使用 Fast Protein 液相色谱系统对 6X-His 标签蛋白进行亲和纯化

摘要

本文提供了一种亲和纯化人重组蛋白瓣核酸内切酶 1 （FEN1） 的程序，该蛋白已用 6X-组氨酸标签标记。该方案涉及使用两个不同的固定化金属离子柱来纯化标记的蛋白质。

摘要

蛋白质的功能表征需要它们以高纯度大量表达和纯化，以进行生化分析。快速蛋白质液相色谱 （FPLC） 系统可对复杂蛋白质混合物进行高分离度分离。通过调整 FPLC 中的各种参数，例如选择合适的纯化基质、调节蛋白质样品的温度以及管理样品在基质上的流速和洗脱速率，可以确保蛋白质的稳定性和功能。在该协议中，我们将展示 FPLC 系统用于纯化细菌培养物中产生的 6X-His 标记的瓣核酸内切酶 1 （FEN1） 蛋白的多功能性。为了提高蛋白质纯化效率，我们将重点考虑多个因素，包括正确的色谱柱填充和制备、使用样品定量环的样品进样、样品上样到色谱柱的流速以及样品洗脱参数。最后，将分析色谱图以识别含有高产量蛋白质的组分以及正确重组蛋白质长期储存的注意事项。优化蛋白质纯化方法对于提高蛋白质分析的精度和可靠性至关重要。

引言

有许多策略可用于理解细胞生物学。一种方法涉及自上而下的策略，其中将基因突变引入基因，然后评估模式生物中产生的表型变化。相反，还原论方法需要初步阐明特定蛋白质的分子机制和酶功能，并同时表征其与其他细胞成分的相互作用。随后，评估这种蛋白质对生物途径的影响。尽管每种研究方法都有其固有的优势和局限性，但要全面了解生物途径需要跨学科研究。

由于 DNA 是生命的遗传蓝图，了解 DNA 复制和基因组维持的机制一直是七十多年来人们积极关注的领域。DNA 复制领域的研究已经产生了有关许多复制蛋白的单个结构和功能的大量数据。这些研究包括机制方面和生化活性测定，通过纯化这些蛋白质变得可行，使它们在 体外 环境中能够进行细致的检查。因此，蛋白质纯化在大多数旨在揭示 DNA 复制机制的研究工作中成为一种不可或缺且无处不在的技术。

本文介绍了一种分离标记有 6X-组氨酸的 DNA 复制蛋白的方法，该蛋白已在细菌细胞中过表达。感兴趣的蛋白质是人皮瓣核酸内切酶 1 （FEN1），这是一种结构特异性核酸酶，在滞后链复制中起关键作用，也是碱基切除修复 （BER） 等 DNA 修复途径的关键参与者^1,2,3

研究方案

1. 样品制备

1. 为了纯化重组 FEN1，如 Ononye 等人之前描述的 BL21（DE3） 细胞中表达构建体 （pET-FCH-FEN1），^{8 人。}
   1. 用 1% 过夜培养物接种 LB 培养基（表 1），并在 37 °C 下培养细胞直至 OD 达到 0.6。
   2. 用 0.4 M 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 （IPTG） 诱导，并将培养物再培养 3 小时。
   3. 通过在 4 °C 下以 5,000 × g 离心培养物 15 分钟来收获细胞。 将沉淀储存在 -80°C 冰箱中。
   4. 在纯化当天，从 -80 °C 冰箱中取出细胞沉淀，使其在冰上解冻，然后将沉淀重悬于 100 mL 裂解缓冲液中（表 1）。
      注：处理过程中应始终将细胞裂解物置于冰上，以防止蛋白水解。解冻后，整个纯化过程必须在同一天完成。细胞裂解物不应在冰箱中储存过夜。
2. 将悬浮液转移到 250 mL 烧杯中，在冰上以 35% 振幅开启 30 秒和 30 秒关闭超声处理 15 分钟。
   注意： 请查阅制造商的设置以确定振幅。
3. 将超声处理的样品转移到离心管中，并在 4 °C 下以 27,0....

讨论

亲和层析是一种广泛使用的纯化 DNA 结合蛋白的技术。固定化金属亲和层析 （IMAC） 是一种特定类型的亲和层析，它使用金属离子捕获肽序列的组氨酸残基。这就是为什么“6X-His 标签”或“poly-His 标签”连接到待纯化蛋白质的 N 端或 C 端的原因。镍和钴是最常用的金属离子，它们与通常用于纯化的 BME 和 DTT 等试剂的相容性各不相同。尽管已在 1 mM BME 或 DTT 的浓度下进行?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4x Laemmli sample buffer	BioRad	1610747
Acetic acid	Merck	UN2789
Beta-mercaptoethanol (BME)	Sigma	M-6250
Chromlab software version 6.1.27.0	BioRad		operates the NGC system
Complete MINI protease inhibitor tablet	Roche	11836153001
Coomassie Brilliant Blue R	Sigma	B0149
Dithiothreitol (DTT)	Dot Scientific	DSD11000
Econo-Column glass	BioRad	7371512
Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)	Dot Scientific	DSE57020
Flow adaptor	BioRad	7380014
Glycerol	Dot Scientific	DSG22020
Imidazole	Dot Scientific	DSI52000
Methanol	Fisher Scientific	A412
Mini PROTEAN TGX gels	BioRad	4561084
NGC Chromatography System	BioRad		automated liquid chromatography system
Ni-NTA Agarose	Qiagen	1018244
Phenyl-methyl-sulfonyl fluoride	Dot Scientific	DSP20270
PreScission Plus Protein Dual Color Standards	BioRad	1610374
Sodium chloride	Dot Scientific	DSS23020
TALON metal affinity resin	Takara	635502
Tris Base		DST60040