JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة جديدة لتحديد أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا (ROS) باستخدام ثنائي هيدرويثيديوم (DHE) كمسبار صبغة مضان باستخدام نهج فحص عالي الإنتاجية. يصف البروتوكول طرق التقييم الكمي لأنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا (ROS) في خطوط خلايا سرطان الخلايا الكبدية الثلاثة المختلفة.

Abstract

تلعب أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) دورا رئيسيا في تنظيم التمثيل الغذائي الخلوي في العمليات الفسيولوجية والمرضية. يلعب إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية الفسيولوجية دورا مركزيا في التعديل المكاني والزماني للوظائف الخلوية الطبيعية مثل الانتشار والإشارات وموت الخلايا المبرمج والشيخوخة. في المقابل ، فإن الإفراط في إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية المزمن مسؤول عن مجموعة واسعة من الأمراض ، مثل السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية والسكري وغيرها. وبالتالي فإن قياس مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية بطريقة دقيقة وقابلة للتكرار أمر ضروري لفهم الوظائف الخلوية الطبيعية. تعد الطرق القائمة على التصوير الفلوري لتوصيف أنواع أنواع أنواع ROS داخل الخلايا نهجا شائعا. تستخدم العديد من بروتوكولات ROS التصويرية في الأدبيات صبغة 2'-7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). ومع ذلك ، فإن هذه الصبغة تعاني من قيود كبيرة في استخدامها وتفسيرها. يوضح البروتوكول الحالي استخدام مسبار الفلورسنت ثنائي هيدروإيثيديوم (DHE) كطريقة بديلة لتحديد إجمالي إنتاج ROS في بيئة عالية الإنتاجية. تم استخدام منصة التصوير عالية الإنتاجية ، CX7 Cellomics ، لقياس وقياس إنتاج ROS. أجريت هذه الدراسة في ثلاثة خطوط خلايا سرطانية كبدية - HepG2 و JHH4 و HUH-7. يوفر هذا البروتوكول وصفا متعمقا للإجراءات المختلفة التي ينطوي عليها تقييم أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا ، بما في ذلك - تحضير محلول DHE ، وحضانة الخلايا بمحلول DHE ، وقياس شدة DHE اللازمة لتوصيف إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). يوضح هذا البروتوكول أن صبغة الفلورسنت DHE هي خيار قوي وقابل للتكرار لتوصيف إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا بطريقة عالية الإنتاجية. من المرجح أن تكون الأساليب عالية الإنتاجية لقياس إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية مفيدة في مجموعة متنوعة من الدراسات ، مثل علم السموم وفحص الأدوية وبيولوجيا السرطان.

Introduction

أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) هي مجموعة من الجذور الكيميائية التي تحدث بشكل طبيعي ، شديدة التفاعل ، وغير مستقرة زمنيا والتي تشكلت كجزء من التمثيل الغذائي الخلوي الطبيعي في الخلايا. تلعب أنواع الأكسجين التفاعلية دورا رئيسيا وأساسيا في تعديل العمليات الفسيولوجية والكيميائية الحيوية الطبيعية التي تحدث في الخلايا 1,2. المصدر الرئيسي لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في الخلايا هو من مسار سلسلة نقل إلكترون الميتوكوندريا (ETC) كجزء من دورة الطاقة الحيوية العادية. تشمل المصادر الإضافية المهمة لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية التفاعلات الأنزيمية مثل أوكسيديز NADPH الخلوي في الخلايا. يحدث استقلاب جزيئات الطعام (مثل الجلوكوز) عبر مسار الفسفرة التأكسدية في مصفوفة الميتوكوندريا. يعد المستوى الأساسي لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية ضروريا لتنظيم عمليات إشارات الخلايا الفسيولوجية الطبيعية. من المعروف أن العديد من جزيئات البروتين الرئيسية التي تشكل جزءا من مسارات إشارات التمثيل الغذائي للجلوكوز (على سبيل المثال ، Akt و PTEN) تستجيب لمستويات ROS داخل الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، يتم إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية بواسطة العديد من الإنزيمات داخل الخلايا مثل أوكسيديز الزانثين ، سينسيز أكسيد النيتريك ، ومكونات البيروكسيسومال كجزء من المسارات الأنزيمية الخلوية 1,2. على النقيض من المصادر الطبيعية لأنواع الأكسجين التفاعلية ، فإن بعض العوامل البيئية ، مثل xenobiotics ، والعوامل المعدية ، والأشعة فوق البنفسجية ، والتلوث ، وتدخين السجائر ، والإشعاع ، تؤدي أيضا إلى الإفراط في إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية ، والتي تعد محركا رئيسيا للإجهاد التأكسدي داخل الخلايا 1,3. يمكن أن يتسبب الإجهاد التأكسدي الخلوي المرتفع في تلف الجزيئات الحيوية الأصلية داخل الخلية ، مثل الدهون والبروتينات والحمض النووي ، مما يسبب أمراضا مختلفة مثل السرطان والسكري وأمراض القلب والأوعية الدموية والالتهابات المزمنة والاضطرابات التنكسية العصبية1،3،4. لذلك ، تعد القياسات الدقيقة لأنواع الأكسجين التفاعلية ضرورية لفهم الآليات الخلوية المشاركة في الفيزيولوجيا المرضية للأمراض الناجمة عن الإجهاد التأكسدي.

نظرا للجداول الزمنية القصيرة لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية والقضاء عليها داخل الخلايا ، تظل القياسات الكمية لمختلف جذور أنواع الأكسجين التفاعلية تمثل تحديا. تستخدم طرق مثل الرنين المغنطيسي الإلكتروني (EPR) 5 ، والكروماتوغرافيا السائلة عالية الضغط (HPLC) ، والتصوير القائم على مسبار التألق لقياس مختلف أنواع ROS6 الخلوية. في حين أن طرقا مثل EPR و HPLC تسفر عن تقديرات دقيقة كميا ، فإن هذه الطرق تنطوي على تدمير التشكل المكاني الخلوي وعادة ما تكون في شكل قياسات عالمية ومجمعة للعينة. في المقابل ، تحتفظ الطرق القائمة على التصوير مثل الطرق القائمة على مسبار التألق بالتشكل الخلوي والسياق المكاني لجيل ROS. ومع ذلك ، فإن خصوصية مجسات التألق المختلفة لأنواع مختلفة من جذور ROS لم تكن راسخة 7,8. تتوفر العديد من مجسات الفلورسنت مثل ثنائي هيدرويثيديوم (DHE) وثنائي كلورو ثنائي هيدروفلوريسئين (DCFH-DA) وثنائي هيدرورودامين (DHR) وثنائي ميثيل أنثراسين (DMA) و 2،7 ثنائي كلورو ثنائي هيدروفلوريسئين (DCFH) و 1،3-ثنائي فينيل إيزوبنزوفيوران (DPBF) وميتوسوكس للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية تجاريا. في العقود الماضية ، DHE و MitoSox و DCFH-DA هي الأصباغ الفلورية شائعة الاستخدام لقياس أنواع الأكسجين التفاعلية في الخلايا والأنسجة 8,9. DCFH-DA هي صبغة مستخدمة على نطاق واسع للكشف عن H2O2 داخل الخلايا والإجهاد التأكسدي. على الرغم من شعبية DCFH-DA ، فقد أظهرت العديد من الدراسات السابقة أنه لا يمكن استخدامه بشكل موثوق لقياس H2O2 داخل الخلايا ومستويات ROS الأخرى8،9،10،11،12،13،14.

في المقابل ، يظهر مسبار الفلورسنت ثنائي هيدرويثيديوم (DHE) استجابة محددة لجذر الأكسيد الفائق داخل الخلايا (O2-). في حين أن جذر الأكسيد الفائق هو واحد من العديد من أنواع أنواع ROS التي لوحظت في الخلايا ، إلا أنه جذري مهم يشارك في الحد من المعادن الانتقالية ، والتحويل إلى بيروكسي نترات ، وتشكيل هيدروبيروكسيدات ، من بين تأثيرات أخرى داخل الخلايا. DHE تمتص بسرعة من قبل الخلايا ولها انبعاث مضان في نطاق الطول الموجي الأحمر15. عند التفاعل مع جذر الأكسيد الفائق على وجه التحديد ، يشكل DHE منتجا فلوريا أحمر ، 2-هيدروكسي إيثيديوم (2-OH-E +). وبالتالي ، يمكن اعتبار DHE بمثابة مسبار محدد للكشف عن الأكسيد الفائق. ومع ذلك ، يمكن أن يخضع DHE أيضا للأكسدة غير المتخصصة مع ONOO- أو OH. ، H2O 2 ، والسيتوكروم c لتشكيل منتج مضان ثان ، ethidium E + ، والذي يمكن أن يتداخل مع مستويات 2-OH-E + المقاسة. ومع ذلك ، فإن منتجات 2-OH E + و E + هذه ، مجتمعة ، تمثل جزءا رئيسيا من إجمالي أنواع ROS الخلوية التي لوحظت داخل الخلية عند تلطيخها ب DHE. E + يقحم في الحمض النووي ، مما يعزز بشكل كبير مضان8،9،10،11،13،14،15،16. نظرا لأن أطياف التألق للإيثيديوم والإيثيديوم 2-هيدروكسي تختلف اختلافا طفيفا فقط ، يمكن اكتشاف غالبية مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية التي تظهر في خلية ثانوية لإنتاج الأكسيد الفائق وقياسها باستخدام منتجات مضان DHE. تم تحديد أنواع ROS هذه باستخدام إثارة الطول الموجي 480 نانومتر وانبعاث الطول الموجي 610 نانومتر15،16،17.

بالإضافة إلى اختيار مسبار محدد للكشف عن ROS الفلوري ، من المهم اختيار طريقة حساسة للكشف لقياس أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا. وبالتالي ، فإن التقييم الدقيق لمستويات أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا هو المفتاح لتحديد حالات توازن الأكسدة والاختزال المضطربة التي تحدث في الخلايا المريضة أو الخلايا التي تعرضت لضغوط بيئية مختلفة مثل الإشعاع والمركبات السمية والعوامل السامة للجينات18. نظرا لأن أنواع الأكسجين التفاعلية هي ظاهرة شائعة الحدوث في الخلايا المسؤولة عن تنظيم مجموعة متنوعة من أنشطة إشارات الخلايا ، فإن الطرق القوية للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية ضرورية. لتمكين مثل هذا التقييم عالي الإنتاجية لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا ، يستخدم هذا البروتوكول منصة فحص عالية المحتوى (HCS) لقياس أنواع أنواع الأكسجين التفاعلية. يسمح البروتوكول الحالي بتحليل عالي الإنتاجية لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا ، وهو أمر بالغ الأهمية في العديد من دراسات السموم19. يهدف هذا البروتوكول إلى توفير حل سهل ومتعدد الاستخدامات لاكتشاف وقياس أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا في خلايا سرطان الخلايا الكبدية الملتصقة. تستخدم الكواشف الكيميائية ل H2O2 و menadione كمحفزات ROS قوية لقياس المستويات النسبية لإنتاج ROS في بيئة خاضعة للرقابة وعالية الإنتاجية. يمكن ضبط هذا البروتوكول لقياس إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في الخلايا الملتصقة وغير الملتصقة في ظل الظروف المناسبة ، حسب الضرورة.

Protocol

1. ثقافة الخلية

  1. قم بزرع خلايا الاختبار (خلايا سرطان الخلايا الكبدية HepG2 و HUH7 و JHH4) في صفيحة 96 بئرا بكثافة بذر تبلغ 10000 خلية / بئر في حجم بذر نهائي يبلغ 200 ميكرولتر لكل بئر.
    1. قبل زراعة خلايا HepG2 ، قم بتغطية 96 بئرا بالكولاجين من النوع الرابع (50 ميكروغرام / مل) لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة (RT). لتجنب تصلب الكولاجين ، ضع محلول المخزون في الثلج وبعد ذلك ، ابدأ عملية التخفيف إلى التركيز المطلوب.
    2. بعد فترة حضانة 2 ساعة ، استنشق الكولاجين الزائد واغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام 1x PBS.
  2. قم بزراعة الخلايا في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco طوال الليل عند 37 درجة مئويةوتركيز CO 2 بنسبة 5٪ في حاضنة مرطبة.
  3. في اليوم التالي ، أو عند الوصول إلى التقاء 80٪ -90٪ ، أيهما أسبق ، عالج الخلايا ب H2O2 (غير معالج ، 250 ميكرومتر ، 500 ميكرومتر ، 750 ميكرومتر ، و 1000 ميكرومتر) وميناديون (غير معالج ، 25 ميكرومتر ، 50 ميكرومتر ، 75 ميكرومتر ، 100 ميكرومتر) ، على التوالي لمدة 30 دقيقة للحث على الإجهاد التأكسدي التمثيلي.
  4. بدلا من ذلك ، اختر اختبار الخلايا بمادة الاختبار المرغوبة القادرة على إحداث الإجهاد التأكسدي داخل الخلايا.

2. إعداد محلول المخزون والمخفف لتلطيخ الخلايا DHE

  1. قم بإعداد محلول مخزون DHE (5 مجم / مل أو 15.9 مللي مول) عن طريق إذابة 5 مجم من DHE إلى 1 مل من DMSO.
  2. قم بتخفيف محلول مخزون DHE بالماء المقطر المزدوج المعقم إلى تركيز نهائي 100 ميكرومتر.
  3. لتجنب عملية التجميد والذوبان للصبغة (التي قد تلحق الضرر بخصائص التألق بمرور الوقت) ، قم بإعداد العديد من القسامات في أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مل بتركيز 100 ميكرومتر وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
  4. لتحقيق تركيز عمل نهائي يبلغ 10 ميكرومتر ، استخدم حصة من تركيز 100 ميكرومتر DHE وقم بتخفيفه باستخدام وسائط DMEM الدافئة مسبقا.
    ملاحظة: يجب تحضير محلول العمل طازجا في يوم التجربة.
  5. دوامة محلول صبغة مضان العمل لمدة 5-10 ثانية لضمان الخلط السليم للصبغة.

3. عملية تلطيخ DHE

  1. قم بإزالة الوسائط التي تحتوي على الدواء أو مادة الاختبار من كل بئر واغسلها برفق مرة واحدة إما باستخدام 1x PBS أو DMEM.
    ملاحظة: عند تنفيذ خطوات الإضافة أو الغسيل في التجربة ، من الضروري تجنب الاتصال المباشر بين الخلايا والماصة. يمكن تحقيق ذلك عن طريق سحب PBS برفق على طول جوانب الآبار لتقليل أي ضرر ميكانيكي محتمل للخلايا. سيساعد التأكد من أن الماصة لا تلمس الخلايا مباشرة في الحفاظ على سلامة الخلية وصلاحيتها طوال مدة التجربة.
  2. أضف 100 ميكرولتر من وسائط DMEM التي تحتوي على 10 ميكرومتر DHE (محلول عمل) في كل بئر واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. بعد فترة حضانة مدتها 30 دقيقة ، قم بإزالة الوسائط المحتوية على DHE واغسل كل بئر برفق ثلاث مرات باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS). يمكن إجراء ذلك باستخدام ماصة متعددة القنوات لضمان التحول السريع.
  4. أضف 200 ميكرولتر من 1x PBS إلى كل بئر باستخدام صبغة التلوين النووي Hoechst 33342 لمدة 10 دقائق في RT.
  5. قم بإزالة محلول التلوين النووي Hoechst 33342 من البئر وأضف 200 ميكرولتر من 1x PBS إلى كل بئر.
    ملاحظة: للحصول على خلايا ثابتة ، اتبع نفس البروتوكول الخاص بالخلايا الحية ، مع خطوة إضافية واحدة تتمثل في إضافة 4٪ PFA لمدة 5 دقائق بعد العلاج وتلطيخ DHE. قم بإزالة محلول PFA واغسل الخلايا باستخدام 1x PBS. ثم احتضان الخلايا بصبغة التلوين النووي لمدة 10 دقائق.
  6. انقل اللوحة إلى منصة فحص المحتوى العالي أو الفحص المجهري الفلوري أو قارئ اللوحة للحصول على الصور في أسرع وقت ممكن.

4. الحصول على الصور وقياس الكثافة

  1. تحميل اللوحة
    1. افتح برنامج فحص المحتوى العالي (HCS) Cellomics CX7 للحصول على البيانات.
    2. قم بمعايرة منصة التصوير بعناية وفقا لمواصفات الشركة المصنعة في وقت مبكر باستخدام اللوحة المحددة المكونة من 96 بئرا لاستخدامها لتجنب أي صور ضبابية أو ضبابية في البيانات.
      ملاحظة: قد يكون للألواح متعددة الآبار من بائعين مختلفين خصائص مادية مختلفة ويمكن أن تؤثر على جودة الصور النهائية التي تم الحصول عليها.
    3. بمجرد المعايرة ، احفظ معلمات النظام الخاصة بالعلامة التجارية للوحة في قاعدة بيانات الأداة وأعد استخدامها للحصول على البيانات في المستقبل.
    4. ضع اللوحة بعناية مع العينات المعدة على المرحلة الساخنة لنظام التصوير HCS. تأكد من وضع اللوحة بإحكام وفي الاتجاه الصحيح للتصوير على حامل الصفيحة الدقيقة (على سبيل المثال ، حدد موقع الملصق الذي يحمل علامة A1 على مرحلة القارئ ، ثم قم بتدوير الصفيحة الدقيقة بحيث يتطابق موقع البئر A1 مع الزاوية مع الملصق).
    5. اضغط برفق على الصفيحة الدقيقة للتأكد من استقرارها بشكل مسطح على المسرح. يمكن أن يؤدي التسوية غير المتساوية للوحة في نظام HCS إلى أخطاء في الحصول على الصور.
    6. بعد وضع اللوحة في مكانها ، اضغط مع الاستمرار على مفتاح Ctrl ، ثم انقر فوق Ctrl-OK في مربع حوار تحميل / تفريغ اللوحة في البرنامج.
  2. اختيار معلمات التصوير
    1. في نظام التصوير HCS ، افتح وضع التنشيط المستهدف في واجهة التطبيقات الحيوية Cellomics وقم بإنشاء بروتوكول جديد باستخدام بروتوكول الإعداد ثنائي القناة المتوافق مع (أ) التلوين النووي و (ب) الحصول على بيانات مسبار DHE الفلوري. في البروتوكول الحالي ، تم استخدام المرشحات 386_BGSRS_BGSRS و 480_BGS_RS و 386_BGS_RS من أجل (أ) Hoechst 33342 للتلطيخ النووي ، (ب) إجمالي إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية ، و (ج) الكشف الجذري عن الأكسيد الفائق ، على التوالي. كان اختيار هذه المرشحات مدفوعا بالتداخل المحدد لخصائص الانبعاث لكل أصباغ (DAPI و DHE) المستخدمة كجزء من هذا البروتوكول.
      ملاحظة: يشير اصطلاح تسمية المرشحات ، على سبيل المثال ، 386-23_BGRFRN_BGRFRN ، إلى إثارة العينة بضوء 386 نانومتر مع عرض نطاق 23 نانومتر ، متبوعا بمرشح ثنائي اللون يمر باللون الأزرق (B) والأخضر (G) والأحمر (R) والأحمر البعيد (FR) وضوء الأشعة تحت الحمراء (N) القريب من الأشعة تحت الحمراء (N) عند نطاقات طول موجي محددة ويشير 386_BGS_RS إلى مرشح الانبعاث الذي يمرر ضوء الطول الموجي للانبعاث BGS و RS بعد ثنائي اللون.
    2. حدد أهداف عملية الحصول على الصور داخل واجهة بروتوكول البرنامج، مثل التكبير 10x أو 20x، حسب الضرورة.
    3. اختر التكبير الموضوعي المناسب اعتمادا على المستوى المطلوب من تفاصيل التصوير والدقة اللازمة للتجربة. ومع ذلك ، يتم إصلاح قرار كل هدف. ستتطلب تفاصيل الدقة الأعلى تغيير الهدف على النظام الأساسي. في البروتوكول الحالي ، يتم استخدام هدف 20x ، 0.45 NA ، وهو جزء من منصة فحص المحتوى العالي المستخدمة في هذا البروتوكول.
      ملاحظة: يمثل الهدف 20x مقايضة جيدة بين تفاصيل دقة التصوير وسرعة الاستحواذ اللازمة لالتقاط تغييرات ROS بمرور الوقت. يمكن اختيار أهداف تكبير أعلى (على سبيل المثال ، 40X) ، ومع ذلك ، سيؤدي ذلك إلى زيادة أوقات الاستحواذ.
    4. حدد إعدادات التعريض الضوئي لكاميرا الحصول على الصور، مثل وقت التعرض للضوء، وتجميع الكاميرا، والفاصل الزمني لمكدس z، وفقا للمتطلبات المحددة للبروتوكول.
      ملاحظة: يختلف وقت التعرض (غالبا بالمللي ثانية) بناء على قوة الإشارة وحساسية الفلوروفورات المحددة المستخدمة. قد يختلف هذا أيضا قليلا من تجربة إلى أخرى بناء على تركيز الصبغة وجودة التلطيخ. في البروتوكول الحالي ، يتم إصلاح معلمات الاستحواذ على النحو التالي - الهدف٪ - 35٪ ، وضع الحصول على الصور - 1104 × 1104 (مع 2x2 binning) ، والهدف 20x ، 0.45 NA. يمكن تعيين هذه المعلمات وفقا للظروف التجريبية المحددة.
  3. معلمات تكوين التصوير
    ملاحظة: بمجرد ضبط معلمات التصوير، يمكن بدء عملية جمع الصور باستخدام واجهة البرنامج.
    1. معلمات جمع الصور
      1. تحديد كائن التتبع الأساسي محل الاهتمام (نواة الخلايا) باستخدام خوارزميات مختلفة متوفرة في الأداة (البصريات - isodata ، الثابتة ، والمثلث).
        ملاحظة: يتم استخدام طريقة isodata لتحديد وتمييز الكائن الأساسي في هذا البروتوكول.
      2. قسم الكائن (إن وجد) إما حسب الشكل أو معلمة الكثافة.
      3. تحقق من صحة الكائن الأساسي استنادا إلى معلمات الحجم والشكل والكثافة المطلوبة الفريدة لكل نوع خلية.
      4. بعد ذلك ، حدد "منطقة الاهتمام" (ROI) حول هذا الكائن الأساسي.
        ملاحظة: عائد الاستثمار هو معلمة رئيسية للحصول على البيانات التي تحدد الموقع الذي يتم فيه تحديد شدة الصبغة الفلورية لتكون متسقة وقابلة للتكرار عبر أنواع الخلايا. يحدد عائد الاستثمار المعلمات الرئيسية (مثل شدة الصبغة) ، والتي يتم قياسها لكل كائن تتبع أساسي (أي خلية) في قنوات مختلفة من الجهاز. يمكن تعريف عائد الاستثمار في شكل دائرة أو حلقة حول نواة كل خلية. يحصل برنامج HCS تلقائيا على شدة علامة صبغة DHE الفلورية في القناة 2 ضمن حدود عائد الاستثمار لكل خلية يتم تقسيمها وتحليلها بطريقة آلية.
      5. اضبط دائرة 20 ميكرومتر حول الكائن الأساسي (النواة). تم اختيار مسافة 20 ميكرومتر في هذه الدراسة بناء على الأحجام التقريبية لخطوط الخلايا المختلفة المستخدمة في هذا البروتوكول (HepG2 و JHH-4 و HUH-7). حصل عائد الاستثمار الحلقي البالغ 20 ميكرومتر حول الخلايا على شدة التألق بطريقة متسقة وقابلة للتكرار.
        ملاحظة المعلمة الرئيسية في اختيار عائد الاستثمار هي القدرة على تغطية منطقة الخلية بشكل كاف ؛ يعتمد حجم عائد الاستثمار الدائري على حجم الخلية. قد تتطلب الخلايا الأكبر عائد استثمار أكبر والعكس صحيح للحصول على عائد استثمار أصغر. يجب تحديد هذه المعلمات في وقت مبكر لكل نوع خلية وصبغة مضان ذات أهمية.
  4. توصيف السكان وتحديد المعالم المراد تخزينها
    1. بمجرد تحديد معلمات الاستحواذ المختلفة في بروتوكول التصوير HCS ، اضبط نظام HCS في وضع الحصول على البيانات.
    2. تم تعيين معلمات الحصول على الصور لهذا البروتوكول على النحو التالي: حد مسح يبلغ 1000 خلية / بئر ، مع حد أدنى لمتطلبات 10 كائنات (خلايا) لكل حقل.
      ملاحظة: تم تحديد عدد الحقول التي تم تقييمها لكل بئر بناء على عدد الخلايا النهائي الذي يصل إلى الرقم 1000. يستمر نظام HCS في البحث في مواقع مختلفة داخل البئر حتى يحصل على السكان المستهدفين البالغ 1000 خلية / بئر. وبالتالي تعتمد سرعة الاستحواذ على التقاء وإجمالي عدد الخلايا الموجودة في كل بئر من لوحة 96 بئرا. في البروتوكول الحالي ، تم جمع الكثافة الكلية والمتوسطة للقناة 2 (التي تمثل جذور الأكسيد الفائق وإجمالي إنتاج ROS) من كل بئر لمزيد من التحليلات النهائية.
  5. التقاط الصور ومعالجتها وتحليلها
    1. بعد ضبط معلمات الحصول على الصور وإنهائها ، ابدأ عملية المسح لكل لوحة 96 بئرا.
      ملاحظة: يتيح نظام التصوير Cellomics CX7 فحص المحتوى العالي والتحليل الآلي لعينات من مجموعة متنوعة من المعلمات ، بما في ذلك إنتاج ROS داخل الخلايا بطريقة عالية الإنتاجية. بالإضافة إلى إنتاج ROS ، فإن نظام HCS قادر على توفير معلومات قيمة إضافية حول المعلمات المختلفة مثل مورفولوجيا الخلية ، والتوطين تحت الخلوي ، والعديد من الميزات الخلوية الأخرى ذات الأهمية. بمجرد تحسينها للاستحواذ ، تسمح منصة التصوير HCS بالتوصيف الشامل والنوعي والكمي لمعلمات الخلية بطريقة قوية.
    2. بعد اكتمال عملية المسح ، قم بتشغيل برنامج View Analysis وقم بتصدير معلمات البيانات الكمية المختلفة بتنسيق .csv لإجراء تحليل إضافي.
    3. باستخدام برنامج تابع لجهة خارجية ، انسخ والصق القيم الكمية المختلفة ذات الأهمية لإجراء تحليلات إضافية في المراحل النهائية.
      ملاحظة: في البروتوكول الحالي ، تم استخدام برنامج GraphPad Prism لتحليل قيم شدة DHE استجابة للإجهاد التأكسدي المستحث بسبب التعرض H2O2 و menadione.
  6. البيانات والتحليل الإحصائي
    1. احسب متوسط شدة القناة 2 (يمثل إجمالي قيم ROS وجذور الأكسيد الفائق).
      ملاحظة: تم تكرار جميع التجارب لحساب قيم الشدة ثلاث مرات مع 6 مكررات لكل حالة في كل مستوى جرعات.
    2. قم بإجراء اختبار ANOVA أو t أحادي الاتجاه لقياس الاختلافات في قيم الشدة بين ظروف الاختبار المختلفة.

النتائج

ثنائي هيدرويثيديوم (DHE) عبارة عن صبغة مضان فائقة الاستجابة للأكسيد توفر معلومات محددة فيما يتعلق بحالات أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا. دتنبعث صبغة ال HEE جوهريا من مضان أزرق في السيتوبلازم. ومع ذلك ، عند التفاعل مع جذور الأكسيد الفائق ، يتم تحويله إلى 2-هيدروكسي إيثيديوم ، والذي ينبع...

Discussion

في هذه الدراسة ، تم إنشاء بروتوكول لتقييم إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا (ROS) التي يحركها الأكسيد الفائق باستخدام صبغة مضان ثنائي هيدرويثيديوم (DHE) على نظام فحص عالي المحتوى. تستخدم غالبية البروتوكولات الحالية المتاحة في الأدبيات DCFH-DA كمسبار تصوير مضان لتحديد أنواع ROS. ومع ذلك ...

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.

Acknowledgements

تم دعم RK و RRG بمنحة من مركز UNM للمعادن في علم الأحياء والطب (CMBM) من خلال منحة NIH NIGMS P20 GM130422. تم دعم RRG بجائزة تجريبية من منحة NM-INSPIRES P30 1P30ES032755. تم توفير الدعم الأساسي للتصوير لأداة CX7 Cellomics من خلال نوى مركز AIM بتمويل من منحة المعاهد الوطنية للصحة P20GM121176. نود أن نشكر الدكتورة شارينا ديساي والدكتور لي تشن على مساعدتهما القيمة في القضايا الفنية المتعلقة باستخدام منصة التصوير CX7 Cellomics.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL centrifuge tubes VWR 20170-038 
96- well plate Corning Costar 07-200-90 
Cellomics Cx7ThermoFisher HCSDCX7LEDPRO
Collagen Advanced Biomatrix  5056 
DHE (Dihydroethidium) ThermoFisher D1168 
DMEM Sigma  6046 
FBS VWR 97068-085 
GraphPad PrismGraphPadVersion 6.0
HepG2 cell lineATCC
Hoechst ThermoFisher 33342 
HUH7 cell lineATCC
Hydrogen Peroxide Sigma 88597 
JHH4 cell lineATCC
Menadione Sigma M5625 

References

  1. Juan, C. A., et al. The chemistry of reactive oxygen species (ros) revisited: Outlining their role in biological macromolecules (DNA, Lipids and Proteins) and induced pathologies. Int J Mol Sci. 22 (9), 4642 (2021).
  2. Magnani, F., et al. Structure and mechanisms of ROS generation by NADPH oxidases. Curr Opin Struct Biol. 59, 91-97 (2019).
  3. Collin, F. Chemical basis of reactive oxygen species reactivity and involvement in neurodegenerative diseases. Int J Mol Sci. 20 (10), 2407 (2019).
  4. Uttara, B., et al. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Curr Neuropharmacol. 7 (1), 65-74 (2009).
  5. Dikalov, S. I., et al. Electron paramagnetic resonance measurements of reactive oxygen species by cyclic hydroxylamine spin probes. Antioxid Redox Signal. 28 (15), 1433-1443 (2018).
  6. Wang, Q., et al. Measurement of reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial ROS in AMPK knockout mice blood vessels. Methods Mol Biol. 1732, 507-517 (2018).
  7. Griendling, K. K., et al. Measurement of reactive oxygen species, reactive nitrogen species, and redox-dependent signaling in the cardiovascular system: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 119 (5), e39-e75 (2016).
  8. Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radic Biol Med. 52 (1), 1-6 (2012).
  9. Gomes, A., et al. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
  10. Halliwell, B., et al. . Free radicals in biology and medicine. , (2015).
  11. Cho, S., et al. Fluorescence-based detection and quantification of features of cellular senescence. Methods Cell Biol. 103, 149-188 (2011).
  12. Dikalov, S. I., et al. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxid Redox Signal. 20 (2), 372-382 (2014).
  13. Kalyanaraman, B., et al. Recent developments in detection of superoxide radical anion and hydrogen peroxide: Opportunities, challenges, and implications in redox signaling. Arch Biochem Biophys. 617, 38-47 (2017).
  14. Robinson, K. M., et al. Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (41), 15038-15043 (2006).
  15. Zielonka, J., et al. Detection of 2-hydroxyethidium in cellular systems: a unique marker product of superoxide and hydroethidine. Nat Protoc. 3 (1), 8-21 (2008).
  16. Nazarewicz, R. R., et al. Rapid and specific measurements of superoxide using fluorescence spectroscopy. J Biomol Screen. 18 (4), 498-503 (2013).
  17. Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nat Metab. 4 (6), 651-662 (2022).
  18. Ameziane-El-Hassani, R., et al. Detection of reactive oxygen species in cells undergoing oncogene-induced senescence. Oncogene-Induced Senescence: Methods Protoc. 1534, 139-145 (2017).
  19. Abraham, , et al. High content screening applied to large-scale cell biology. Trends Biotechnol. 22 (1), 15-22 (2004).
  20. Criddle, D. N., et al. Menadione-induced reactive oxygen species generation via redox cycling promotes apoptosis of murine pancreatic acinar cells. J Biol Chem. 281 (52), 40485-40492 (2006).
  21. Goffart, S., et al. The type and source of reactive oxygen species influences the outcome of oxidative stress in cultured cells. Cells. 10 (5), 1075 (2021).
  22. Kurutas, E. B. The importance of antioxidants which play the role in cellular response against oxidative/nitrosative stress: current state. Nutr J. 15 (1), 71 (2015).
  23. Shad, K. F., Das, T. K. Introductory Chapter: Role of Fenton and Haber-Weiss Reaction in Epilepsy. Epilepsy-Seizures without Triggers. IntechOpen. , (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved