使用 Fast Protein 液相色谱系统对 6X-His 标签蛋白进行亲和纯化

摘要

本文提供了一种亲和纯化人重组蛋白瓣核酸内切酶 1 （FEN1） 的程序，该蛋白已用 6X-组氨酸标签标记。该方案涉及使用两个不同的固定化金属离子柱来纯化标记的蛋白质。

摘要

蛋白质的功能表征需要它们以高纯度大量表达和纯化，以进行生化分析。快速蛋白质液相色谱 （FPLC） 系统可对复杂蛋白质混合物进行高分离度分离。通过调整 FPLC 中的各种参数，例如选择合适的纯化基质、调节蛋白质样品的温度以及管理样品在基质上的流速和洗脱速率，可以确保蛋白质的稳定性和功能。在该协议中，我们将展示 FPLC 系统用于纯化细菌培养物中产生的 6X-His 标记的瓣核酸内切酶 1 （FEN1） 蛋白的多功能性。为了提高蛋白质纯化效率，我们将重点考虑多个因素，包括正确的色谱柱填充和制备、使用样品定量环的样品进样、样品上样到色谱柱的流速以及样品洗脱参数。最后，将分析色谱图以识别含有高产量蛋白质的组分以及正确重组蛋白质长期储存的注意事项。优化蛋白质纯化方法对于提高蛋白质分析的精度和可靠性至关重要。

引言

有许多策略可用于理解细胞生物学。一种方法涉及自上而下的策略，其中将基因突变引入基因，然后评估模式生物中产生的表型变化。相反，还原论方法需要初步阐明特定蛋白质的分子机制和酶功能，并同时表征其与其他细胞成分的相互作用。随后，评估这种蛋白质对生物途径的影响。尽管每种研究方法都有其固有的优势和局限性，但要全面了解生物途径需要跨学科研究。

由于 DNA 是生命的遗传蓝图，了解 DNA 复制和基因组维持的机制一直是七十多年来人们积极关注的领域。DNA 复制领域的研究已经产生了有关许多复制蛋白的单个结构和功能的大量数据。这些研究包括机制方面和生化活性测定，通过纯化这些蛋白质变得可行，使它们在 体外 环境中能够进行细致的检查。因此，蛋白质纯化在大多数旨在揭示 DNA 复制机制的研究工作中成为一种不可或缺且无处不在的技术。

本文介绍了一种分离标记有 6X-组氨酸的 DNA 复制蛋白的方法，该蛋白已在细菌细胞中过表达。感兴趣的蛋白质是人皮瓣核酸内切酶 1 （FEN1），这是一种结构特异性核酸酶，在滞后链复制中起关键作用，也是碱基切除修复 （BER） 等 DNA 修复途径的关键参与者^1,2,3。FEN1 的主要功能是在 5' 位移的皮瓣结构的基部切割，这是 DNA 复制或 BER 过程中出现的中间体。最初，评估 FEN1 酶活性的生化研究提出了一种"跟踪"机制，其中核酸酶会识别瓣结构的游离 5'-磷酸末端，然后沿着瓣部到达其基部，然后将其切割⁴。随后的研究表明，FEN1 通过"穿线"机制起作用，其中它首先与皮瓣的基部结合，然后在切割前将游离的 5' 端穿过其活性位点（图 1）⁵。过表达和分离重组 FEN1 的能力促进了这些突破，使研究人员能够将其用于生化和结构研究。

亲和层析是一种常用的纯化 DNA 的分离方法。该技术利用靶蛋白对固定在树脂上的配体的可逆结合亲和力来特异性捕获目标蛋白。最广泛使用的生物亲和力之一是氨基酸、组氨酸和金属离子（如镍和钴）之间的强烈相互作用，因此可以捕获到带 Ni²⁺ 或 Co²⁺ 的树脂上。

编码一串 6-9 个组氨酸残基 （His） 的 DNA 序列经常掺入编码目标蛋白质（在 N 端或 C 端）的质粒构建体中，用 6X-His 标签或多聚 His 标签标记蛋白质。然后可以通过固定化金属亲和层析 （IMAC） 轻松纯化 His 标签蛋白，IMAC 是亲和层析的一种亚型，其中树脂上的金属离子捕获带有亲和标签的蛋白质，随后可以使用适当的洗脱剂洗脱。过渡金属离子（如 Ni²⁺ 和 Co²⁺ ）可以固定在源自 N，N，N'-三-（羧甲基）-乙二胺或次氮基三乙酸 （NTA） 基团⁶ 的琼脂糖或硅胶基质上。

众所周知，金属配体对物理、化学和生物因素的降解具有很强的抵抗力，并且比其他类型的配体具有这一优势^6,7。此外，His 标签是一个相对较小的标签，不会显著影响蛋白质结构或功能⁷。然而，在细菌表达系统中，许多染色体表达的蛋白质对金属离子具有亲和力，并且可能与靶蛋白共纯化。镍和钴是 IMAC 基质中使用的典型金属离子。Ni-NTA 填料和 TALON 钴基填料通常用于纯化 His 标签蛋白。

Ni-NTA 与 TALON
Ni-NTA 和 TALON 的相应金属离子通过 NTA 配体固定在填料上。Ni-NTA 被认为具有更高的结合载量，可结合高达 100 mg/mL 的蛋白质。这可以提高蛋白质产量，但需要注意的是，污染蛋白质可能会被共纯化。相比之下，该填料对 His 标签蛋白具有更高的结合特异性，并且可能能够产生更高纯度的馏分。在本研究中，我们旨在使用参考的自动快速蛋白质液相色谱系统 NGC 系统（参见 材料表）比较两种填料的纯化效率。

缓冲区和兼容性
在蛋白质纯化过程中，需要缓冲液进行细胞裂解、样品制备、填料平衡以及从填料中洗脱捕获的蛋白质。浓度高达 100 mM 的 Tris、MOPS 和 HEPES 缓冲液是已知的 Ni-NTA 填料兼容缓冲液。缓冲液通常包括还原剂，以防止蛋白质氧化和蛋白质聚集。然而，超过阈值限度时，还原剂可能会剥夺树脂中的金属离子。对于上述镍基和钴基树脂，β-巯基乙醇 （BME） 或二硫苏糖醇 （DTT） 等还原剂的推荐浓度低于 1 mM。

用于纯化 hFEN1 的缓冲液是含有 NaCl、BME、苯甲基磺酰氟 （PMSF）、EDTA 和甘油的 Tris 缓冲液。NaCl 将蛋白质维持在可溶性形式并破坏分子相互作用，例如 DNA 结合。BME 减少氧化蛋白，从而防止蛋白聚集。PMSF） 是一种蛋白酶抑制剂，可防止蛋白酶介导的靶蛋白降解。EDTA 可去除样品中的二价阳离子，阻止它们进入核酸酶和蛋白酶。甘油增强了水性蛋白质的稳定性。此外，裂解缓冲液含有完整的蛋白酶抑制剂片剂，以确保在细胞裂解过程中最大限度地保护靶蛋白免受降解蛋白酶的影响。平衡和洗脱缓冲液含有咪唑，洗脱缓冲液中含有更大量的咪唑，以便在洗脱过程中从树脂中置换结合的蛋白质。

下一代色谱 （NGC） 系统
该自动化中压色谱系统专为快速流动蛋白质液相色谱 （FPLC） 而设计，使用两个泵同时泵送两种不同的缓冲液，能够进样 250 μL 至 100 mL 的各种样品体积。样品定量环（该系统中称为 Dynaloop）可以进样更大的样品体积。该系统可以使用 Chromlab 软件进行操作，该软件有助于创建定制方法、操作纯化运行以及分析 UV 峰和蛋白质组分。

研究方案

1. 样品制备

1. 为了纯化重组 FEN1，如 Ononye 等人之前描述的 BL21（DE3） 细胞中表达构建体 （pET-FCH-FEN1），^{8 人。}
   1. 用 1% 过夜培养物接种 LB 培养基（表 1），并在 37 °C 下培养细胞直至 OD 达到 0.6。
   2. 用 0.4 M 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 （IPTG） 诱导，并将培养物再培养 3 小时。
   3. 通过在 4 °C 下以 5,000 × g 离心培养物 15 分钟来收获细胞。 将沉淀储存在 -80°C 冰箱中。
   4. 在纯化当天，从 -80 °C 冰箱中取出细胞沉淀，使其在冰上解冻，然后将沉淀重悬于 100 mL 裂解缓冲液中（表 1）。
      注:处理过程中应始终将细胞裂解物置于冰上，以防止蛋白水解。解冻后，整个纯化过程必须在同一天完成。细胞裂解物不应在冰箱中储存过夜。
2. 将悬浮液转移到 250 mL 烧杯中，在冰上以 35% 振幅开启 30 秒和 30 秒关闭超声处理 15 分钟。
   注意: 请查阅制造商的设置以确定振幅。
3. 将超声处理的样品转移到离心管中，并在 4 °C 下以 27,000 × g 旋转 30 分钟，以获得澄清的裂解物。将细胞裂解物放在 4 °C 冰箱中的冰上，直至进样。

2. 准备亲和柱

1. 将色谱柱（一个用于 Ni-NTA 树脂，一个用于钴基树脂）安装到夹具支架上，使色谱柱尽可能保持笔直，避免色谱柱倾斜。确保用塞子插入色谱柱底部，并在每根色谱柱底部添加 1-2 mL 起始缓冲液，以防止在色谱柱填充过程中出现气泡。
2. 轻轻摇晃树脂瓶，直到树脂完全重悬。打开塔的顶部，连续倒入 10 mL 的每种浆液，以避免包含气泡。将填料倒在固定在色谱柱边缘的金属刮刀或玻璃棒上，以避免色谱柱中出现气泡。

3. 使用流动适配器进行色谱柱填充

1. 从色谱柱上拔下塞子，并将管路底部连接到管路的一端。将管路的另一端连接到 FPLC 系统的 UV 端口。
2. 确保床支撑外壳已拉入流量适配器主体，并将流量适配器主体滑到色谱柱顶部（图 2A）。将凸轮闩锁置于位置 1 时，降低流量适配器，注意不要将其插入缓冲液（图 2B）。将凸轮闩锁切换到位置 2（图 2B）。将管道连接到系统并开始起始缓冲液的流动 1-2 分钟，以去除管道中的空气并防止填充过程中出现气泡。
3. 将闩锁切换回位置 1，并以一个平稳的动作将流量适配器降低到缓冲液中，避免气泡，然后将闩锁切换回位置 2。这允许一些缓冲液进入 Flow 适配器并去除任何剩余的气泡。
4. 将闩锁切换到位置 3 并拧紧凸轮底座和锁定环（图 2B）。
5. 以 10 mL/min 的速度开始缓冲液流路以填充色谱柱。继续此步骤 3 分钟或直到树脂填充良好。

4. 灌注 FPLC 系统的样品定量环

1. 将样品定量环顶部的管路连接到 FPLC 系统上的定量环 E（图 3）。
2. 将样品定量环底部的管路连接到 FPLC 系统上的废液 2。
3. 将管路的一端插入 FPLC 系统的色谱柱端口，然后将另一端放入废液瓶中。
4. 将泵 A 的管道插入过滤的双蒸水 （ddH₂O） 中。
5. 使用软件双击 泵设置 （图 4A，标记为 2）并选择 系统泵进样回路 （图 4C）。
6. 单击流速设置（图 4A，标记为 1），将流速更改为 10 mL/min。在 %B 框中输入 0%（图 4B）。
7. 启动液流，用水冲洗样品定量环，这会将滑动密封件向下推。
8. 一旦滑动密封到达样品定量环的底部，就停止液流。将泵 A 从 ddH₂O 切换到起始缓冲液。将样品定量环顶部的管路连接到废液 2，将样品定量环顶部的管路连接到定量环 E。将色谱柱端口的管路留在废液中。
9. 以 10 mL/min 的速率开始流路。一旦被进入的起始缓冲液向上推的滑动密封件到达样品定量环的顶部，就停止流速。样品定量环现在已准备好进行样品进样。

5. 样品进样

1. 双击 泵设置 并选择 手动负载回路 （图 4C）。
2. 从 Loop E 拧下管路并将其放入废液容器中。
3. 将管路从色谱柱端口连接到流路适配器顶部的管路。
4. 使用 30 mL 注射器吸取样品;然后，将注射器连接到进样口适配器。
5. 将注射器拧入进样口并进样，确保其明显注入样品定量环。将 100 μL 样品（标记 输入裂解物）储存在 -20 °C 的微量离心管中，用于 SDS-PAGE 分析
   注:根据总样品量，可能需要 2-3 次进样。
6. 用色谱柱盖塞住进样口。
7. 将管路从样品定量环底部连接回 Loop E 端口。
8. 将泵 B 的管路放入洗脱缓冲液中。

6. 使用 FPLC 系统链接软件创建和分析方法

1. 导航到 主页 选项卡，然后选择 新建方法.
2. 选择左列的 Method settings 选项卡，导航到 Column type 下拉菜单，然后选择 Custom （图 5）。
3. 输入 色谱柱体积 （5 mL）。
4. 输入运行所需的 流速 （1 mL/min）。
5. 导航到 Unit selection（单位选择），然后选择 CV（色谱柱体积）作为方法基本单位。
6. 确保将 Inlet A（液相 A ）设置为 Buffer A（缓冲液 A），将 Inlet B（液相 B ）设置为 Buffer B（缓冲液 B）（默认设置）。
7. 选择左侧菜单上的 Method Outline（方法大纲 ）选项卡。按以下顺序添加纯化步骤:平衡、样品应用、柱清洗和洗脱。
   1. 在 Equilibation （平衡） 下，将 平衡体积 设置为 10 CV。确保 缓冲液设置 保持在 0% B。
   2. 在 sample application 选项卡下，通过观察 sample loop 来设置样品体积。滑动密封的位置指示样品体积。
   3. 在 柱清洗下，将 清洗体积 设置为 5 CV。禁用此步骤的馏分收集;在运行过程中，将洗涤液作为一个整体收集在烧杯中，而不是作为组分收集。
   4. 对于 洗脱，将 梯度体积 设置为 14 CV ，从 0% 缓冲液 B 开始到 100% 缓冲液 B。
8. 保存方法并开始运行。
9. 确保馏分收集器从第一个馏分的位置开始。
10. 输入 运行名称 ，然后单击 Start。
11. 在平衡阶段，监测实时 UV 曲线。确保所有连接安全无泄漏;通过查找流入废液容器的缓冲液来确认完整的电路。如果 UV 曲线在平衡的最后几分钟内没有稳定，请延长平衡步骤，直到达到稳定（图 6）。
12. 在施样时，将进入废液容器的试管换成干净的烧杯。在此步骤中，收集从废液管中流出的未结合蛋白质作为流出液（标记为 FT）。
13. 寻找 UV 曲线的急剧增加，可能达到 3,000 maU 的最大可能读数（图 6）。
    注意:在大部分样品应用步骤中，典型的曲线稳定在 3,000 maU。
14. 在色谱柱清洗过程中，由于残留的未结合蛋白质被洗掉，树脂上只剩下结合的蛋白质，因此 UV 曲线是否急剧下降（图 6）。如果在洗涤步骤结束时 UV 曲线尚未下降，请单击 "按住步骤 "来延长该步骤，直到 UV 充分下降。在此步骤开始时，将废液管从 FT 烧杯 转移到另一个标有 Wash 的干净烧杯中。
15. 洗脱步骤开始时，确保馏分收集器移动到位并开始收集馏分。通过在 UV 曲线中寻找峰来可视化蛋白质的洗脱（图 6）。
16. 运行完成后，导航到 Home （主页 ） 选项卡，然后选择 Open Run （打开运行）。打开运行以查看色谱图，并在顶部菜单中选择 peak integration （峰积分 ） 以标记运行期间获得的峰。
17. 选择 Fractions 选项卡以可视化包含洗脱蛋白质的组分。

7. SDS PAGE 分析

1. 将 15 μL 含有蛋白质的每种级分与 5 μL SDS 样品上样缓冲液混合（表 1）。将样品在 95 °C 下加热 5 分钟。
2. 将样品加载到预制凝胶中，并在 160 V 下与预染蛋白质标记一起运行 45 分钟。
3. 在考马斯亮蓝染色溶液中对凝胶染色 30 分钟（表 1）。
4. 在 ddH₂O 中洗涤凝胶（重复 3 次）。
5. 将凝胶在脱色溶液中脱色 1 小时（表 1）。
6. 观察蛋白质条带;在 42 kDa 标记处检测 FEN1。
7. 汇集含有 FEN1 的馏分，并使用 10 kDa 离心过滤器浓缩池。分装并储存在 -80° °C 冰箱中。

结果

表达 hFEN1 的 BL21 （DE3） 细胞裂解物通过平衡的 Ni-NTA 和 TALON 填料。Ni-NTA 填料带 Ni²⁺ 离子，具有高结合载量。结果表明，与 TALON 树脂相比，Ni-NTA 树脂产生的 FEN1 量更高（图 7）。Ni-NTA 填料还已知与其他染色体表达的蛋白质非特异性结合。与 Ni-NTA 相比，通过钴基树脂的细胞裂解物经过纯化，纯度高，但产率较低。与许多其他 DNA 结合蛋白一?...

讨论

亲和层析是一种广泛使用的纯化 DNA 结合蛋白的技术。固定化金属亲和层析 （IMAC） 是一种特定类型的亲和层析，它使用金属离子捕获肽序列的组氨酸残基。这就是为什么"6X-His 标签"或"poly-His 标签"连接到待纯化蛋白质的 N 端或 C 端的原因。镍和钴是最常用的金属离子，它们与通常用于纯化的 BME 和 DTT 等试剂的相容性各不相同。尽管已在 1 mM BME 或 DTT 的浓度下进行了纯化?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4x Laemmli sample buffer	BioRad	1610747
Acetic acid	Merck	UN2789
Beta-mercaptoethanol (BME)	Sigma	M-6250
Chromlab software version 6.1.27.0	BioRad		operates the NGC system
Complete MINI protease inhibitor tablet	Roche	11836153001
Coomassie Brilliant Blue R	Sigma	B0149
Dithiothreitol (DTT)	Dot Scientific	DSD11000
Econo-Column glass	BioRad	7371512
Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)	Dot Scientific	DSE57020
Flow adaptor	BioRad	7380014
Glycerol	Dot Scientific	DSG22020
Imidazole	Dot Scientific	DSI52000
Methanol	Fisher Scientific	A412
Mini PROTEAN TGX gels	BioRad	4561084
NGC Chromatography System	BioRad		automated liquid chromatography system
Ni-NTA Agarose	Qiagen	1018244
Phenyl-methyl-sulfonyl fluoride	Dot Scientific	DSP20270
PreScission Plus Protein Dual Color Standards	BioRad	1610374
Sodium chloride	Dot Scientific	DSS23020
TALON metal affinity resin	Takara	635502
Tris Base		DST60040