Hochdurchsatz-Screening-Bewertung der Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) mit Dihydroethidium (DHE)-Fluoreszenzfarbstoff

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Methode zur Quantifizierung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) unter Verwendung von Dihydroethidium (DHE) als Fluoreszenzfarbstoffsonde unter Verwendung eines Hochdurchsatz-Screening-Ansatzes. Das Protokoll beschreibt die Methoden zur quantitativen Beurteilung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in den drei verschiedenen hepatozellulären Karzinomzelllinien.

Zusammenfassung

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) spielen eine Schlüsselrolle bei der Regulation des Zellstoffwechsels bei physiologischen und pathologischen Prozessen. Die physiologische ROS-Produktion spielt eine zentrale Rolle bei der räumlichen und zeitlichen Modulation normaler zellulärer Funktionen wie Proliferation, Signalübertragung, Apoptose und Seneszenz. Im Gegensatz dazu ist eine chronische ROS-Überproduktion für ein breites Spektrum von Krankheiten verantwortlich, wie unter anderem Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Diabetes. Die genaue und reproduzierbare Quantifizierung des ROS-Spiegels ist daher für das Verständnis der normalen zellulären Funktionalität unerlässlich. Fluoreszenzbildgebungsbasierte Methoden zur Charakterisierung intrazellulärer ROS-Spezies sind ein gängiger Ansatz. Viele der bildgebenden ROS-Protokolle in der Literatur verwenden 2'-7'-Dichlordihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA)-Farbstoff. Dieser Farbstoff leidet jedoch unter erheblichen Einschränkungen in seiner Verwendung und Interpretierbarkeit. Das aktuelle Protokoll demonstriert die Verwendung einer Dihydroethidium (DHE)-Fluoreszenzsonde als alternative Methode zur Quantifizierung der gesamten ROS-Produktion in einer Hochdurchsatzumgebung. Die Hochdurchsatz-Bildgebungsplattform CX7 Cellomics wurde verwendet, um die ROS-Produktion zu messen und zu quantifizieren. Diese Studie wurde an drei hepatozellulären Krebszelllinien durchgeführt - HepG2, JHH4 und HUH-7. Dieses Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung der verschiedenen Verfahren, die an der Bewertung von ROS in den Zellen beteiligt sind, einschließlich - Herstellung der DHE-Lösung, Inkubation der Zellen mit DHE-Lösung und Messung der DHE-Intensität, die zur Charakterisierung der ROS-Produktion erforderlich ist. Dieses Protokoll zeigt, dass DHE-Fluoreszenzfarbstoff eine robuste und reproduzierbare Wahl ist, um die intrazelluläre ROS-Produktion im Hochdurchsatz zu charakterisieren. Hochdurchsatzansätze zur Messung der ROS-Produktion sind wahrscheinlich in einer Vielzahl von Studien hilfreich, z. B. in der Toxikologie, beim Wirkstoffscreening und in der Krebsbiologie.

Einleitung

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind eine Gruppe natürlich vorkommender, hochreaktiver und zeitlich instabiler chemischer Radikale, die als Teil des normalen Zellstoffwechsels in Zellen gebildet werden. ROS spielt eine wichtige und wesentliche Rolle bei der Modulation normaler physiologischer und biochemischer Prozesse, die in Zellen ablaufen ^1,2. Die Hauptquelle der ROS-Produktion in Zellen ist der mitochondriale Elektronentransportkettenweg (ETC) als Teil des normalen bioenergetischen Zyklus. Zu den bedeutenden zusätzlichen Quellen der ROS-Produktion gehören enzymatische Reaktionen wie zelluläre NADPH-Oxida....

Protokoll

1. Zellkultur

1. Aussaat der Testzellen (hepatozelluläre HepG2-, HUH7- und JHH4-Karzinomzellen) in eine 96-Well-Platte mit einer Aussaatdichte von 10.000 Zellen/Well in einem endgültigen Aussaatvolumen von 200 μl pro Well.
   1. Vor der Kultivierung der HepG2-Zellen beschichten Sie die 96 Plattenvertiefungen 2 Stunden lang bei Raumtemperatur (RT) mit Kollagen Typ IV (50 μg/ml). Um eine Verfestigung des Stammkollagens zu vermeiden, geben Sie die Stammlösung in Eis und leiten Sie anschließend den Verdünnungsprozess auf die gewünschte Konzentration ein.
   2. Nach einer 2-stündigen Inkubationszeit das überschüssige Kollagen absaugen und die ....

Diskussion

In dieser Studie wurde ein Protokoll zur Bewertung der superoxidgesteuerten intrazellulären Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) unter Verwendung von Dihydroethidium (DHE)-Fluoreszenzfarbstoff auf einem High-Content-Screening-System erstellt. Ein Großteil der derzeit in der Literatur verfügbaren Protokolle verwendet die DCFH-DA als Fluoreszenz-Bildgebungssonde zur Quantifizierung von ROS-Spezies. Mehrere Studien haben jedoch gezeigt, dass die DCFH-DA keine ideale Sonde für die Messung intrazellulärer ROS.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tubes	VWR	20170-038
96- well plate	Corning Costar	07-200-90
Cellomics Cx7	ThermoFisher	HCSDCX7LEDPRO
Collagen	Advanced Biomatrix	5056
DHE (Dihydroethidium)	ThermoFisher	D1168
DMEM	Sigma	6046
FBS	VWR	97068-085
GraphPad Prism	GraphPad	Version 6.0
HepG2 cell line	ATCC
Hoechst	ThermoFisher	33342
HUH7 cell line	ATCC
Hydrogen Peroxide	Sigma	88597
JHH4 cell line	ATCC
Menadione	Sigma	M5625