Dihydroethidium(DHE) 형광 염료를 사용한 활성 산소종(ROS) 생성의 고처리량 스크리닝 평가

요약

이 프로토콜은 고처리량 스크리닝 접근 방식을 사용하여 형광 염료 프로브로 디하이드로에티듐(DHE)을 사용하여 세포 내 활성 산소종(ROS)을 정량화하는 새로운 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 세 가지 서로 다른 간세포 암종 세포주에서 세포 내 활성 산소종(ROS)의 정량적 평가 방법을 설명합니다.

초록

활성산소종(ROS)은 생리학적 및 병리학적 과정에서 세포 대사를 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 생리적 ROS 생산은 증식, 신호 전달, 세포 사멸 및 노화와 같은 정상적인 세포 기능의 공간적, 시간적 조절에 중심적인 역할을 합니다. 대조적으로, 만성 ROS 과잉 생산은 암, 심혈관 질환 및 당뇨병과 같은 광범위한 질병의 원인이 됩니다. 따라서 ROS 수준을 정확하고 재현 가능한 방식으로 정량화하는 것은 정상적인 세포 기능을 이해하는 데 필수적입니다. 세포 내 ROS 종을 특성화하기 위한 형광 이미징 기반 방법은 일반적인 접근 방식입니다. 문헌에 있는 많은 이미징 ROS 프로토콜은 2'-7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA) 염료를 사용합니다. 그러나 이 염료는 사용법과 해석 가능성에 상당한 제한이 있습니다. 현재 프로토콜은 고처리량 설정에서 총 ROS 생산량을 정량화하기 위한 대체 방법으로 디하이드로에티듐(DHE) 형광 프로브를 사용하는 방법을 보여줍니다. 고처리량 이미징 플랫폼인 CX7 Cellomics를 사용하여 ROS 생산량을 측정하고 정량화했습니다. 이 연구는 HepG2, JHH4 및 HUH-7의 세 가지 간세포암 세포주에서 수행되었습니다. 이 프로토콜은 DHE 용액 준비, DHE 용액을 사용한 세포 배양 및 ROS 생산을 특성화하는 데 필요한 DHE 강도 측정을 포함하여 세포 내 ROS 평가와 관련된 다양한 절차에 대한 심층적인 설명을 제공합니다. 이 프로토콜은 DHE 형광 염료가 고처리량 방식으로 세포 내 ROS 생산을 특성화하기 위한 강력하고 재현 가능한 선택임을 보여줍니다. ROS 생산을 측정하기 위한 고처리량 접근법은 독성학, 약물 스크리닝 및 암 생물학과 같은 다양한 연구에 도움이 될 수 있습니다.

서문

활성산소종(ROS)은 세포의 정상적인 세포 대사의 일부로 형성되는 자연적으로 발생하고 반응성이 높으며 일시적으로 불안정한 화학 라디칼 그룹입니다. ROS는 세포 ^1,2에서 발생하는 정상적인 생리학적 및 생화학적 과정의 조절에 핵심적이고 필수적인 역할을 합니다. 세포에서 ROS 생산의 주요 원천은 정상적인 생체 에너지 주기의 일부인 미토콘드리아 전자 수송 사슬(ETC) 경로에서 비롯됩니다. ROS 생산의 중요한 추가 소스에는 세포 내 세포 NADPH 산화효소와 같은 효소 반응이 포함됩니다. 식품 분자(예: 포도당)의 대사는 미토콘드리아 기질의 산화적 인산화 경로를 통해 발생합니다. ROS 생산의 기본 수준은 정상적인 생리적 세포 신호 전달 과정을 조절하는 데 필수적입니다. 포도당 대사 신호 전달 경로(예: Akt 및 PTEN)의 일부인 많은 주요 단백질 분자는 세포 내 ROS 수준에 반응하는 것으로 알려져 있습니다. 또한 ROS는 세포 효소 경로의 일부로서 크산틴 산화효소, 산화질소 합성효소 및 과산화솜 성분과 같은 다양한 세포 내 효소에 의해 생성됩니다 ^1,2. ROS의 천연 공급원과 달리 생체 이물, 감염원, 자외선, 오염, 흡연 및 방사선과 같은 특정 환경 요인은 세포 내 산화 스트레스의 핵심 동인인 ROS의 과도한 생성을 유발합니다 ^1,3. 세포 산화 스트레스가 증가하면 지질, 단백질, DNA와 같은 세포 내부의 생체 분자가 손상되어 암, 당뇨병, 심혈관 질환, 만성 염증 및 신경 퇴행성 질환과 같은 다양한 질병을 유발할 수 있습니다 ^1,3,4. 따라서 ROS의 정확한 측정은 산화 스트레스 유발 질병 병태생리학과 관련된 세포 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다.

세포 내에서 ROS 생성 및 제거의 짧은 시간 척도로 인해 다양한 ROS 라디칼의 정량적 측정은 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다. 전자 상자성 공명(EPR)⁵, 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 형광 프로브 기반 이미징과 같은 방법을 사용하여 다양한 세포 ROS⁶를 측정합니다. EPR 및 HPLC와 같은 방법은 정량적으로 정확한 추정치를 산출하지만, 이러한 방법은 세포 공간 형태학의 파괴를 수반하며 일반적으로 샘플의 전체 및 대량 측정 형태입니다. 대조적으로, 형광 프로브 기반 방법과 같은 이미징 기반 방법은 ROS 생성의 세포 형태 및 공간적 맥락을 유지합니다. 그러나 다양한 유형의 ROS 라디칼에 대한 다양한 형광 프로브의 특이성은 잘 확립되지 않았습니다 ^7,8. 디하이드로에티듐(DHE), 디클로로디하이드로플루오레세인 다이아세테이트(DCFH-DA), 디하이드로로로다민(DHR), 디메틸 안트라센(DMA), 2,7 디클로로디하이드로플루레세인(DCFH), 1,3-디페닐이소벤조푸란(DPBF) 및 MitoSox와 같은 여러 형광 프로브를 ROS 검출에 상업적으로 사용할 수 있습니다. 지난 수십 년 동안 DHE, MitoSox 및 DCFH-DA는 세포 및 조직에서 ROS를 측정하는 데 일반적으로 사용되는 형광 염료입니다 ^8,9. DCFH-DA는 세포 내 H₂O₂ 및 산화 스트레스를 검출하는 데 널리 사용되는 염료입니다. DCFH-DA의 인기에도 불구하고, 이전의 여러 연구에서는 세포 내 H₂O₂ 및 기타 ROS 수준 8,9,10,11,12,13,14를 측정하는 데 안정적으로 사용할 수 없다는 것을 보여주었습니다.

대조적으로, 형광 프로브 디하이드로에티듐(DHE)은 세포 내 과산화물 라디칼(_O2^-)에 대한 특이적 반응을 나타낸다. 과산화물 라디칼은 세포에서 관찰되는 많은 ROS 종 중 하나이지만, 다른 세포 내 효과 중에서도 전이 금속의 환원, 과산화질산염으로의 전환, 하이드로퍼옥사이드의 형성에 관여하는 중요한 라디칼입니다. DHE는 세포에 의해 빠르게 흡수되고 적색 파장 범위¹⁵의 형광 방출을 갖습니다. 과산화물 라디칼과 특이적으로 반응하면 DHE는 적색 형광 생성물인 2-하이드록시 에티듐(2-OH-E⁺)을 형성합니다. 따라서, DHE는 과산화물 검출을 위한 특정 프로브로 간주될 수 있다. 그러나 DHE는 ^{ONOO- 또는 OH}., H₂O₂ 및 시토크롬 c와 함께 비특이적 산화를 거쳐 두 번째 형광 생성물인 에티듐 E⁺를 형성할 수 있으며^, 이는 측정된 2-OH-E⁺ 수준을 방해할 수 있습니다. 그러나 이러한 2-OH E⁺ 및 E⁺ 산물은 DHE로 염색할 때 세포 내에서 관찰되는 전체 세포 ROS 종의 주요 부분을 나타냅니다. E⁺는 DNA에 삽입되어 형광 8,9,10,11,13,14,15,16을 크게 향상시킵니다. 에티듐과 2-하이드록시 에티듐의 형광 스펙트럼은 약간만 다르기 때문에 과산화물 생산에 이차적인 세포에서 볼 수 있는 대부분의 ROS 수준은 DHE 형광 제품을 사용하여 검출 및 측정할 수 있습니다. 이러한 ROS 종은 480nm 파장 여기 및 610nm 파장 방출 15,16,17을 사용하여 식별됩니다.

특정 형광 ROS 검출 프로브를 선택하는 것 외에도 세포 내 ROS를 측정하기 위해 민감한 검출 방법을 선택하는 것이 중요합니다. 따라서 세포 내 ROS 수준의 정확한 평가는 방사선, 독성 화합물 및 유전 독성 물질과 같은 다양한 환경 스트레스 요인에 노출된 병든 세포 또는 세포에서 발생하는 교란된 산화 환원 균형 상태를 식별하는 데 중요합니다¹⁸. ROS는 다양한 세포 신호 전달 활동을 조절하는 세포에서 흔히 발생하는 현상이기 때문에 ROS를 검출하는 강력한 방법이 필수적입니다. 세포 내 ROS 생산에 대한 이러한 고처리량 평가를 가능하게 하기 위해 이 프로토콜은 HCS(High-Content Screening) 플랫폼을 사용하여 ROS 종을 측정합니다. 현재 프로토콜은 세포 내 ROS 생산의 고처리량 분석을 가능하게 하며, 이는 많은 독성학 연구에서 매우 중요합니다¹⁹. 이 프로토콜은 부착성 간세포 암종 세포에서 세포 내 ROS를 검출하고 측정하기 위한 쉽고 다양한 솔루션을 제공하는 것을 목표로 합니다. H₂O₂ 및 메나 디온의 화학 시약은 강력한 ROS 자극제로 사용되어 제어 된 높은 처리량 설정에서 ROS 생산의 상대적 수준을 측정합니다. 이 프로토콜은 필요에 따라 적절한 조건에서 부착 및 비부착 세포의 ROS 생성을 측정하도록 미세 조정될 수 있습니다.

프로토콜

1. 세포 배양

1. 테스트 세포(HepG2, HUH7 및 JHH4 간세포 암종 세포)를 웰당 200μL의 최종 파종 부피에서 10,000 세포/웰의 파종 밀도로 96웰 플레이트에 파종합니다.
   1. HepG2 세포를 배양하기 전에 96개의 플레이트 웰을 IV형 콜라겐(50μg/mL)으로 실온(RT)에서 2시간 동안 코팅합니다. 원주 콜라겐의 응고를 방지하려면 원액을 얼음에 넣은 후 원하는 농도로 희석 과정을 시작합니다.
   2. 2시간의 배양 기간 후 여분의 콜라겐을 흡인하고 1x PBS로 웰을 세 번 씻습니다.
2. 가습 인큐베이터에서 37°C 및 5%_CO2 농도로 밤새 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM)에서 세포를 배양합니다.
3. 다음날 또는 80 % -90 % 밀도에 도달하면 세포를 H₂O₂ (미처리, 250 μM, 500 μM, 750 μM 및 1000 μM) 및 Menadione (미처리, 25 μM, 50 μM, 75 μM, 100 μM)으로 각각 30 분 동안 처리하여 대표적인 산화 스트레스를 유도합니다.
4. 또는 세포 내에서 산화 스트레스를 유도할 수 있는 원하는 테스트 물질로 세포를 테스트하도록 선택합니다.

2. 세포의 DHE 염색을 위한 원액 및 희석 용액 준비

1. 5mg의 DHE를 DMSO 1mL에 용해시켜 DHE 원액(5mg/mL 또는 15.9mM)을 준비합니다.
2. DHE 원액을 이중 증류된 오토클레이브수로 최종 100μM 농도로 희석합니다.
3. 염료의 동결 및 해동 과정(시간이 지남에 따라 형광 특성을 손상시킬 수 있음)을 피하려면 100μM 농도의 1.5mL 원심분리 튜브에 여러 부분 표본을 준비하고 -20°C에서 보관합니다.
4. 10μM의 최종 작업 농도를 얻으려면 100μM DHE 농도의 부분 표본을 사용하고 미리 데워진 DMEM 배지로 희석합니다.
   알림: 작업 용액은 실험 당일에 신선하게 준비해야 합니다.
5. 염료의 적절한 혼합을 보장하기 위해 5-10초 동안 작동하는 형광 염료 용액을 소용돌이칩니다.

3. DHE 염색 공정

1. 각 웰에서 약물 또는 테스트 물질이 함유된 배지를 제거하고 1x PBS 또는 DMEM으로 한 번 부드럽게 세척합니다.
   참고: 실험에서 첨가 또는 세척 단계를 수행할 때 세포와 피펫터 사이의 직접적인 접촉을 피하는 것이 중요합니다. 이는 셀에 대한 잠재적인 기계적 손상을 최소화하기 위해 웰 측면을 따라 PBS를 부드럽게 피펫팅하여 달성할 수 있습니다. 피펫터가 세포에 직접 닿지 않도록 하면 실험 기간 동안 세포 무결성과 생존력을 유지하는 데 도움이 됩니다.
2. 10μM DHE(작업 용액)가 포함된 100μL의 DMEM 배지를 각 웰에 넣고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
3. 30분 배양 기간 후 DHE 함유 배지를 제거하고 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 각각 부드럽게 세 번 잘 세척합니다. 이는 신속한 처리를 보장하기 위해 다중 채널 피펫터로 수행할 수 있습니다.
4. 200μL의 1x PBS를 Hoechst 33342 핵 염색 염료로 각 웰에 RT에서 10분 동안 추가합니다.
5. 웰에서 Hoechst 33342 핵 염색 용액을 제거하고 각 웰에 200μL의 1x PBS를 추가합니다.
   참고: 고정 세포를 얻으려면 살아있는 세포와 동일한 프로토콜을 따르고, 처리 후 5분 동안 4% PFA를 추가하고 DHE 염색을 하는 한 단계를 추가로 수행합니다. PFA 용액을 제거하고 1x PBS로 셀을 세척합니다. 그런 다음 핵 염색 염료로 세포를 10분 동안 배양합니다.
6. 가능한 한 빨리 이미지를 획득하기 위해 플레이트를 high-content screening 플랫폼, fluorescence microscopy 또는 plate reader로 옮깁니다.

4. 이미지 획득 및 강도 측정

1. 플레이트 로딩
   1. 데이터 수집을 위해 Cellomics CX7 High-Content Screening(HCS) 소프트웨어를 엽니다.
   2. 데이터의 흐릿하거나 흐릿한 이미지를 방지하기 위해 선택한 특정 96웰 플레이트를 사용하여 제조업체의 사양에 따라 이미징 플랫폼을 미리 신중하게 보정합니다.
      참고: 다양한 공급업체의 멀티웰 플레이트는 서로 다른 재료 특성을 가질 수 있으며 얻은 최종 이미지의 품질에 영향을 줄 수 있습니다.
   3. 교정이 완료되면 플레이트 브랜드와 관련된 시스템 파라미터를 기기 데이터베이스에 저장하고 향후 데이터 수집에 재사용할 수 있습니다.
   4. 준비된 샘플이 있는 플레이트를 HCS 이미징 시스템의 가열된 스테이지에 조심스럽게 놓습니다. 플레이트가 마이크로플레이트 홀더에 이미징을 위해 올바른 방향으로 단단히 배치되어 있는지 확인합니다(즉, 리더 스테이지에서 A1로 표시된 라벨을 찾은 다음 웰 A1의 위치가 스티커와 모서리와 일치하도록 마이크로플레이트를 회전).
   5. 마이크로플레이트를 부드럽게 눌러 s에 평평하게 놓이도록 합니다.tage. HCS 시스템에서 플레이트의 수평이 고르지 않으면 이미지 획득에 오류가 발생할 수 있습니다.
   6. 플레이트가 제자리에 놓인 후 Ctrl 키를 누른 상태에서 소프트웨어의 플레이트 로드/언로드 대화상자에서 Ctrl-OK 를 클릭합니다.
2. 이미징 파라미터 선택
   1. HCS 이미징 시스템에서 Cellomics 바이오 애플리케이션 인터페이스의 Target Activation 모드를 열고 (a) 핵 염색 및 (b) DHE 형광 프로브 데이터 수집과 호환되는 2채널 설정 프로토콜을 사용하여 새 프로토콜을 생성합니다. 현재 프로토콜에서 필터 386_BGSRS_BGSRS, 480_BGS_RS 및 386_BGS_RS는 각각 (a) Hoechst 33342 핵 염색, (b) 총 ROS 생산 및 (c) 과산화물 라디칼 검출에 사용되었습니다. 이러한 필터의 선택은 이 프로토콜의 일부로 사용되는 각 염료(DAPI 및 DHE)의 방출 특성에 대한 특정 중복에 의해 주도되었습니다.
      참고: 필터의 명명 규칙(예: 386-23_BGRFRN_BGRFRN)은 23nm 대역폭의 386nm 광으로 샘플을 여기한 다음 특정 파장 범위에서 청색(B), 녹색(G), 적색(R), 원적외선(FR) 및 근적외선(N) 빛을 통과시키는 이색성 필터를 의미하며 386_BGS_RS는 이색성 이후에 BGS 및 RS 방출 파장을 통과시키는 방출 필터를 나타냅니다.
   2. 필요에 따라 소프트웨어 프로토콜 인터페이스 내에서 이미지 획득 프로세스의 목표(예: 10x 또는 20x 배율)를 지정합니다.
   3. 실험에 필요한 이미징 세부 사항 및 해상도의 원하는 수준에 따라 적절한 대물렌즈 배율을 선택합니다. 그러나 각 목표의 해상도는 고정되어 있습니다. 해상도가 높을수록 플랫폼에서 대물렌즈를 변경해야 합니다. 현재 프로토콜에서는 20x, 0.45 NA 대물렌즈가 사용되며, 이는 이 프로토콜에 사용되는 high-content screening 플랫폼의 일부입니다.
      참고: 20x 대물렌즈는 이미징 해상도 세부 사항과 시간 경과에 따른 ROS 변화를 캡처하는 데 필요한 획득 속도 간의 적절한 균형을 나타냅니다. 더 높은 배율의 대물렌즈(예: 40X)를 선택할 수 있지만, 이로 인해 획득 시간이 늘어납니다.
   4. 프로토콜의 특정 요구 사항에 따라 노출 시간, 카메라 비닝, z-stack 간격과 같은 이미지 수집 카메라의 노출 설정을 지정합니다.
      참고: 노출 시간(종종 밀리초 단위)은 사용된 특정 형광단의 신호 강도와 감도에 따라 다릅니다. 이것은 또한 염료 농도와 염색 품질에 따라 실험마다 약간 다를 수 있습니다. 현재 프로토콜에서 획득 매개변수는 목표 % - 35%, 이미지 획득 모드 - 1104 x 1104(2x2 비닝 포함) 및 목표 20x, 0.45NA로 고정되어 있습니다. 이러한 매개변수는 특정 실험 조건에 따라 설정될 수 있습니다.
3. 이미징 구성 매개 변수
   알림: 이미징 매개변수가 설정되면 소프트웨어 인터페이스를 사용하여 이미지 수집 프로세스를 시작할 수 있습니다.
   1. 이미지 수집 매개 변수
      1. 기기에서 사용할 수 있는 다양한 알고리즘(광학 - isodata, fixed 및 triangle)을 사용하여 관심 있는 주요 추적 대상(세포의 핵)을 식별합니다.
         참고: 기본 개체의 식별 및 표시를 위한 isodata 방법이 이 프로토콜에서 사용됩니다.
      2. 물체(있는 경우)를 모양 또는 강도 매개변수로 분할합니다.
      3. 각 세포 유형에 고유한 원하는 크기, 모양 및 강도 매개변수를 기반으로 기본 개체를 검증합니다.
      4. 그런 다음, 이 기본 객체 주변의 '관심 영역'(ROI)을 정의합니다.
         참고: ROI는 형광 염료의 강도가 세포 유형 전반에 걸쳐 일관되고 반복 가능한 것으로 식별되는 위치를 정의하는 데이터 수집의 핵심 파라미터입니다. ROI는 주요 파라미터(예: 염료의 강도)를 정의하며, 이는 기기의 서로 다른 채널에서 각 기본 추적 객체(즉, 셀)에 대해 측정됩니다. ROI는 각 세포의 핵 주위에 원 또는 고리의 형태로 정의될 수 있습니다. HCS 소프트웨어는 자동화된 방식으로 분할 및 분석되는 각 셀에 대한 ROI 한계 내에서 채널 2에서 DHE 형광 염료 마커의 강도를 자동으로 얻습니다.
      5. 기본 물체(핵) 주위에 20μm 원을 설정합니다. 이 연구에서는 이 프로토콜에 사용된 다양한 세포주(HepG2, JHH-4 및 HUH-7)의 대략적인 크기를 기반으로 20μm의 거리를 선택했습니다. 세포 주위의 20μm 고리 ROI는 일관되고 반복 가능한 방식으로 형광 강도를 얻었습니다.
         알림: ROI를 선택할 때 핵심 매개변수는 셀 영역을 적절하게 커버할 수 있는 능력입니다. 원형 ROI의 크기는 셀 크기에 따라 달라집니다. 셀이 클수록 ROI가 더 클 수 있으며 ROI가 작을수록 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 이러한 파라미터는 각 세포 유형 및 관심 형광 염료에 대해 미리 결정해야 합니다.
4. 모집단 특성화 및 저장할 피처 선택
   1. HCS 이미징 프로토콜에서 다양한 수집 파라미터가 정의되면 HCS 시스템을 데이터 수집 모드로 설정합니다.
   2. 이 프로토콜에 대한 이미지 획득 매개변수는 다음과 같이 설정되었습니다: 스캔 제한은 1000 셀/웰, 필드당 최소 요구 사항은 10개의 개체(셀)입니다.
      참고: 각 웰에 대해 평가된 필드 수는 숫자 1000에 도달하는 최종 셀 수를 기준으로 결정되었습니다. HCS 시스템은 1000 세포/웰의 목표 모집단을 얻을 때까지 웰 내의 다양한 위치를 계속 검색합니다. 따라서 획득 속도는 96웰 플레이트의 각 웰에 존재하는 밀도 및 총 세포 수에 따라 달라집니다. 현재 프로토콜에서는 추가 다운스트림 분석을 위해 각 웰에서 채널 2의 총 강도 및 평균 강도(과산화물 라디칼 및 총 ROS 생성을 나타냄)를 수집했습니다.
5. 이미지 캡처, 처리 및 분석
   1. 이미지 획득 파라미터를 조정하고 마무리한 후 각 96웰 플레이트에 대한 스캔 프로세스를 시작합니다.
      참고: Cellomics CX7 이미징 시스템은 고처리량 방식으로 세포 내 ROS 생성을 포함하여 다양한 파라미터의 샘플에 대한 high-content 스크리닝 및 자동 분석을 가능하게 합니다. ROS 생산 외에도 HCS 시스템은 세포 형태, 세포 내 국소화 및 기타 많은 관심 세포 특징과 같은 다양한 파라미터에 대한 귀중한 추가 정보를 제공할 수 있습니다. 획득에 최적화되면 HCS 이미징 플랫폼을 통해 강력한 방식으로 세포 파라미터의 포괄적, 정성적, 정량적 특성 분석이 가능합니다.
   2. 스캔 프로세스가 완료되면 뷰 분석 소프트웨어를 실행하고 추가 분석을 위해 다양한 정량적 데이터 매개변수를 .csv 형식으로 내보냅니다.
   3. 타사 소프트웨어를 사용하여 추가 다운스트림 분석을 위해 관심 있는 다양한 정량적 값을 복사하고 붙여넣습니다.
      참고: 현재 프로토콜에서 GraphPad Prism 소프트웨어는_H2O2및 메나디온 노출로 인한 유도 산화 스트레스에 대한 응답으로 DHE 강도 값을 분석하는 데 사용되었습니다.
6. 데이터 및 통계 분석
   1. 채널 2의 평균 강도(총 ROS 값과 과산화물 라디칼을 나타냄)를 계산합니다.
      참고: 강도 값을 계산하기 위한 모든 실험은 각 투여 수준에서 조건당 6회 반복으로 3회 반복되었습니다.
   2. 일원 분산 분석 또는 t-검정을 수행하여 다양한 테스트 조건 간의 명암 값 차이를 측정합니다.

결과

디하이드로에티듐(DHE)은 세포 내 ROS 상태에 관한 특정 정보를 제공하는 과산화물 반응성 형광 염료입니다. DHE 염료는 본질적으로 세포질에서 청색 형광을 방출합니다. 그러나 과산화물 라디칼과 상호 작용하면 2-하이드록시티듐으로 변환되어 적색 파장(>550nm)에서 형광을 방출합니다(그림 1). DHE 염료는 세포와 핵으로 쉽게 운반됩니다. 방출되는 형광은 많은 실험실에서 일반...

토론

이 연구에서는 디하이드로에티듐(DHE) 형광 염료를 사용하여 과산화물 구동 세포 내 활성 산소종(ROS) 생산을 평가하는 프로토콜을 고함량 스크리닝 시스템에 설정했습니다. 문헌에서 사용할 수 있는 대부분의 현재 프로토콜은 ROS 종을 정량화하기 위한 형광 이미징 프로브로 DCFH-DA를 사용합니다. 그러나 여러 연구에 따르면 DCFH-DA는 세포 내 ROS 측정에 이상적인 프로브가 아닙니다. 프로브로서 DCFH-DA...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tubes	VWR	20170-038
96- well plate	Corning Costar	07-200-90
Cellomics Cx7	ThermoFisher	HCSDCX7LEDPRO
Collagen	Advanced Biomatrix	5056
DHE (Dihydroethidium)	ThermoFisher	D1168
DMEM	Sigma	6046
FBS	VWR	97068-085
GraphPad Prism	GraphPad	Version 6.0
HepG2 cell line	ATCC
Hoechst	ThermoFisher	33342
HUH7 cell line	ATCC
Hydrogen Peroxide	Sigma	88597
JHH4 cell line	ATCC
Menadione	Sigma	M5625