Dihidroetidyum (DHE) Floresan Boya Kullanılarak Reaktif Oksijen Türleri (ROS) Üretiminin Yüksek Verimli Tarama Değerlendirmesi

Özet

Bu protokol, yüksek verimli bir tarama yaklaşımı kullanarak bir floresan boya probu olarak dihidroetidyum (DHE) kullanarak hücre içi reaktif oksijen türlerini (ROS) ölçmek için yeni bir yöntemi açıklar. Protokol, üç farklı hepatoselüler karsinom hücre hattında hücre içi reaktif oksijen türlerinin (ROS) kantitatif değerlendirme yöntemlerini açıklar.

Özet

Reaktif oksijen türleri (ROS), fizyolojik ve patolojik süreçlerde hücresel metabolizmanın düzenlenmesinde anahtar rol oynar. Fizyolojik ROS üretimi, proliferasyon, sinyalleşme, apoptoz ve yaşlanma gibi normal hücresel fonksiyonların uzamsal ve zamansal modülasyonunda merkezi bir rol oynar. Buna karşılık, kronik ROS aşırı üretimi, diğerlerinin yanı sıra kanser, kardiyovasküler hastalık ve diyabet gibi geniş bir hastalık yelpazesinden sorumludur. ROS seviyelerinin doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçülmesi, normal hücresel işlevselliği anlamak için çok önemlidir. Hücre içi ROS türlerini karakterize etmek için floresan görüntüleme tabanlı yöntemler yaygın bir yaklaşımdır. Literatürdeki görüntüleme ROS protokollerinin çoğunda 2'-7'-diklorodihidrofloresein diasetat (DCFH-DA) boyası kullanılmaktadır. Bununla birlikte, bu boya, kullanımında ve yorumlanabilirliğinde önemli sınırlamalardan muzdariptir. Mevcut protokol, yüksek verimli bir ortamda toplam ROS üretimini ölçmek için alternatif bir yöntem olarak bir dihidroetidyum (DHE) floresan probunun kullanımını göstermektedir. ROS üretimini ölçmek ve ölçmek için yüksek verimli görüntüleme platformu CX7 Cellomics kullanıldı. Bu çalışma üç hepatoselüler kanser hücre hattında (HepG2, JHH4 ve HUH-7) gerçekleştirildi. Bu protokol, DHE çözeltisinin hazırlanması, hücrelerin DHE çözeltisi ile inkübasyonu ve ROS üretimini karakterize etmek için gerekli DHE yoğunluğunun ölçülmesi dahil olmak üzere, hücreler içindeki ROS'un değerlendirilmesinde yer alan çeşitli prosedürlerin derinlemesine bir tanımını sağlar. Bu protokol, DHE floresan boyanın, hücre içi ROS üretimini yüksek verimli bir şekilde karakterize etmek için sağlam ve tekrarlanabilir bir seçim olduğunu göstermektedir. ROS üretimini ölçmek için yüksek verimli yaklaşımların, toksikoloji, ilaç taraması ve kanser biyolojisi gibi çeşitli çalışmalarda yardımcı olması muhtemeldir.

Giriş

Reaktif oksijen türleri (ROS), hücrelerde normal hücresel metabolizmanın bir parçası olarak oluşan, doğal olarak oluşan, oldukça reaktif ve zamansal olarak kararsız kimyasal radikaller grubudur. ROS,^{hücrelerde meydana} gelen normal fizyolojik ve biyokimyasal süreçlerin modülasyonunda anahtar ve önemli bir rol oynar ^1,2. Hücrelerde ROS üretiminin ana kaynağı, normal biyoenerjetik döngünün bir parçası olarak mitokondriyal elektron taşıma zinciri (ETC) yolundandır. ROS üretiminin önemli ek kaynakları, hücrelerdeki hücresel NADPH oksidazlar gibi enzimatik reaksiyonları içerir. Gıda moleküllerinin (örneğin glikoz) m....

Protokol

1. Hücre kültürü

1. Test hücrelerini (HepG2, HUH7 ve JHH4 hepatoselüler karsinom hücreleri), kuyu başına 200 μL'lik bir nihai tohumlama hacminde 10.000 hücre / kuyu tohumlama yoğunluğunda 96 oyuklu bir plakaya tohumlayın.
   1. HepG2 hücrelerini kültürlemeden önce, 96 plaka kuyucuğunu oda sıcaklığında (RT) 2 saat boyunca tip IV kollajen (50 μg / mL) ile kaplayın. Stok kollajenin katılaşmasını önlemek için, stok çözeltisini buza yerleştirin ve ardından istenen konsantrasyona seyreltme işlemini başlatın.
   2. 2 saatlik bir inkübasyon süresinden sonra, fazla kollajeni aspire edin ve kuyucukları 1x PBS ile üç kez yıkayın.
<....

Tartışmalar

Bu çalışmada, yüksek içerikli bir tarama sistemi üzerinde dihidroetidyum (DHE) floresan boyası kullanılarak süperoksit kaynaklı hücre içi reaktif oksijen türleri (ROS) üretimini değerlendirmek için bir protokol oluşturulmuştur. Literatürde mevcut olan mevcut protokollerin çoğu, ROS türlerini ölçmek için bir floresan görüntüleme probu olarak DCFH-DA'yı kullanır. Bununla birlikte, çok sayıda çalışma, DCFH-DA'nın hücre içi ROS ölçümü için ideal bir prob olmadığını göstermişti.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tubes	VWR	20170-038
96- well plate	Corning Costar	07-200-90
Cellomics Cx7	ThermoFisher	HCSDCX7LEDPRO
Collagen	Advanced Biomatrix	5056
DHE (Dihydroethidium)	ThermoFisher	D1168
DMEM	Sigma	6046
FBS	VWR	97068-085
GraphPad Prism	GraphPad	Version 6.0
HepG2 cell line	ATCC
Hoechst	ThermoFisher	33342
HUH7 cell line	ATCC
Hydrogen Peroxide	Sigma	88597
JHH4 cell line	ATCC
Menadione	Sigma	M5625