Evaluación de cribado de alto rendimiento de la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) mediante colorante de fluorescencia de dihidroetidio (DHE)

Resumen

Este protocolo describe un método novedoso para cuantificar las especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares utilizando dihidroetidio (DHE) como sonda de colorante de fluorescencia utilizando un enfoque de cribado de alto rendimiento. El protocolo describe los métodos para la evaluación cuantitativa de las especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares en las tres líneas celulares diferentes de carcinoma hepatocelular.

Resumen

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) juegan un papel clave en la regulación del metabolismo celular en procesos fisiológicos y patológicos. La producción fisiológica de ROS desempeña un papel central en la modulación espacial y temporal de las funciones celulares normales, como la proliferación, la señalización, la apoptosis y la senescencia. Por el contrario, la sobreproducción crónica de ROS es responsable de un amplio espectro de enfermedades, como el cáncer, las enfermedades cardiovasculares y la diabetes, entre otras. Por lo tanto, cuantificar los niveles de ROS de una manera precisa y reproducible es esencial para comprender la funcionalidad celular normal. Los métodos basados en imágenes de fluorescencia para caracterizar las especies de ROS intracelulares son un enfoque común. Muchos de los protocolos de ROS por imágenes en la literatura utilizan el colorante de diacetato de 2'-7'-diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA). Sin embargo, este colorante adolece de importantes limitaciones en su uso e interpretabilidad. El protocolo actual demuestra el uso de una sonda fluorescente de dihidroetidio (DHE) como método alternativo para cuantificar la producción total de ROS en un entorno de alto rendimiento. La plataforma de imágenes de alto rendimiento, CX7 Cellomics, se utilizó para medir y cuantificar la producción de ROS. Este estudio se llevó a cabo en tres líneas celulares de cáncer hepatocelular: HepG2, JHH4 y HUH-7. Este protocolo proporciona una descripción detallada de los diversos procedimientos involucrados en la evaluación de ROS dentro de las células, que incluyen: preparación de la solución de DHE, incubación de células con solución de DHE y medición de la intensidad de DHE necesaria para caracterizar la producción de ROS. Este protocolo demuestra que el colorante fluorescente DHE es una opción robusta y reproducible para caracterizar la producción intracelular de ROS de una manera de alto rendimiento. Es probable que los enfoques de alto rendimiento para medir la producción de ROS sean útiles en una variedad de estudios, como toxicología, detección de fármacos y biología del cáncer.

Introducción

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) son un grupo de radicales químicos naturales, altamente reactivos y temporalmente inestables que se forman como parte del metabolismo celular normal de las células. Las ROS juegan un papel clave y esencial en la modulación de los procesos fisiológicos y bioquímicos normales que ocurren en las células ^1,2. La principal fuente de producción de ROS en las células proviene de la vía de la cadena de transporte de electrones mitocondriales (ETC) como parte del ciclo bioenergético normal. Las fuentes adicionales significativas de producción de ROS incluyen reacciones enzimáticas como las NADPH oxidasas celulares en las células. El metabolismo de las moléculas de los alimentos (por ejemplo, la glucosa) se produce a través de la vía de fosforilación oxidativa en la matriz mitocondrial. Un nivel basal de producción de ROS es esencial para regular los procesos normales de señalización celular fisiológica. Se sabe que muchas moléculas proteicas clave que forman parte de las vías de señalización metabólica de la glucosa (por ejemplo, Akt y PTEN) responden a los niveles intracelulares de ROS. Además, las ROS son producidas por varias enzimas intracelulares como la xantina oxidasa, la óxido nítrico sintasa y los constituyentes peroxisomales como parte de las vías enzimáticas celulares ^1,2. A diferencia de las fuentes naturales de ROS, ciertos factores ambientales, como los xenobióticos, los agentes infecciosos, la luz ultravioleta, la contaminación, el tabaquismo y la radiación, también conducen a una producción excesiva de ROS, que son un factor clave del estrés oxidativo intracelular ^1,3. El estrés oxidativo celular elevado puede causar daño a las biomoléculas nativas dentro de una célula, como los lípidos, las proteínas y el ADN, causando diversas enfermedades como cáncer, diabetes, enfermedades cardiovasculares, inflamación crónica y trastornos neurodegenerativos ^1,3,4. Por lo tanto, las mediciones precisas de ROS son esenciales para comprender los mecanismos celulares involucrados en la fisiopatología de la enfermedad inducida por el estrés oxidativo.

Debido a las cortas escalas de tiempo de producción y eliminación de ROS dentro de las células, las mediciones cuantitativas de varios radicales ROS siguen siendo un desafío. Se utilizan métodos como la resonancia paramagnética electrónica (EPR)⁵, la cromatografía líquida de alta presión (HPLC) y las imágenes basadas en sondas de fluorescencia para medir las diversas ROS⁶ celulares. Si bien métodos como la EPR y la HPLC proporcionan estimaciones cuantitativamente precisas, estos métodos implican la destrucción de la morfología espacial celular y suelen presentarse en forma de mediciones globales y masivas de una muestra. Por el contrario, los métodos basados en imágenes, como los métodos basados en sondas de fluorescencia, conservan la morfología celular y el contexto espacial de la generación de ROS. Sin embargo, la especificidad de varias sondas de fluorescencia para diferentes tipos de radicales ROS no ha sido bien establecida ^7,8. Varias sondas fluorescentes como el dihidroetidio (DHE), el diacetato de diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA), la dihidrorodamina (DHR), el dimetilantraceno (DMA), la 2,7 diclorodihidrofluresceína (DCFH), el 1,3-difenilisobenzofurano (DPBF) y MitoSox están disponibles para la detección de ROS comercialmente. En las últimas décadas, DHE, MitoSox y DCFH-DA son los colorantes fluorescentes comúnmente utilizados para medir ROS en células y tejidos ^8,9. El DCFH-DA es un colorante ampliamente utilizado para la detección de_H2O2intracelular y estrés oxidativo. A pesar de la popularidad del DCFH-DA, múltiples estudios previos han demostrado que no se puede utilizar de manera confiable para medir los niveles intracelulares de_H2O2y otras ROS ^{8,9,10,11,12,13,14}.

Por el contrario, la sonda fluorescente dihidroetidio (DHE) muestra una respuesta específica al radical superóxido intracelular (_O2^-). Si bien el radical superóxido es una de las muchas especies de ROS observadas en las células, es un radical importante involucrado en la reducción de metales de transición, la conversión en peroxinitrato y la formación de hidroperóxidos, entre otros efectos intracelulares. El DHE es absorbido rápidamente por las células y tiene una emisión de fluorescencia en el rango de longitud de onda roja¹⁵. Al reaccionar específicamente con el radical superóxido, el DHE forma un producto fluorescente rojo, 2-hidroxietidio (2-OH-E⁺). Por lo tanto, el DHE puede considerarse como una sonda específica para la detección de superóxido. Sin embargo, el DHE también puede sufrir oxidación inespecífica con ^ONOO- u ^OH., H₂O₂ y citocromo c para formar un segundo producto de fluorescencia, etidio E^+, que puede interferir con los niveles medidos de 2-OH-E⁺. Sin embargo, estos productos 2-OH E⁺ y E⁺, en combinación, representan una parte importante del total de especies celulares de ROS observadas dentro de una célula cuando se tiñe con DHE. E⁺ se intercala en el ADN, mejorando en gran medida su fluorescencia 8,9,10,11,13,14,15,16. Dado que los espectros de fluorescencia del etidio y el 2-hidroxietidio solo difieren ligeramente, la mayoría de los niveles de ROS observados en una célula secundaria a la producción de superóxido pueden detectarse y medirse utilizando productos de fluorescencia DHE. Estas especies de ROS se identifican utilizando la excitación de longitud de onda de 480 nm y la emisión de longitud de onda de 610 nm 15,16,17.

Además de elegir una sonda de detección de ROS fluorescente específica, es importante elegir un método de detección sensible para medir las ROS intracelulares. Por lo tanto, la evaluación precisa de los niveles intracelulares de ROS es clave para identificar los estados de equilibrio redox alterados que ocurren en células enfermas o células que han estado expuestas a diversos factores estresantes ambientales, como radiación, compuestos toxicológicos y agentes genotóxicos¹⁸. Dado que las ROS son un fenómeno común en las células que es responsable de regular una variedad de actividades de señalización celular, los métodos robustos de detección de ROS son esenciales. Para permitir una evaluación de alto rendimiento de la producción de ROS dentro de las células, este protocolo utiliza una plataforma de cribado de alto contenido (HCS) para medir las especies de ROS. El protocolo actual permite el análisis de alto rendimiento de la producción intracelular de ROS, que es de vital importancia en muchos estudios toxicológicos¹⁹. Este protocolo tiene como objetivo proporcionar una solución fácil y versátil para detectar y medir ROS intracelulares en células de carcinoma hepatocelular adherente. Los reactivos químicos de_H2,_O2 y menadiona se utilizan como potentes estimuladores de ROS para medir los niveles relativos de producción de ROS en un entorno controlado y de alto rendimiento. Este protocolo puede ajustarse para medir la producción de ROS en células adherentes y no adherentes en condiciones apropiadas, según sea necesario.

Protocolo

1. Cultivo celular

1. Siembre las células de prueba (células de carcinoma hepatocelular HepG2, HUH7 y JHH4) en una placa de 96 pocillos con una densidad de siembra de 10.000 células/pocillo en un volumen de siembra final de 200 μL por pocillo.
   1. Antes de cultivar las células HepG2, cubra los 96 pocillos de la placa con colágeno tipo IV (50 μg/mL) durante 2 h a temperatura ambiente (RT). Para evitar la solidificación del colágeno madre, coloque la solución madre en hielo y, posteriormente, inicie el proceso de dilución hasta la concentración deseada.
   2. Después de un período de incubación de 2 horas, aspire el exceso de colágeno y lave los pocillos tres veces con el PBS 1x.
2. Cultivar las células en el medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco durante la noche a 37 °C y una concentración de CO₂ del 5% en una incubadora humidificada.
3. Al día siguiente, o al alcanzar la confluencia del 80%-90%, lo que ocurra primero, tratar las células con_H2O₂ (sin tratar, 250 μM, 500 μM, 750 μM y 1000 μM) y Menadiona (sin tratar, 25 μM, 50 μM, 75 μM, 100 μM), respectivamente durante 30 min para inducir el estrés oxidativo representativo.
4. Alternativamente, opte por analizar las células con la sustancia problema deseada de elección capaz de inducir estrés oxidativo dentro de las células.

2. Preparación de la solución calurosa y diluida para la tinción de células con DHE

1. Prepare la solución madre de DHE (5 mg/ml o 15,9 mM) disolviendo 5 mg de DHE en 1 ml de DMSO.
2. Diluir la solución madre de DHE con agua autoclavada de doble destilación hasta una concentración final de 100 μM.
3. Para evitar el proceso de congelación y descongelación del colorante (que puede dañar las propiedades de fluorescencia con el tiempo), prepare varias alícuotas en tubos de centrífuga de 1,5 ml con una concentración de 100 μM y guárdelos a -20 °C.
4. Para lograr una concentración de trabajo final de 10 μM, utilice una alícuota de la concentración de DHE de 100 μM y dilúyala con medios DMEM precalentados.
   NOTA: La solución de trabajo debe prepararse fresca el día del experimento.
5. Agite la solución de tinte de fluorescencia de trabajo durante 5-10 s para garantizar una mezcla adecuada del tinte.

3. Proceso de tinción de DHE

1. Retire los medios que contienen drogas o sustancias de prueba de cada pocillo y lávelos suavemente una vez con 1x PBS o DMEM.
   NOTA: Al realizar los pasos de adición o lavado en el experimento, es crucial evitar el contacto directo entre las células y la pipeta. Esto se puede lograr pipeteando suavemente el PBS a lo largo de los lados de los pocillos para minimizar cualquier daño mecánico potencial a las celdas. Asegurarse de que la pipeta no toque directamente las células ayudará a mantener la integridad y viabilidad de la célula durante la duración del experimento.
2. Añadir 100 μL de medio DMEM que contenga 10 μM de DHE (solución de trabajo) en cada pocillo e incubar a 37 °C durante 30 min.
3. Después de un período de incubación de 30 minutos, retire los medios que contienen DHE y lave cada pocillo suavemente tres veces con la solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x. Esto se puede realizar con una pipeta multicanal para garantizar una respuesta rápida.
4. Agregue 200 μL de 1x PBS a cada pocillo con el colorante de tinción nuclear Hoechst 33342 durante 10 min en RT.
5. Retire la solución de tinción nuclear Hoechst 33342 del pocillo y añada 200 μl de 1x PBS a cada pocillo.
   NOTA: Para obtener células fijas, siga el mismo protocolo que para las células vivas, con un paso adicional de adición de PFA al 4% durante 5 minutos después del tratamiento y la tinción con DHE. Retire la solución de PFA y lave las celdas con el PBS 1x. A continuación, incube las células con el tinte nuclear durante 10 minutos.
6. Mueva la placa a la plataforma de cribado de alto contenido, a la microscopía de fluorescencia o al lector de placas para la adquisición de imágenes lo más rápido posible.

4. Adquisición de imágenes y medición de la intensidad

1. Carga de placas
   1. Abra el software de cribado de alto contenido (HCS) Cellomics CX7 para la adquisición de datos.
   2. Calibre cuidadosamente la plataforma de imágenes según las especificaciones del fabricante con anticipación con la placa específica de 96 pocillos de elección para evitar imágenes borrosas o borrosas en los datos.
      NOTA: Las placas de pocillos múltiples de varios proveedores pueden tener diferentes propiedades de material y pueden influir en la calidad de las imágenes finales obtenidas.
   3. Una vez calibrado, guarde los parámetros del sistema específicos de la marca de la placa en la base de datos del instrumento y reutilícelos para futuras adquisiciones de datos.
   4. Coloque con cuidado la placa con las muestras preparadas en la platina calentada del sistema de imágenes HCS. Asegúrese de que la placa esté bien colocada y en la orientación correcta para la obtención de imágenes en el soporte de la microplaca (es decir, ubique la etiqueta marcada como A1 en la platina del lector y, a continuación, gire la microplaca para que la ubicación del pocillo A1 coincida con la esquina con la pegatina).
   5. Presione suavemente la microplaca para asegurarse de que quede plana contra la platina. La nivelación desigual de la placa en el sistema HCS puede provocar errores en la adquisición de imágenes.
   6. Una vez que la placa esté en su lugar, mantenga presionada la tecla Ctrl y, a continuación, haga clic en Ctrl-OK en el cuadro de diálogo Carga/descarga de placas en el software.
2. Selección de parámetros de imagen
   1. En el sistema de adquisición de imágenes HCS, abra el modo de activación de objetivos en la interfaz de bioaplicaciones de Cellomics y cree un nuevo protocolo utilizando el protocolo de configuración de dos canales compatible con (a) tinción nuclear y (b) adquisición de datos de sonda de fluorescencia DHE. En el protocolo actual, los filtros 386_BGSRS_BGSRS, 480_BGS_RS y 386_BGS_RS se utilizaron para (a) la tinción nuclear Hoechst 33342, (b) la producción total de ROS y (c) la detección de radicales superóxido, respectivamente. La elección de estos filtros fue impulsada por la superposición específica de las propiedades de emisión de cada colorante (DAPI y DHE) utilizados como parte de este protocolo.
      NOTA: La convención de nomenclatura de los filtros, por ejemplo, 386-23_BGRFRN_BGRFRN, se refiere a la excitación de la muestra con luz de 386 nm con un ancho de banda de 23 nm, seguido de un filtro dicroico que pasa luz azul (B), verde (G), roja (R), roja lejana (FR) e infrarroja cercana (N) en rangos de longitud de onda específicos y el 386_BGS_RS se refiere a un filtro de emisión que pasa la luz de longitud de onda de emisión BGS y RS después de la luz dicroica.
   2. Especifique los objetivos para el proceso de adquisición de imágenes dentro de la interfaz del protocolo de software, como un aumento de 10x o 20x, según sea necesario.
   3. Elija el aumento del objetivo adecuado en función del nivel deseado de detalle de la imagen y las resoluciones necesarias para el experimento. Sin embargo, la resolución de cada objetivo es fija. Los detalles de mayor resolución requerirán cambiar el objetivo en la plataforma. En el protocolo actual, se utiliza un objetivo de 20x y 0,45 NA, que forma parte de la plataforma de cribado de alto contenido utilizada en este protocolo.
      NOTA: El objetivo de 20x representa un buen equilibrio entre el detalle de la resolución de la imagen y la velocidad de adquisición necesaria para capturar los cambios de ROS a lo largo del tiempo. Se pueden elegir objetivos de mayor aumento (por ejemplo, 40X), sin embargo, esto conducirá a un aumento de los tiempos de adquisición.
   4. Especifique la configuración de exposición de la cámara de adquisición de imágenes, como el tiempo de exposición, la agrupación de la cámara y el intervalo de pila z, de acuerdo con los requisitos específicos del protocolo.
      NOTA: El tiempo de exposición (a menudo en milisegundos) varía en función de la intensidad de la señal y la sensibilidad de los fluoróforos específicos utilizados. Esto también puede diferir ligeramente de un experimento a otro en función de la concentración de tinte y la calidad de la tinción. En el protocolo actual, los parámetros de adquisición se fijan de la siguiente manera: % objetivo: 35%, modo de adquisición de imágenes: 1104 x 1104 (con agrupación 2x2) y objetivo 20x, 0,45 NA. Estos parámetros pueden establecerse de acuerdo con las condiciones experimentales específicas.
3. Parámetros de configuración de imágenes
   NOTA: Una vez que se establecen los parámetros de imagen, el proceso de recopilación de imágenes puede iniciarse utilizando la interfaz del software.
   1. Parámetros de recopilación de imágenes
      1. Identifique el objeto de seguimiento primario de interés (el núcleo de las células) utilizando diferentes algoritmos disponibles en el instrumento (óptica: isodatos, fijos y triangulares).
         NOTA: En este protocolo se utiliza el método de isodatos para la identificación y marcado del objeto primario.
      2. Segmente el objeto (si lo hay) por forma o parámetro de intensidad.
      3. Valide el objeto principal en función de los parámetros de tamaño, forma e intensidad deseados únicos para cada tipo de célula.
      4. A continuación, defina la "región de interés" (ROI) alrededor de este objeto principal.
         NOTA: El ROI es un parámetro clave de la adquisición de datos que define la ubicación donde se identifica que la intensidad del colorante de fluorescencia es consistente y repetible en todos los tipos de células. El ROI define los parámetros clave (como la intensidad del colorante), que se miden para cada objeto de seguimiento primario (es decir, una celda) en diferentes canales del instrumento. El ROI puede definirse en forma de círculo o anillo alrededor del núcleo de cada célula. El software HCS obtiene automáticamente la intensidad del marcador de colorante de fluorescencia DHE en el canal 2 dentro del límite del ROI para cada célula que se segmenta y analiza de forma automatizada.
      5. Establezca un círculo de 20 μm alrededor del objeto primario (núcleo). En este estudio se eligió la distancia de 20 μm en función de los tamaños aproximados de las distintas líneas celulares utilizadas en este protocolo (HepG2, JHH-4 y HUH-7). El ROI del anillo de 20 μm alrededor de las células obtuvo la intensidad de fluorescencia de manera consistente y repetible.
         NOTA: El parámetro clave en la elección de un ROI es la capacidad de cubrir adecuadamente el área de la celda; el tamaño del ROI circular depende del tamaño de la celda. Las celdas más grandes pueden requerir un ROI mayor y viceversa para un ROI más pequeño. Estos parámetros deben determinarse con anticipación para cada tipo de célula y colorante de fluorescencia de interés.
4. Caracterización de la población y selección de características para almacenar
   1. Una vez definidos los distintos parámetros de adquisición en el protocolo de adquisición de imágenes HCS, configure el sistema HCS en el modo de adquisición de datos.
   2. Los parámetros de adquisición de imágenes para este protocolo se establecieron de la siguiente manera: un límite de escaneo de 1000 celdas/pocillo, con un requisito mínimo de 10 objetos (celdas) por campo.
      NOTA: El número de campos evaluados para cada pocillo se determinó en función del recuento final de células que alcanzó el número 1000. El sistema HCS continúa buscando en varios lugares dentro del pozo hasta obtener la población objetivo de 1000 células/pocillo. Por lo tanto, la velocidad de adquisición depende de la confluencia y del número total de células presentes en cada pocillo de la placa de 96 pocillos. En el protocolo actual, la intensidad total y media del canal 2 (que representa los radicales superóxido y la producción total de ROS) se recopilaron de cada pozo para realizar análisis posteriores.
5. Captura, procesamiento y análisis de imágenes
   1. Después de ajustar y finalizar los parámetros de adquisición de imágenes, inicie el proceso de escaneo para cada placa de 96 pocillos.
      NOTA: El sistema de adquisición de imágenes Cellomics CX7 permite el cribado de alto contenido y el análisis automatizado de muestras de una variedad de parámetros, incluida la producción de ROS dentro de las células de una manera de alto rendimiento. Además de la producción de ROS, el sistema HCS es capaz de proporcionar información valiosa adicional sobre varios parámetros, como la morfología celular, la localización subcelular y muchas otras características celulares de interés. Una vez optimizada para la adquisición, la plataforma de imágenes HCS permite una caracterización completa, cualitativa y cuantitativa de los parámetros celulares de una manera robusta.
   2. Una vez completado el proceso de escaneo, inicie el software View Analysis y exporte los distintos parámetros de datos cuantitativos en un formato .csv para un análisis adicional.
   3. Con el uso de software de terceros, copie y pegue los distintos valores cuantitativos de interés para realizar análisis posteriores adicionales.
      NOTA: En el protocolo actual, se utilizó el software GraphPad Prism para analizar los valores de intensidad de DHE en respuesta al estrés oxidativo inducido debido a la exposición a _H2O2y menadiona.
6. Análisis estadístico y de datos
   1. Calcular la intensidad media media del canal 2 (que representa los valores totales de ROS y los radicales superóxido).
      NOTA: Todos los experimentos para calcular los valores de intensidad se repitieron tres veces con 6 repeticiones por condición en cada nivel de dosificación.
   2. Realice un ANOVA de un factor o una prueba t para medir las diferencias en los valores de intensidad entre varias condiciones de prueba.

Resultados

El dihidroetidio (DHE) es un colorante de fluorescencia sensible al superóxido que proporciona información específica sobre los estados ROS intracelulares. El colorante DHE emite intrínsecamente fluorescencia azul en el citoplasma. Sin embargo, al interactuar con los radicales superóxido, se transforma en 2-hidroxietidio, que emite fluorescencia en las longitudes de onda rojas (>550 nm) (Figura 1). El colorante DHE se transporta fácilmente a las células y al núcleo. La fluorescencia ...

Discusión

En este estudio, se estableció un protocolo para evaluar la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares impulsadas por superóxido utilizando colorante de fluorescencia de dihidroetidio (DHE) en un sistema de cribado de alto contenido. La mayoría de los protocolos actuales disponibles en la literatura utilizan el DCFH-DA como sonda de imagen de fluorescencia para cuantificar las especies de ROS. Sin embargo, múltiples estudios han demostrado que el DCFH-DA no es una sonda ideal para la medición...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tubes	VWR	20170-038
96- well plate	Corning Costar	07-200-90
Cellomics Cx7	ThermoFisher	HCSDCX7LEDPRO
Collagen	Advanced Biomatrix	5056
DHE (Dihydroethidium)	ThermoFisher	D1168
DMEM	Sigma	6046
FBS	VWR	97068-085
GraphPad Prism	GraphPad	Version 6.0
HepG2 cell line	ATCC
Hoechst	ThermoFisher	33342
HUH7 cell line	ATCC
Hydrogen Peroxide	Sigma	88597
JHH4 cell line	ATCC
Menadione	Sigma	M5625