי של דגימות במגוון פרמטרים, כולל ייצור ROS בתוך תאים באופן בתפוקה גבוהה. בנוסף לייצור ROS, מערכת HCS מסוגלת לספק מידע רב ערך נוסף על פרמטרים שונים כגון מורפולוגיה של התא, לוקליזציה תת-תאית ותכונות תאיות רבות אחרות המעניינות. לאחר אופטימיזציה לרכישה, פלטפורמת ההדמיה HCS מאפשרת אפיון מקיף, איכותי וכמותי של פרמטרים התא בצורה חזקה.
    2. לאחר השלמת תהליך הסריקה, הפעל את תוכנת View Analysis וייצא את פרמטרי הנתונים הכמותיים השונים בפורמט .csv לניתוח נוסף.
    3. באמצעות תוכנת צד שלישי, העתק והדבק את הערכים הכמותיים השונים המעניינים לצורך ניתוחים נוספים במורד הזרם.
      הערה: בפרוטוקול הנוכחי, תוכנת GraphPad Prism שימשה לניתוח ערכי עוצמת DHE בתגובה לעקה חמצונית מושרית עקב חשיפות H2O2 ומנאדיון.
  6. ניתוח נתונים וסטטיסטיקה
    1. חשב את העוצמה הממוצעת של ערוץ 2 (המייצג את ערכי ROS הכוללים ורדיקלים סופראוקסידים).
      הערה: כל הניסויים לחישוב ערכי העוצמה חזרו על עצמם שלוש פעמים עם 6 עותקים משוכפלים לכל מצב בכל רמת מינון.
    2. בצע בדיקת ANOVA או t חד-כיוונית כדי למדוד את ההבדלים בערכי העוצמה בין תנאי הבדיקה השונים.

תוצאות

Dihydroethidium (DHE) הוא צבע פלואורסצנטי מגיב סופראוקסיד המספק מידע ספציפי לגבי מצבי ROS תוך תאיים. צבע DHE פולט באופן מהותי פלואורסצנטיות כחולה בציטופלסמה. אולם באינטראקציה עם רדיקלים סופראוקסידים, הוא הופך ל-2-הידרוקסיאתידיום, אשר פולט פלואורסצנטיות באורכי גל אדומים (>550 ננומטר) (איור 1

Discussion

במחקר זה, פרוטוקול להערכת ייצור מיני חמצן תגובתי תוך-תאי (ROS) המונע על-ידי סופראוקסיד באמצעות צבע פלואורסצנטי דיהידרואתידיום (DHE) נקבע על מערכת סינון בעלת תוכן גבוה. רוב הפרוטוקולים הנוכחיים הזמינים בספרות משתמשים ב- DCFH-DA כבדיקת הדמיה פלואורסצנטית לכימות מיני ROS. עם זאת, מחקרים רבים הראו כי DC...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

RK ו-RRG נתמכו על ידי מענק ממרכז UNM למתכות בביולוגיה ורפואה (CMBM) באמצעות מענק NIH NIGMS P20 GM130422. RRG נתמכה על ידי פרס פיילוט ממענק NM-INSPIRES P30 1P30ES032755. תמיכת ליבת ההדמיה במכשיר CX7 Cellomics סופקה באמצעות ליבות מרכז AIM שמומנו על ידי P20GM121176 המענקים של NIH. ברצוננו להודות לד"ר שרינה דסאי ולד"ר לי צ'ן על עזרתם רבת הערך בנושאים טכניים הקשורים לשימוש בפלטפורמת ההדמיה CX7 Cellomics.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL centrifuge tubes VWR 20170-038 
96- well plate Corning Costar 07-200-90 
Cellomics Cx7ThermoFisher HCSDCX7LEDPRO
Collagen Advanced Biomatrix  5056 
DHE (Dihydroethidium) ThermoFisher D1168 
DMEM Sigma  6046 
FBS VWR 97068-085 
GraphPad PrismGraphPadVersion 6.0
HepG2 cell lineATCC
Hoechst ThermoFisher 33342 
HUH7 cell lineATCC
Hydrogen Peroxide Sigma 88597 
JHH4 cell lineATCC
Menadione Sigma M5625 

References

  1. Juan, C. A., et al. The chemistry of reactive oxygen species (ros) revisited: Outlining their role in biological macromolecules (DNA, Lipids and Proteins) and induced pathologies. Int J Mol Sci. 22 (9), 4642 (2021).
  2. Magnani, F., et al. Structure and mechanisms of ROS generation by NADPH oxidases. Curr Opin Struct Biol. 59, 91-97 (2019).
  3. Collin, F. Chemical basis of reactive oxygen species reactivity and involvement in neurodegenerative diseases. Int J Mol Sci. 20 (10), 2407 (2019).
  4. Uttara, B., et al. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Curr Neuropharmacol. 7 (1), 65-74 (2009).
  5. Dikalov, S. I., et al. Electron paramagnetic resonance measurements of reactive oxygen species by cyclic hydroxylamine spin probes. Antioxid Redox Signal. 28 (15), 1433-1443 (2018).
  6. Wang, Q., et al. Measurement of reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial ROS in AMPK knockout mice blood vessels. Methods Mol Biol. 1732, 507-517 (2018).
  7. Griendling, K. K., et al. Measurement of reactive oxygen species, reactive nitrogen species, and redox-dependent signaling in the cardiovascular system: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 119 (5), e39-e75 (2016).
  8. Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radic Biol Med. 52 (1), 1-6 (2012).
  9. Gomes, A., et al. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
  10. Halliwell, B., et al. . Free radicals in biology and medicine. , (2015).
  11. Cho, S., et al. Fluorescence-based detection and quantification of features of cellular senescence. Methods Cell Biol. 103, 149-188 (2011).
  12. Dikalov, S. I., et al. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxid Redox Signal. 20 (2), 372-382 (2014).
  13. Kalyanaraman, B., et al. Recent developments in detection of superoxide radical anion and hydrogen peroxide: Opportunities, challenges, and implications in redox signaling. Arch Biochem Biophys. 617, 38-47 (2017).
  14. Robinson, K. M., et al. Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (41), 15038-15043 (2006).
  15. Zielonka, J., et al. Detection of 2-hydroxyethidium in cellular systems: a unique marker product of superoxide and hydroethidine. Nat Protoc. 3 (1), 8-21 (2008).
  16. Nazarewicz, R. R., et al. Rapid and specific measurements of superoxide using fluorescence spectroscopy. J Biomol Screen. 18 (4), 498-503 (2013).
  17. Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nat Metab. 4 (6), 651-662 (2022).
  18. Ameziane-El-Hassani, R., et al. Detection of reactive oxygen species in cells undergoing oncogene-induced senescence. Oncogene-Induced Senescence: Methods Protoc. 1534, 139-145 (2017).
  19. Abraham, , et al. High content screening applied to large-scale cell biology. Trends Biotechnol. 22 (1), 15-22 (2004).
  20. Criddle, D. N., et al. Menadione-induced reactive oxygen species generation via redox cycling promotes apoptosis of murine pancreatic acinar cells. J Biol Chem. 281 (52), 40485-40492 (2006).
  21. Goffart, S., et al. The type and source of reactive oxygen species influences the outcome of oxidative stress in cultured cells. Cells. 10 (5), 1075 (2021).
  22. Kurutas, E. B. The importance of antioxidants which play the role in cellular response against oxidative/nitrosative stress: current state. Nutr J. 15 (1), 71 (2015).
  23. Shad, K. F., Das, T. K. Introductory Chapter: Role of Fenton and Haber-Weiss Reaction in Epilepsy. Epilepsy-Seizures without Triggers. IntechOpen. , (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved