A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة جديدة لتحديد أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا (ROS) باستخدام ثنائي هيدرويثيديوم (DHE) كمسبار صبغة مضان باستخدام نهج فحص عالي الإنتاجية. يصف البروتوكول طرق التقييم الكمي لأنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا (ROS) في خطوط خلايا سرطان الخلايا الكبدية الثلاثة المختلفة.

Abstract

تلعب أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) دورا رئيسيا في تنظيم التمثيل الغذائي الخلوي في العمليات الفسيولوجية والمرضية. يلعب إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية الفسيولوجية دورا مركزيا في التعديل المكاني والزماني للوظائف الخلوية الطبيعية مثل الانتشار والإشارات وموت الخلايا المبرمج والشيخوخة. في المقابل ، فإن الإفراط في إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية المزمن مسؤول عن مجموعة واسعة من الأمراض ، مثل السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية والسكري وغيرها. وبالتالي فإن قياس مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية بطريقة دقيقة وقابلة للتكرار أمر ضروري لفهم الوظائف الخلوية الطبيعية. تعد الطرق القائمة على التصوير الفلوري لتوصيف أنواع أنواع أنواع ROS داخل الخلايا نهجا شائعا. تستخدم العديد من بروتوكولات ROS التصويرية في الأدبيات صبغة 2'-7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). ومع ذلك ، فإن هذه الصبغة تعاني من قيود كبيرة في استخدامها وتفسيرها. يوضح البروتوكول الحالي استخدام مسبار الفلورسنت ثنائي هيدروإيثيديوم (DHE) كطريقة بديلة لتحديد إجمالي إنتاج ROS في بيئة عالية الإنتاجية. تم استخدام منصة التصوير عالية الإنتاجية ، CX7 Cellomics ، لقياس وقياس إنتاج ROS. أجريت هذه الدراسة في ثلاثة خطوط خلايا سرطانية كبدية - HepG2 و JHH4 و HUH-7. يوفر هذا البروتوكول وصفا متعمقا للإجراءات المختلفة التي ينطوي عليها تقييم أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا ، بما في ذلك - تحضير محلول DHE ، وحضانة الخلايا بمحلول DHE ، وقياس شدة DHE اللازمة لتوصيف إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). يوضح هذا البروتوكول أن صبغة الفلورسنت DHE هي خيار قوي وقابل للتكرار لتوصيف إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا بطريقة عالية الإنتاجية. من المرجح أن تكون الأساليب عالية الإنتاجية لقياس إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية مفيدة في مجموعة متنوعة من الدراسات ، مثل علم السموم وفحص الأدوية وبيولوجيا السرطان.

Introduction

أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) هي مجموعة من الجذور الكيميائية التي تحدث بشكل طبيعي ، شديدة التفاعل ، وغير مستقرة زمنيا والتي تشكلت كجزء من التمثيل الغذائي الخلوي الطبيعي في الخلايا. تلعب أنواع الأكسجين التفاعلية دورا رئيسيا وأساسيا في تعديل العمليات الفسيولوجية والكيميائية الحيوية الطبيعية التي تحدث في الخلايا 1,2. المصدر الرئيسي لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في الخلايا هو من مسار سلسلة نقل إلكترون الميتوكوندريا (ETC) كجزء من دورة الطاقة الحيوية العادية. تشمل المصادر الإضافية المهمة لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية التفاعلات الأنزيمية مثل أوكسيديز NADPH الخلوي في الخلايا. يحدث استقلاب جزيئات الطعام (مثل الجلو....

Protocol

1. ثقافة الخلية

  1. قم بزرع خلايا الاختبار (خلايا سرطان الخلايا الكبدية HepG2 و HUH7 و JHH4) في صفيحة 96 بئرا بكثافة بذر تبلغ 10000 خلية / بئر في حجم بذر نهائي يبلغ 200 ميكرولتر لكل بئر.
    1. قبل زراعة خلايا HepG2 ، قم بتغطية 96 بئرا بالكولاجين من النوع الرابع (50 ميكروغرام / مل) لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة (RT). لتجنب تصلب الكولاجين ، ضع محلول المخزون في الثلج وبعد ذلك ، ابدأ عملية التخفيف إلى التركيز المطلوب.
    2. بعد فترة حضانة 2 ساعة ، استنشق الكولاجين الزائد واغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام 1x PBS.
  2. قم بزراعة الخلايا في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco طوال الليل عند 37 درجة مئويةوتركيز CO 2 بن....

النتائج

ثنائي هيدرويثيديوم (DHE) عبارة عن صبغة مضان فائقة الاستجابة للأكسيد توفر معلومات محددة فيما يتعلق بحالات أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا. دتنبعث صبغة ال HEE جوهريا من مضان أزرق في السيتوبلازم. ومع ذلك ، عند التفاعل مع جذور الأكسيد الفائق ، يتم تحويله إلى 2-هيدروكسي إيثيديوم ، والذي ينبع.......

Discussion

في هذه الدراسة ، تم إنشاء بروتوكول لتقييم إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا (ROS) التي يحركها الأكسيد الفائق باستخدام صبغة مضان ثنائي هيدرويثيديوم (DHE) على نظام فحص عالي المحتوى. تستخدم غالبية البروتوكولات الحالية المتاحة في الأدبيات DCFH-DA كمسبار تصوير مضان لتحديد أنواع ROS. ومع ذلك .......

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.

Acknowledgements

تم دعم RK و RRG بمنحة من مركز UNM للمعادن في علم الأحياء والطب (CMBM) من خلال منحة NIH NIGMS P20 GM130422. تم دعم RRG بجائزة تجريبية من منحة NM-INSPIRES P30 1P30ES032755. تم توفير الدعم الأساسي للتصوير لأداة CX7 Cellomics من خلال نوى مركز AIM بتمويل من منحة المعاهد الوطنية للصحة P20GM121176. نود أن نشكر الدكتورة شارينا ديساي والدكتور لي تشن على مساعدتهما القيمة في القضايا الفنية المتعلقة باستخدام منصة التصوير CX7 Cellomics.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL centrifuge tubes VWR 20170-038 
96- well plate Corning Costar 07-200-90 
Cellomics Cx7ThermoFisher HCSDCX7LEDPRO
Collagen Advanced Biomatrix  5056 
DHE (Dihydroethidium) ThermoFisher D1168 
DMEM Sigma  6046 
FBS VWR 97068-085 
GraphPad PrismGraphPadVersion 6.0
HepG2 cell lineATCC
Hoechst ThermoFisher 33342 
HUH7 cell lineATCC
Hydrogen Peroxide Sigma 88597 
JHH4 cell lineATCC
Menadione Sigma M5625 

References

  1. Juan, C. A., et al. The chemistry of reactive oxygen species (ros) revisited: Outlining their role in biological macromolecules (DNA, Lipids and Proteins) and induced pathologies. Int J Mol Sci. 22 (9), 4642 (2021).
  2. Magnani, F., et al.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved