Evaluación de cribado de alto rendimiento de la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) mediante colorante de fluorescencia de dihidroetidio (DHE)

Resumen

Este protocolo describe un método novedoso para cuantificar las especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares utilizando dihidroetidio (DHE) como sonda de colorante de fluorescencia utilizando un enfoque de cribado de alto rendimiento. El protocolo describe los métodos para la evaluación cuantitativa de las especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares en las tres líneas celulares diferentes de carcinoma hepatocelular.

Resumen

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) juegan un papel clave en la regulación del metabolismo celular en procesos fisiológicos y patológicos. La producción fisiológica de ROS desempeña un papel central en la modulación espacial y temporal de las funciones celulares normales, como la proliferación, la señalización, la apoptosis y la senescencia. Por el contrario, la sobreproducción crónica de ROS es responsable de un amplio espectro de enfermedades, como el cáncer, las enfermedades cardiovasculares y la diabetes, entre otras. Por lo tanto, cuantificar los niveles de ROS de una manera precisa y reproducible es esencial para comprender la funcionalidad celular normal. Los métodos basados en imágenes de fluorescencia para caracterizar las especies de ROS intracelulares son un enfoque común. Muchos de los protocolos de ROS por imágenes en la literatura utilizan el colorante de diacetato de 2'-7'-diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA). Sin embargo, este colorante adolece de importantes limitaciones en su uso e interpretabilidad. El protocolo actual demuestra el uso de una sonda fluorescente de dihidroetidio (DHE) como método alternativo para cuantificar la producción total de ROS en un entorno de alto rendimiento. La plataforma de imágenes de alto rendimiento, CX7 Cellomics, se utilizó para medir y cuantificar la producción de ROS. Este estudio se llevó a cabo en tres líneas celulares de cáncer hepatocelular: HepG2, JHH4 y HUH-7. Este protocolo proporciona una descripción detallada de los diversos procedimientos involucrados en la evaluación de ROS dentro de las células, que incluyen: preparación de la solución de DHE, incubación de células con solución de DHE y medición de la intensidad de DHE necesaria para caracterizar la producción de ROS. Este protocolo demuestra que el colorante fluorescente DHE es una opción robusta y reproducible para caracterizar la producción intracelular de ROS de una manera de alto rendimiento. Es probable que los enfoques de alto rendimiento para medir la producción de ROS sean útiles en una variedad de estudios, como toxicología, detección de fármacos y biología del cáncer.

Introducción

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) son un grupo de radicales químicos naturales, altamente reactivos y temporalmente inestables que se forman como parte del metabolismo celular normal de las células. Las ROS juegan un papel clave y esencial en la modulación de los procesos fisiológicos y bioquímicos normales que ocurren en las células ^1,2. La principal fuente de producción de ROS en las células proviene de la vía de la cadena de transporte de electrones mitocondriales (ETC) como parte del ciclo bioenergético normal. Las fuentes adicionales significativas de producción de ROS incluyen reacciones enzimática....

Protocolo

1. Cultivo celular

1. Siembre las células de prueba (células de carcinoma hepatocelular HepG2, HUH7 y JHH4) en una placa de 96 pocillos con una densidad de siembra de 10.000 células/pocillo en un volumen de siembra final de 200 μL por pocillo.
   1. Antes de cultivar las células HepG2, cubra los 96 pocillos de la placa con colágeno tipo IV (50 μg/mL) durante 2 h a temperatura ambiente (RT). Para evitar la solidificación del colágeno madre, coloque la solución madre en hielo y, posteriormente, inicie el proceso de dilución hasta la concentración deseada.
   2. Después de un período de incubación de 2 horas, aspire el exceso de colágeno y l....

Discusión

En este estudio, se estableció un protocolo para evaluar la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares impulsadas por superóxido utilizando colorante de fluorescencia de dihidroetidio (DHE) en un sistema de cribado de alto contenido. La mayoría de los protocolos actuales disponibles en la literatura utilizan el DCFH-DA como sonda de imagen de fluorescencia para cuantificar las especies de ROS. Sin embargo, múltiples estudios han demostrado que el DCFH-DA no es una sonda ideal para la medición.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tubes	VWR	20170-038
96- well plate	Corning Costar	07-200-90
Cellomics Cx7	ThermoFisher	HCSDCX7LEDPRO
Collagen	Advanced Biomatrix	5056
DHE (Dihydroethidium)	ThermoFisher	D1168
DMEM	Sigma	6046
FBS	VWR	97068-085
GraphPad Prism	GraphPad	Version 6.0
HepG2 cell line	ATCC
Hoechst	ThermoFisher	33342
HUH7 cell line	ATCC
Hydrogen Peroxide	Sigma	88597
JHH4 cell line	ATCC
Menadione	Sigma	M5625