Dihidroetidyum (DHE) Floresan Boya Kullanılarak Reaktif Oksijen Türleri (ROS) Üretiminin Yüksek Verimli Tarama Değerlendirmesi

Özet

Bu protokol, yüksek verimli bir tarama yaklaşımı kullanarak bir floresan boya probu olarak dihidroetidyum (DHE) kullanarak hücre içi reaktif oksijen türlerini (ROS) ölçmek için yeni bir yöntemi açıklar. Protokol, üç farklı hepatoselüler karsinom hücre hattında hücre içi reaktif oksijen türlerinin (ROS) kantitatif değerlendirme yöntemlerini açıklar.

Özet

Reaktif oksijen türleri (ROS), fizyolojik ve patolojik süreçlerde hücresel metabolizmanın düzenlenmesinde anahtar rol oynar. Fizyolojik ROS üretimi, proliferasyon, sinyalleşme, apoptoz ve yaşlanma gibi normal hücresel fonksiyonların uzamsal ve zamansal modülasyonunda merkezi bir rol oynar. Buna karşılık, kronik ROS aşırı üretimi, diğerlerinin yanı sıra kanser, kardiyovasküler hastalık ve diyabet gibi geniş bir hastalık yelpazesinden sorumludur. ROS seviyelerinin doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçülmesi, normal hücresel işlevselliği anlamak için çok önemlidir. Hücre içi ROS türlerini karakterize etmek için floresan görüntüleme tabanlı yöntemler yaygın bir yaklaşımdır. Literatürdeki görüntüleme ROS protokollerinin çoğunda 2'-7'-diklorodihidrofloresein diasetat (DCFH-DA) boyası kullanılmaktadır. Bununla birlikte, bu boya, kullanımında ve yorumlanabilirliğinde önemli sınırlamalardan muzdariptir. Mevcut protokol, yüksek verimli bir ortamda toplam ROS üretimini ölçmek için alternatif bir yöntem olarak bir dihidroetidyum (DHE) floresan probunun kullanımını göstermektedir. ROS üretimini ölçmek ve ölçmek için yüksek verimli görüntüleme platformu CX7 Cellomics kullanıldı. Bu çalışma üç hepatoselüler kanser hücre hattında (HepG2, JHH4 ve HUH-7) gerçekleştirildi. Bu protokol, DHE çözeltisinin hazırlanması, hücrelerin DHE çözeltisi ile inkübasyonu ve ROS üretimini karakterize etmek için gerekli DHE yoğunluğunun ölçülmesi dahil olmak üzere, hücreler içindeki ROS'un değerlendirilmesinde yer alan çeşitli prosedürlerin derinlemesine bir tanımını sağlar. Bu protokol, DHE floresan boyanın, hücre içi ROS üretimini yüksek verimli bir şekilde karakterize etmek için sağlam ve tekrarlanabilir bir seçim olduğunu göstermektedir. ROS üretimini ölçmek için yüksek verimli yaklaşımların, toksikoloji, ilaç taraması ve kanser biyolojisi gibi çeşitli çalışmalarda yardımcı olması muhtemeldir.

Giriş

Reaktif oksijen türleri (ROS), hücrelerde normal hücresel metabolizmanın bir parçası olarak oluşan, doğal olarak oluşan, oldukça reaktif ve zamansal olarak kararsız kimyasal radikaller grubudur. ROS,^{hücrelerde meydana} gelen normal fizyolojik ve biyokimyasal süreçlerin modülasyonunda anahtar ve önemli bir rol oynar ^1,2. Hücrelerde ROS üretiminin ana kaynağı, normal biyoenerjetik döngünün bir parçası olarak mitokondriyal elektron taşıma zinciri (ETC) yolundandır. ROS üretiminin önemli ek kaynakları, hücrelerdeki hücresel NADPH oksidazlar gibi enzimatik reaksiyonları içerir. Gıda moleküllerinin (örneğin glikoz) metabolizması, mitokondriyal matristeki oksidatif fosforilasyon yolu yoluyla gerçekleşir. Normal fizyolojik hücre sinyalleme süreçlerini düzenlemek için temel düzeyde bir ROS üretimi gereklidir. Glikoz metabolik sinyal yollarının bir parçası olan birçok anahtar protein molekülünün (örneğin, Akt ve PTEN) hücre içi ROS seviyelerine yanıt verdiği bilinmektedir. Ek olarak, ROS, hücresel enzimatik yolların bir parçası olarak ksantin oksidaz, nitrik oksit sentaz ve peroksizomal bileşenler gibi çeşitli hücre içi enzimler tarafından üretilir ^1,2. ROS'un doğal kaynaklarının aksine, ksenobiyotikler, bulaşıcı ajanlar, UV ışığı, kirlilik, sigara içimi ve radyasyon gibi bazı çevresel faktörler de hücre içi oksidatif stresin önemli bir itici gücü olan aşırı ROS üretimine yol açar ^1,3. Yüksek hücresel oksidatif stres, bir hücre içindeki lipitler, proteinler ve DNA gibi doğal biyomoleküllere zarar vererek kanser, diyabet, kardiyovasküler hastalık, kronik inflamasyon ve nörodejeneratif bozukluklar gibi çeşitli hastalıklara neden olabilir ^1,3,4. Bu nedenle, oksidatif strese bağlı hastalık patofizyolojisinde yer alan hücresel mekanizmaları anlamak için ROS'un doğru ölçümleri gereklidir.

ROS üretiminin ve hücrelerin içindeki eliminasyonun kısa zaman çizelgeleri nedeniyle, çeşitli ROS radikallerinin kantitatif ölçümleri bir zorluk olmaya devam etmektedir. Çeşitli hücresel ROS^6'yı ölçmek için elektron paramanyetik rezonans (EPR)⁵, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) ve floresan prob tabanlı görüntüleme gibi yöntemler kullanılır. EPR ve HPLC gibi yöntemler nicel olarak doğru tahminler verirken, bu yöntemler hücresel uzamsal morfolojinin yok edilmesini içerir ve genellikle bir numunenin küresel ve toplu ölçümleri şeklindedir. Buna karşılık, floresan probu tabanlı yöntemler gibi görüntüleme tabanlı yöntemler, ROS neslinin hücresel morfolojisini ve uzamsal bağlamını korur. Bununla birlikte, farklı ROS radikalleri için çeşitli floresan problarının özgüllüğü iyi belirlenmemiştir ^7,8. Dihidroetidyum (DHE), diklorodihidrofloresein diasetat (DCFH-DA), dihidrorodamin (DHR), dimetil antrasen (DMA), 2,7 diklorodihidroflurescein (DCFH), 1,3-Difenilizobenzofuran (DPBF) ve MitoSox gibi çeşitli floresan problar ticari olarak ROS tespiti için mevcuttur. Geçtiğimiz yıllarda, DHE, MitoSox ve DCFH-DA, hücrelerde ve dokularda^ROS'u ölçmek için yaygın olarak kullanılan floresan boyalardır ^8,9. DCFH-DA, hücre içi_H2O2ve oksidatif stresi tespit etmek için yaygın olarak kullanılan bir boyadır. DCFH-DA'nın popülaritesine rağmen, önceki birçok çalışma, hücre içi_H2O2ve diğer ROS seviyelerini ^{8,9,10,11,12,13,14} ölçmek için güvenilir bir şekilde kullanılamayacağını göstermiştir.

Buna karşılık, floresan prob dihidroetidyum (DHE), hücre içi süperoksit radikaline (_O2^-) spesifik bir yanıt gösterir. Süperoksit radikali, hücrelerde gözlenen birçok ROS türünden biri olmakla birlikte, diğer hücre içi etkilerin yanı sıra geçiş metallerinin indirgenmesinde, peroksinitrata dönüştürülmesinde ve hidroperoksitlerin oluşumunda rol oynayan önemli bir radikaldir. DHE, hücreler tarafından hızla alınır ve kırmızı dalga boyu aralığında¹⁵ floresan emisyonuna sahiptir. Spesifik olarak süperoksit radikali ile reaksiyona girdiğinde, DHE kırmızı bir floresan ürün, 2-hidroksi etidyum (2-OH-E ⁺) oluşturur. Bu nedenle, DHE, süperoksit tespiti için spesifik bir prob olarak düşünülebilir. Bununla birlikte, DHE, ölçülen 2-OH-E ⁺ seviyelerine müdahale ^{edebilen ikinci} bir floresan ürünü olan etidyum E⁺ oluşturmak için ONOO^- veya OH^.,_H2O2ve sitokrom c ile spesifik olmayan oksidasyona da uğrayabilir. Bununla birlikte, bu 2-OH E ⁺ ve E ⁺ ürünleri, kombinasyon halinde, DHE ile boyandığında bir hücre içinde gözlenen toplam hücresel ROS türlerinin büyük bir bölümünü temsil eder. E⁺ DNA'ya interkalasyon yapar^{ve floresansını büyük} ölçüde arttırır 8,9,10,11,13,14,15,16. Etidyum ve 2-hidroksi etidyumun floresan spektrumları sadece biraz farklılık gösterdiğinden, süperoksit üretimine ikincil bir hücrede görülen ROS seviyelerinin çoğu, DHE floresan ürünleri kullanılarak tespit edilebilir ve ölçülebilir. Bu ROS türleri, 480 nm dalga boyu uyarımı ve 610 nm dalga boyu emisyonu 15,16,17 kullanılarak tanımlanır.

Spesifik bir floresan ROS algılama probu seçmeye ek olarak, hücre içi ROS'u ölçmek için hassas bir algılama yöntemi seçmek önemlidir. Bu nedenle, hücre içi ROS seviyelerinin doğru değerlendirilmesi, hastalıklı hücrelerde veya radyasyon, toksikolojik bileşikler ve genotoksik ajanlar gibi çeşitli çevresel stres faktörlerine maruz kalmış hücrelerde meydana gelen bozulmuş redoks dengesi durumlarını belirlemenin anahtarıdır¹⁸. ROS, çeşitli hücre sinyal aktivitelerinin düzenlenmesinden sorumlu olan hücrelerde yaygın olarak meydana gelen bir fenomen olduğundan, ROS'un saptanması için sağlam yöntemler gereklidir. Hücreler içindeki ROS üretiminin bu kadar yüksek verimli bir şekilde değerlendirilmesini sağlamak için bu protokol, ROS türlerini ölçmek için yüksek içerikli bir tarama (HCS) platformu kullanır. Mevcut protokol, birçok toksikoloji çalışmasında kritik öneme sahip olan hücre içi ROS üretiminin yüksek verimli analizine izin vermektedir¹⁹. Bu protokol, yapışık hepatosellüler karsinom hücrelerinde hücre içi ROS'u saptamak ve ölçmek için kolay ve çok yönlü bir çözüm sağlamayı amaçlamaktadır. _H2O2ve menadionun kimyasal reaktifleri, kontrollü ve yüksek verimli bir ortamda ROS üretiminin nispi seviyelerini ölçmek için güçlü ROS stimülatörleri olarak kullanılır. Bu protokol, gerektiğinde uygun koşullar altında yapışık ve yapışık olmayan hücrelerde ROS üretimini ölçmek için ince ayar yapılabilir.

Protokol

1. Hücre kültürü

1. Test hücrelerini (HepG2, HUH7 ve JHH4 hepatoselüler karsinom hücreleri), kuyu başına 200 μL'lik bir nihai tohumlama hacminde 10.000 hücre / kuyu tohumlama yoğunluğunda 96 oyuklu bir plakaya tohumlayın.
   1. HepG2 hücrelerini kültürlemeden önce, 96 plaka kuyucuğunu oda sıcaklığında (RT) 2 saat boyunca tip IV kollajen (50 μg / mL) ile kaplayın. Stok kollajenin katılaşmasını önlemek için, stok çözeltisini buza yerleştirin ve ardından istenen konsantrasyona seyreltme işlemini başlatın.
   2. 2 saatlik bir inkübasyon süresinden sonra, fazla kollajeni aspire edin ve kuyucukları 1x PBS ile üç kez yıkayın.
2. Hücreleri, Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyerinde (DMEM) gece boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO₂ konsantrasyonunda nemlendirilmiş bir inkübatörde yetiştirin.
3. Ertesi gün veya% 80-90 birleşmeye ulaştıktan sonra, hangisi daha erken ise, hücreleri_H2O2(işlenmemiş, 250 μM, 500 μM, 750 μM ve 1000 μM) ve Menadion (tedavi edilmemiş, 25 μM, 50 μM, 75 μM, 100 μM) ile 30 dakika boyunca temsili oksidatif stresi indüklemek için tedavi edin.
4. Alternatif olarak, hücreleri, hücreler içinde oksidatif stresi indükleyebilen istenen test maddesi ile test etmeyi seçin.

2. Hücrelerin DHE boyaması için stok ve seyreltik çözelti hazırlama

1. 5 mg DHE'yi 1 mL DMSO içinde çözerek DHE stok çözeltisini (5 mg / mL veya 15.9 mM) hazırlayın.
2. DHE stok çözeltisini çift damıtılmış otoklavlanmış su ile son 100 μM konsantrasyonuna seyreltin.
3. Boyanın donma ve çözülme sürecini önlemek için (zamanla floresan özelliklerine zarar verebilir), 100 μM konsantrasyonda 1,5 mL santrifüj tüplerinde birkaç alikot hazırlayın ve bunları -20 °C'de saklayın.
4. 10 μM'lik bir nihai çalışma konsantrasyonu elde etmek için, 100 μM DHE konsantrasyonunun bir alikotunu kullanın ve önceden ısıtılmış DMEM ortamı ile seyreltin.
   NOT: Çalışma solüsyonu deney günü taze olarak hazırlanmalıdır.
5. Boyanın uygun şekilde karışmasını sağlamak için çalışan floresan boya çözeltisini 5-10 saniye boyunca vorteksleyin.

3. DHE boyama işlemi

1. İlaç veya test maddesi içeren ortamı her bir kuyucuktan çıkarın ve 1x PBS veya DMEM ile bir kez nazikçe yıkayın.
   NOT: Deneyde ekleme veya yıkama adımlarını gerçekleştirirken, hücreler ve pipetleyici arasında doğrudan temastan kaçınmak çok önemlidir. Bu, hücrelerde olası mekanik hasarı en aza indirmek için PBS'yi kuyucukların kenarları boyunca nazikçe pipetleyerek elde edilebilir. Pipetörün hücrelere doğrudan temas etmemesini sağlamak, deney süresince hücre bütünlüğünün ve canlılığının korunmasına yardımcı olacaktır.
2. Her bir kuyucuğa 10 μM DHE (çalışma solüsyonu) içeren 100 μL DMEM ortamı ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
3. 30 dakikalık inkübasyon süresinden sonra, DHE içeren ortamı çıkarın ve her birini 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez nazikçe yıkayın. Bu, hızlı geri dönüş sağlamak için çok kanallı bir pipetleyici ile gerçekleştirilebilir.
4. RT'de 10 dakika boyunca Hoechst 33342 nükleer boyama boyası ile her oyuğa 200 μL 1x PBS ekleyin.
5. Hoechst 33342 nükleer boyama solüsyonunu kuyudan çıkarın ve her oyuğa 200 μL 1x PBS ekleyin.
   NOT: Sabit hücreler elde etmek için, canlı hücrelerle aynı protokolü izleyin, tedaviden ve DHE boyamadan sonra 5 dakika boyunca% 4 PFA eklemek için ek bir adım atın. PFA solüsyonunu çıkarın ve hücreleri 1x PBS ile yıkayın. Daha sonra, hücreleri nükleer boyama boyası ile 10 dakika inkübe edin.
6. Mümkün olan en kısa sürede görüntü elde etmek için plakayı yüksek içerikli tarama platformuna, floresan mikroskobuna veya plaka okuyucuya taşıyın.

4. Görüntü toplama ve yoğunluk ölçümü

1. Plaka yükleme
   1. Veri toplama için Cellomics CX7 yüksek içerikli tarama (HCS) yazılımını açın.
   2. Verilerde puslu veya bulanık görüntülerden kaçınmak için görüntüleme platformunu üreticinin spesifikasyonlarına göre önceden kullanım için tercih edilen özel 96 oyuklu plaka ile dikkatli bir şekilde kalibre edin.
      NOT: Çeşitli satıcılardan alınan çok kuyulu plakalar farklı malzeme özelliklerine sahip olabilir ve elde edilen nihai görüntülerin kalitesini etkileyebilir.
   3. Kalibre edildikten sonra, plaka markasına özgü sistem parametrelerini cihaz veritabanına kaydedin ve bunları gelecekteki veri alımları için yeniden kullanın.
   4. Hazırlanan numunelerin bulunduğu plakayı HCS görüntüleme sisteminin ısıtılmış aşamasına dikkatlice yerleştirin. Plakanın güvenli bir şekilde yerleştirildiğinden ve mikroplaka tutucusunda görüntüleme için doğru yönde olduğundan emin olun (yani, Okuyucu s'de A1 olarak işaretlenmiş etiketi buluntage, ardından mikroplakayı, A1 kuyusunun konumu köşeyle eşleşecek şekilde döndürün.tage çıkartma ile).
   5. Sahneye düz durduğundan emin olmak için mikroplakaya hafifçe bastırın. HCS sisteminde plakanın eşit olmayan şekilde dengelenmesi, görüntü alımında hatalara neden olabilir.
   6. Plaka yerine oturduktan sonra, Ctrl tuşunu basılı tutun, ardından yazılımdaki Plaka Yükleme/Boşaltma iletişim kutusunda Ctrl-OK'e tıklayın.
2. Görüntüleme parametrelerinin seçilmesi
   1. HCS görüntüleme sisteminde, Cellomics biyo-uygulamalar arayüzünde Hedef Aktivasyon modunu açın ve (a) nükleer boyama ve (b) DHE floresan probu veri toplama ile uyumlu iki kanallı kurulum protokolünü kullanarak yeni bir protokol oluşturun. Mevcut protokolde, sırasıyla (a) Hoechst 33342 nükleer boyama, (b) toplam ROS üretimi ve (c) süperoksit radikali tespiti için 386_BGSRS_BGSRS, 480_BGS_RS ve 386_BGS_RS filtreler kullanılmıştır. Bu filtrelerin seçimi, bu protokolün bir parçası olarak kullanılan her bir boyanın (DAPI ve DHE) emisyon özellikleri için spesifik örtüşme tarafından yönlendirildi.
      NOT: Filtrelerin adlandırma kuralı, örneğin 386-23_BGRFRN_BGRFRN, numunenin 23 nm bant genişliğine sahip 386 nm ışıkla uyarılmasını ve ardından mavi (B), yeşil (G), kırmızı (R), uzak kırmızı (FR) ve yakın kızılötesi (N) ışığı belirli dalga boyu aralıklarında geçiren bir dikroik filtreyi ifade eder ve 386_BGS_RS, dikroikten sonra BGS ve RS emisyon dalga boyu ışığını geçiren bir emisyon filtresini ifade eder.
   2. Gerektiğinde 10x veya 20x büyütme gibi yazılım protokolü arayüzünde görüntü alma işlemi için hedefleri belirtin.
   3. İstenen görüntüleme detayı seviyesine ve deney için gerekli çözünürlüklere bağlı olarak uygun objektif büyütmeyi seçin. Ancak, her hedefin çözünürlüğü sabittir. Daha yüksek çözünürlük ayrıntısı, platformdaki hedefin değiştirilmesini gerektirecektir. Mevcut protokolde, bu protokolde kullanılan yüksek içerikli tarama platformunun bir parçası olan 20x, 0.45 NA hedefi kullanılmaktadır.
      NOT: 20x objektif, görüntüleme çözünürlüğü ayrıntısı ile zaman içindeki ROS değişikliklerini yakalamak için gereken alım hızı arasında iyi bir dengeyi temsil eder. Daha yüksek büyütme hedefleri seçilebilir (örneğin, 40X), ancak bu, çekim sürelerinin artmasına yol açacaktır.
   4. Protokolün özel gereksinimlerine göre pozlama süresi, kamera gruplaması ve z-yığın aralığı gibi görüntü alma kamerasının pozlama ayarlarını belirtin.
      NOT: Maruz kalma süresi (genellikle milisaniye cinsinden), kullanılan belirli floroforların sinyal gücüne ve hassasiyetine bağlı olarak değişir. Bu aynı zamanda boya konsantrasyonuna ve boyama kalitesine bağlı olarak deneyden deneye biraz farklılık gösterebilir. Mevcut protokolde, edinme parametreleri şu şekilde sabitlenmiştir - Hedef % -% 35, görüntü alma modu - 1104 x 1104 (2x2 gruplama ile) ve objektif 20x, 0.45 NA. Bu parametreler belirli deney koşullarına göre ayarlanabilir.
3. Görüntüleme yapılandırma parametreleri
   NOT: Görüntüleme parametreleri ayarlandıktan sonra, yazılım arayüzü kullanılarak görüntü toplama işlemi başlatılabilir.
   1. Görüntü toplama parametreleri
      1. Cihazda bulunan farklı algoritmaları (optik - izoveri, sabit ve üçgen) kullanarak ilgilenilen birincil izleme nesnesini (hücrelerin çekirdeği) tanımlayın.
         NOT: Bu protokolde birincil nesnenin tanımlanması ve işaretlenmesi için izoveri yöntemi kullanılır.
      2. Nesneyi (varsa) şekil veya yoğunluk parametresine göre bölümlere ayırın.
      3. Birincil nesneyi, her hücre türüne özgü istenen boyut, şekil ve yoğunluk parametrelerine göre doğrulayın.
      4. Ardından, bu birincil nesnenin etrafındaki 'ilgi alanını' (ROI) tanımlayın.
         NOT: ROI, floresan boyanın yoğunluğunun hücre tipleri arasında tutarlı ve tekrarlanabilir olarak tanımlandığı konumu tanımlayan önemli bir veri toplama parametresidir. ROI, cihazın farklı kanallarındaki her bir birincil izleme nesnesi (yani bir hücre) için ölçülen temel parametreleri (boyanın yoğunluğu gibi) tanımlar. ROI, her hücrenin çekirdeğinin etrafında bir daire veya halka şeklinde tanımlanabilir. HCS yazılımı, otomatik bir şekilde bölümlere ayrılan ve analiz edilen her hücre için ROI limiti dahilinde kanal 2'deki DHE floresan boya işaretleyicisinin yoğunluğunu otomatik olarak elde eder.
      5. Birincil nesnenin (çekirdek) etrafına 20 μm'lik bir daire yerleştirin. Bu çalışmada 20 μm'lik mesafe, bu protokolde kullanılan çeşitli hücre hatlarının (HepG2, JHH-4 ve HUH-7) yaklaşık boyutlarına göre seçilmiştir. Hücrelerin etrafındaki 20 μm'lik halka ROI, floresan yoğunluğunu tutarlı ve tekrarlanabilir bir şekilde elde etti.
         NOT: Bir ROI seçiminde anahtar parametre, hücre alanını yeterince kapsama yeteneğidir; döngüsel ROI'nin boyutu hücre boyutuna bağlıdır. Daha büyük hücreler daha büyük bir yatırım getirisi gerektirebilir ve daha küçük bir yatırım getirisi için bunun tersi de geçerlidir. Bu parametreler, ilgilenilen her hücre tipi ve floresan boya için önceden belirlenmelidir.
4. Popülasyon karakterizasyonu ve depolanacak özellikleri seçme
   1. HCS görüntüleme protokolünde çeşitli toplama parametreleri tanımlandıktan sonra, HCS sistemini veri toplama moduna ayarlayın.
   2. Bu protokol için görüntü elde etme parametreleri şu şekilde ayarlandı: alan başına minimum 10 nesne (hücre) gereksinimi ile 1000 hücre/kuyu tarama sınırı.
      NOT: Her bir kuyucuk için değerlendirilen alan sayısı, 1000 sayısına ulaşan nihai hücre sayısına göre belirlenmiştir. HCS sistemi, 1000 hücre/kuyu hedef popülasyonunu elde edene kadar kuyu içinde çeşitli yerleri aramaya devam eder. Bu nedenle edinme hızı, 96 oyuklu plakanın her bir oyuğunda bulunan birleşmeye ve toplam hücre sayılarına bağlıdır. Mevcut protokolde, kanal 2'nin toplam ve ortalama yoğunluğu (süperoksit radikallerini ve toplam ROS üretimini temsil eder) daha sonraki aşağı akış analizleri için her bir kuyudan toplanmıştır.
5. Görüntü yakalama, işleme ve analiz
   1. Görüntü elde etme parametrelerini ayarladıktan ve sonlandırdıktan sonra, her 96 oyuklu plaka için tarama işlemini başlatın.
      NOT: Cellomics CX7 görüntüleme sistemi, hücreler içinde ROS üretimi de dahil olmak üzere çeşitli parametrelerin numunelerinin yüksek içerikli taranmasını ve otomatik analizini sağlar. ROS üretimine ek olarak, HCS sistemi, hücre morfolojisi, hücre altı lokalizasyonu ve ilgilenilen diğer birçok hücresel özellik gibi çeşitli parametreler hakkında ek değerli bilgiler sağlayabilir. Elde edilmek üzere optimize edildikten sonra, HCS görüntüleme platformu, hücre parametrelerinin sağlam bir şekilde kapsamlı, kalitatif ve kantitatif karakterizasyonuna olanak tanır.
   2. Tarama işlemi tamamlandıktan sonra, View Analysis yazılımını başlatın ve ek analiz için çeşitli nicel veri parametrelerini .csv bir formatta dışa aktarın.
   3. Üçüncü taraf yazılımları kullanarak, ek aşağı akış analizleri için ilgilenilen çeşitli nicel değerleri kopyalayıp yapıştırın.
      NOT: Mevcut protokolde,_H2O2ve menadion maruziyetlerine bağlı indüklenmiş oksidatif strese yanıt olarak DHE yoğunluk değerlerini analiz etmek için GraphPad Prism yazılımı kullanılmıştır.
6. Veri ve istatistiksel analiz
   1. Kanal 2'nin ortalama ortalama yoğunluğunu hesaplayın (toplam ROS değerlerini ve süperoksit radikallerini temsil eder).
      NOT: Yoğunluk değerlerini hesaplamak için yapılan tüm deneyler, her doz seviyesinde koşul başına 6 kopya ile üç kez tekrarlandı.
   2. Çeşitli test koşulları arasındaki yoğunluk değerlerindeki farklılıkları ölçmek için tek yönlü ANOVA veya t-testi gerçekleştirin.

Sonuçlar

Dihidroetidyum (DHE), hücre içi ROS durumları hakkında spesifik bilgi sağlayan süperokside duyarlı bir floresan boyadır. DHE boyası, sitoplazmada doğal olarak mavi floresan yayar. Bununla birlikte, süperoksit radikalleri ile etkileşime girdiğinde, kırmızı dalga boylarında (>550 nm) floresan yayan 2-hidroksietidiyuma dönüştürülür (Şekil 1). DHE boyası hücrelere ve çekirdeğe kolayca taşınır. Yayılan floresan, birçok laboratuvarda yaygın olarak bulunan bir flor...

Tartışmalar

Bu çalışmada, yüksek içerikli bir tarama sistemi üzerinde dihidroetidyum (DHE) floresan boyası kullanılarak süperoksit kaynaklı hücre içi reaktif oksijen türleri (ROS) üretimini değerlendirmek için bir protokol oluşturulmuştur. Literatürde mevcut olan mevcut protokollerin çoğu, ROS türlerini ölçmek için bir floresan görüntüleme probu olarak DCFH-DA'yı kullanır. Bununla birlikte, çok sayıda çalışma, DCFH-DA'nın hücre içi ROS ölçümü için ideal bir prob olmadığını göstermişti...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tubes	VWR	20170-038
96- well plate	Corning Costar	07-200-90
Cellomics Cx7	ThermoFisher	HCSDCX7LEDPRO
Collagen	Advanced Biomatrix	5056
DHE (Dihydroethidium)	ThermoFisher	D1168
DMEM	Sigma	6046
FBS	VWR	97068-085
GraphPad Prism	GraphPad	Version 6.0
HepG2 cell line	ATCC
Hoechst	ThermoFisher	33342
HUH7 cell line	ATCC
Hydrogen Peroxide	Sigma	88597
JHH4 cell line	ATCC
Menadione	Sigma	M5625