Dihydroethidium(DHE) 형광 염료를 사용한 활성 산소종(ROS) 생성의 고처리량 스크리닝 평가

요약

이 프로토콜은 고처리량 스크리닝 접근 방식을 사용하여 형광 염료 프로브로 디하이드로에티듐(DHE)을 사용하여 세포 내 활성 산소종(ROS)을 정량화하는 새로운 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 세 가지 서로 다른 간세포 암종 세포주에서 세포 내 활성 산소종(ROS)의 정량적 평가 방법을 설명합니다.

초록

활성산소종(ROS)은 생리학적 및 병리학적 과정에서 세포 대사를 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 생리적 ROS 생산은 증식, 신호 전달, 세포 사멸 및 노화와 같은 정상적인 세포 기능의 공간적, 시간적 조절에 중심적인 역할을 합니다. 대조적으로, 만성 ROS 과잉 생산은 암, 심혈관 질환 및 당뇨병과 같은 광범위한 질병의 원인이 됩니다. 따라서 ROS 수준을 정확하고 재현 가능한 방식으로 정량화하는 것은 정상적인 세포 기능을 이해하는 데 필수적입니다. 세포 내 ROS 종을 특성화하기 위한 형광 이미징 기반 방법은 일반적인 접근 방식입니다. 문헌에 있는 많은 이미징 ROS 프로토콜은 2'-7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA) 염료를 사용합니다. 그러나 이 염료는 사용법과 해석 가능성에 상당한 제한이 있습니다. 현재 프로토콜은 고처리량 설정에서 총 ROS 생산량을 정량화하기 위한 대체 방법으로 디하이드로에티듐(DHE) 형광 프로브를 사용하는 방법을 보여줍니다. 고처리량 이미징 플랫폼인 CX7 Cellomics를 사용하여 ROS 생산량을 측정하고 정량화했습니다. 이 연구는 HepG2, JHH4 및 HUH-7의 세 가지 간세포암 세포주에서 수행되었습니다. 이 프로토콜은 DHE 용액 준비, DHE 용액을 사용한 세포 배양 및 ROS 생산을 특성화하는 데 필요한 DHE 강도 측정을 포함하여 세포 내 ROS 평가와 관련된 다양한 절차에 대한 심층적인 설명을 제공합니다. 이 프로토콜은 DHE 형광 염료가 고처리량 방식으로 세포 내 ROS 생산을 특성화하기 위한 강력하고 재현 가능한 선택임을 보여줍니다. ROS 생산을 측정하기 위한 고처리량 접근법은 독성학, 약물 스크리닝 및 암 생물학과 같은 다양한 연구에 도움이 될 수 있습니다.

서문

활성산소종(ROS)은 세포의 정상적인 세포 대사의 일부로 형성되는 자연적으로 발생하고 반응성이 높으며 일시적으로 불안정한 화학 라디칼 그룹입니다. ROS는 세포 ^1,2에서 발생하는 정상적인 생리학적 및 생화학적 과정의 조절에 핵심적이고 필수적인 역할을 합니다. 세포에서 ROS 생산의 주요 원천은 정상적인 생체 에너지 주기의 일부인 미토콘드리아 전자 수송 사슬(ETC) 경로에서 비롯됩니다. ROS 생산의 중요한 추가 소스에는 세포 내 세포 NADPH 산화효소와 같은 효소 반응이 포함됩니다. 식품 분자(예: 포도당)의 대사는 미토콘드리아 기질의 산화적 인산화 경로를 통해 발생합니다. ROS 생산의 기본 수준은 정상적인 생리적 세포 신호 전달 과정을 조절하는 데 필수적입니다. 포도당 대사 신호 전달 경로(예: Akt 및 PTEN)의 일부인 많은 주요 단백질 분자는 세포 내 ROS 수준에 반응하는 것으로 알려져 있습니다. 또한 ROS는 세포 효소 경로의 일부로서 크산틴 산화효소, 산화질소 합성효소 및 과산화솜 성분과 같은 다양한 세포 내 효소에 의해 생성됩니다 ^1,2. ROS의 천연 공급원과....

프로토콜

1. 세포 배양

1. 테스트 세포(HepG2, HUH7 및 JHH4 간세포 암종 세포)를 웰당 200μL의 최종 파종 부피에서 10,000 세포/웰의 파종 밀도로 96웰 플레이트에 파종합니다.
   1. HepG2 세포를 배양하기 전에 96개의 플레이트 웰을 IV형 콜라겐(50μg/mL)으로 실온(RT)에서 2시간 동안 코팅합니다. 원주 콜라겐의 응고를 방지하려면 원액을 얼음에 넣은 후 원하는 농도로 희석 과정을 시작합니다.
   2. 2시간의 배양 기간 후 여분의 콜라겐을 흡인하고 1x PBS로 웰을 세 번 씻습니다.
2. 가습 인큐베이터에서 37°C 및 5%_CO2 농도로 밤새 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM)에서 세포를 배양합니다.
3. 다음날 또는 80 % -90 % 밀도에 도달하면 세포를 H₂O₂ (미처리, 250 μM, 500 μM, 750 μM 및 1000 μM) 및 Menadione (미처리, 25 μM, 50 μM, 75 μM, 100 μM)으로 각각 30 분 동안 처리하여 대표적인 산화 스트레스를 유도합니다.
4. 또는 세포 내에서 산화 스트레스를 유도할 수 있는 원하는 테스트 물질로 세포....

토론

이 연구에서는 디하이드로에티듐(DHE) 형광 염료를 사용하여 과산화물 구동 세포 내 활성 산소종(ROS) 생산을 평가하는 프로토콜을 고함량 스크리닝 시스템에 설정했습니다. 문헌에서 사용할 수 있는 대부분의 현재 프로토콜은 ROS 종을 정량화하기 위한 형광 이미징 프로브로 DCFH-DA를 사용합니다. 그러나 여러 연구에 따르면 DCFH-DA는 세포 내 ROS 측정에 이상적인 프로브가 아닙니다. 프로브로서 DCFH-DA.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tubes	VWR	20170-038
96- well plate	Corning Costar	07-200-90
Cellomics Cx7	ThermoFisher	HCSDCX7LEDPRO
Collagen	Advanced Biomatrix	5056
DHE (Dihydroethidium)	ThermoFisher	D1168
DMEM	Sigma	6046
FBS	VWR	97068-085
GraphPad Prism	GraphPad	Version 6.0
HepG2 cell line	ATCC
Hoechst	ThermoFisher	33342
HUH7 cell line	ATCC
Hydrogen Peroxide	Sigma	88597
JHH4 cell line	ATCC
Menadione	Sigma	M5625