Аффинная очистка белка, меченного 6X-His-Tag, с помощью системы жидкостной хроматографии быстрого белка

Резюме

В данной статье описана процедура аффинной очистки человеческого рекомбинантного белка, лоскутной эндонуклеазы 1 (FEN1), который был помечен меткой 6X-гистидином. Протокол включает в себя использование двух отдельных иммобилизованных ионных колонок металлов для очистки меченого белка.

Аннотация

Функциональная характеристика белков требует, чтобы они были экспрессированы и очищены в значительных количествах с высокой чистотой для проведения биохимических анализов. Система быстрой жидкостной хроматографии белка (FPLC) позволяет разделять сложные белковые смеси с высоким разрешением. Регулируя различные параметры в FPLC, такие как выбор подходящей матрицы очистки, регулирование температуры образца белка и управление скоростью потока образца на матрицу и скоростью элюирования, можно обеспечить стабильность и функциональность белка. В этом протоколе мы продемонстрируем универсальность системы FPLC для очистки белка 6X-меченой флуз-эндонуклеазы 1 (FEN1), продуцируемого в бактериальных культурах. Чтобы повысить эффективность очистки белка, мы сосредоточимся на нескольких аспектах, включая надлежащую упаковку и подготовку колонки, впрыск образца с использованием контура образца, скорость подачи образца в колонку и параметры элюирования образца. Наконец, хроматограмма будет проанализирована для выявления фракций, содержащих большое количество белка, и рекомендаций по надлежащему долгосрочному хранению рекомбинантного белка. Оптимизация методов очистки белка имеет решающее значение для повышения точности и надежности анализа белка.

Введение

Существует множество стратегий для постижения клеточной биологии. Один из подходов включает в себя нисходящую стратегию, при которой генетические мутации вводятся в ген с последующей оценкой полученных фенотипических изменений в модельном организме. С другой стороны, редукционистский подход предполагает первоначальное выяснение молекулярных механизмов и ферментативных функций конкретного белка, сопровождаемое характеристикой его взаимодействий с другими клеточными компонентами. Впоследствии оценивается влияние этого белка на биологический путь. Несмотря на то, что каждый исследовательский подход имеет свои преимущества и ограничения, достижение всестороннего понимания биологического пути требует междисциплинарных исследований.

Поскольку ДНК является генетическим планом жизни, понимание механизмов дупликации ДНК и поддержания генома является областью активного интереса на протяжении более семи десятилетий. Исследования в области репликации ДНК дали обширные данные об отдельных структурах и функциях многочисленных репликационных белков. Эти исследования, которые охватывают механистические аспекты и анализы биохимической активности, стали возможными благодаря очистке этих белков, что позволяет тщательно исследовать их в среде in vitro . Следовательно, очистка белка становится незаменимым и повсеместным методом в большинстве исследовательских начинаний, направленных на разгадку механистических представлений о репликации ДНК.

В данной статье представлена методика выделения белка репликации ДНК, меченного 6X-гистидином, который был сверхэкспрессирован в бактериальных клетках. Интересным белком является эндонуклеаза лоскута человека 1 (FEN1), структурно-специфическая нуклеаза, которая играет ключевую роль в репликации запаздывающей цепи, а также является важным участником путей репарации ДНК, таких как эксцизионная репарация оснований (BER)^1,2,3. Основная функция FEN1 заключается в расщеплении в основании 5'-смещенной структуры лоскута, промежуточного продукта, который возникает во время репликации ДНК или BER. Первоначально биохимические исследования, оценивающие ферментативную активность FEN1, предполагали механизм «слежения», при котором нуклеаза распознает свободный 5'-фосфатный конец структуры лоскута, а затем следует вдоль лоскута к его основанию, прежде чем расщепить его^. Последующие исследования показали, что FEN1 работает с помощью механизма «нарезания резьбы», при котором он сначала связывается с основанием лоскута, а затем продевает свободный 5'-конец через его активный участок до расщепления (Рисунок 1)⁵. Способность сверхэкспрессировать и изолировать рекомбинантный FEN1 способствовала этим прорывам, что позволило исследователям использовать его в биохимических и структурных исследованиях.

Аффинная хроматография является широко используемым методом разделения для очистки ДНК. В этом методе используется обратимое аффинность связывания белков-мишеней по отношению к лигандам, иммобилизованным на смоле, чтобы специфически захватить интересующий белок. Одним из наиболее широко используемых биосродств является устойчивое взаимодействие между аминокислотой, гистидином и ионами металлов, таких как никель и кобальт, и, следовательно, может быть захвачено смолой, заряженной Ni²⁺ или Co²⁺.

Последовательность ДНК, кодирующая цепочку из 6-9 остатков гистидина (His), часто встраивается в плазмидную конструкцию, которая кодирует представляющий интерес белок (либо на N-конце, либо на C-конце), помечая белок 6X-His-меткой или поли-His-меткой. Меченный His-меткой белок затем может быть легко очищен с помощью иммобилизованной аффинной хроматографии металлов (IMAC), подтипа аффинной хроматографии, при которой ионы металлов на смоле захватывают белки с аффинной меткой, которые впоследствии могут быть элюированы с помощью соответствующих элюирующих агентов. Ионы переходных металлов, такие как Ni²⁺ и Co^2+, могут быть иммобилизованы на агарозных или силикагелевых матрицах, полученных из N,N,N'-трис-(карбоксиметил)-этилендиамина или группы нитрилотриуксусной кислоты (NTA)⁶.

Известно, что лиганды металлов устойчивы к деградации под воздействием физических, химических и биологических факторов и обладают этим преимуществом перед другими типами лигандов ^6,7. Кроме того, His-метка является относительно небольшой меткой и не оказывает существенного влияния на структуру белка или функцию⁷. Однако в бактериальной экспрессионной системе многие хромосомно экспрессируемые белки имеют сродство к ионам металлов и могут совместно очищаться с белком-мишенью. Никель и кобальт являются типичными ионами металлов, используемыми в матрицах IMAC. Смола Ni-NTA и смола на основе кобальта TALON обычно используются для очистки белков, меченных His.

Ni-NTA в сравнении с TALON
Соответствующие ионы металлов Ni-NTA и TALON иммобилизуются на смоле с помощью лигандов NTA. Считается, что Ni-NTA обладает более высокой связывающей способностью, связывая до 100 мг/мл белка. Это может привести к более высокому выходу белка с оговоркой, что загрязняющие белки могут подвергаться совместной очистке. Напротив, смола обладает более высокой специфичностью связывания по отношению к белкам, меченным His, и может быть способна производить фракции более высокой чистоты. В этом исследовании мы стремимся сравнить эффективность очистки обеих смол с помощью эталонной автоматизированной системы жидкостной хроматографии быстрых белков, системы NGC (см. Таблицу материалов).

Буферы и совместимость
Буферы необходимы во время очистки белка для лизиса клеток, подготовки образцов, уравновешивания смолы и элюирования захваченного белка из смолы. Буферы Tris, MOPS и HEPES с концентрацией до 100 мМ являются известными совместимыми буферами для смолы Ni-NTA. Буферы часто включают восстановители для предотвращения окисления белка и его агрегации. Однако при превышении порогового предела восстановители могут лишить смолу ионов металлов. Рекомендуемая концентрация восстановителей, таких как бета-меркаптоэтанол (BME) или дитиотреитол (DTT), составляет менее 1 мМ для вышеупомянутых смол на основе никеля и кобальта.

Буферами для очистки hFEN1 являются трис-буферы, содержащие NaCl, BME, фенилметилсульфонилфторид (PMSF), ЭДТА и глицерин. NaCl поддерживает белок в растворимой форме и нарушает молекулярные взаимодействия, такие как связывание ДНК. БМЭ восстанавливает окисленные белки и тем самым предотвращает агрегацию белков. PMSF) является ингибитором протеазы, который предотвращает протеазно-опосредованную деградацию белка-мишени. ЭДТА удаляет двухвалентные катионы из образца, предотвращая их доступ к нуклеазам и протеазам. Глицерин усиливает стабильность белка в водной форме. Кроме того, буфер для лизиса содержит полные таблетки ингибитора протеазы для обеспечения максимальной защиты целевого белка от деградации протеаз во время лизиса клеток. Уравновешивающий и элюирующий буферы содержат имидазол, при этом элюирующий буфер содержит большее количество имидазола для вытеснения связанного белка из смолы во время элюирования.

Система хроматографии нового поколения (NGC)
Эта автоматизированная хроматографическая система среднего давления, предназначенная для быстропроточной жидкостной хроматографии белков (FPLC), использует два насоса для одновременной накачки двух разных буферов и способна вводить образцы в широком диапазоне объемов от 250 μл до 100 мл. Петля образца (известная в этой системе как Dynaloop) позволяет вводить образцы больших объемов. Система может управляться с помощью программного обеспечения Chromlab, которое облегчает создание индивидуальных методов, управление очистными циклами и анализ УФ-пиков и белковых фракций.

протокол

1. Подготовка образцов

1. Чтобы очистить рекомбинантный FEN1, экспрессируйте конструкцию (pET-FCH-FEN1) в клетках BL21(DE3), как ранее было описано Ononye et ^al.8.
   1. Инокулируйте среду LB (Таблица 1) 1% в течение ночи и выращивайте клетки при 37 °C до тех пор, пока OD не достигнет 0,6.
   2. Индуцируйте 0,4 М изопропил-бета-D-тиогалактозидом (IPTG) и выращивайте культуру еще 3 ч.
   3. Соберите клетки, центрифугируя культуру при 5 000 × г в течение 15 мин при 4 °C. Храните пеллеты в морозильной камере при температуре -80°C.
   4. В день очистки извлеките клеточную гранулу из морозильной камеры при температуре -80 °C, дайте ей оттаять на льду и повторно суспендируйте гранулу в 100 мл буфера для лизиса (Таблица 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лизат клеток всегда следует помещать на лед во время работы с ним, чтобы предотвратить протеолиз. После размораживания весь процесс очистки должен быть завершен в тот же день. Лизат клеток не следует хранить в холодильнике в течение ночи.
2. Перенесите суспензию в стакан объемом 250 мл и обрабатывайте ультразвуком на льду при 30 с ON и 30 s OFF при амплитуде 35% в течение 15 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к настройкам производителя, чтобы определить амплитуду.
3. Перенесите обработанный ультразвуком образец в центрифужную пробирку и вращайте при температуре 27 000 × г в течение 30 минут при 4 °C до получения прозрачного лизата. Поместите лизат клеток на лед в холодильник при температуре 4 °C до введения образца.

2. Подготовка столбцов сходства

1. Установите колонны (одну для смолы Ni-NTA и одну для смолы на основе кобальта) на зажимную стойку таким образом, чтобы колонны держались как можно прямее, избегая наклона колонн. Убедитесь, что нижняя часть колонн закрыта пробкой, и добавьте 1-2 мл стартового буфера в нижнюю часть каждой колонны, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха во время упаковки колонны.
2. Осторожно встряхните бутылки со смолой, пока смола полностью не восстановится. Откройте верхнюю часть колонн и налейте по 10 мл каждой суспензии непрерывно, чтобы избежать включения пузырьков воздуха. Налейте смолу на металлический шпатель или стеклянный стержень, удерживаемый на краю колонны, чтобы избежать образования пузырьков воздуха в колонне.

3. Насадка колонны с помощью адаптера потока

1. Отсоедините пробку от колонки и подсоедините дно к одному концу трубки. Подсоедините другой конец трубки к УФ-порту системы FPLC.
2. Убедитесь, что корпус опоры станины втянут в корпус адаптера потока, и сдвиньте корпус адаптера потока на верхнюю часть колонны (Рисунок 2A). Когда кулачковая защелка находится в положении 1, опустите адаптер потока, стараясь не вставлять его в буфер (рис. 2B). Переключите защелку кулачка в положение 2 (рис. 2B). Подсоедините трубку к системе и запустите поток пускового буфера на 1-2 минуты, чтобы очистить трубку от воздуха и предотвратить образование пузырьков воздуха во время упаковки.
3. Переключите защелку обратно в положение 1 и опустите адаптер потока в буфер одним плавным движением, избегая появления пузырьков воздуха, и верните защелку обратно в положение 2. Это позволяет некоторому буферу проникать в адаптер потока и удалять все оставшиеся пузырьки.
4. Переключите защелку в положение 3 и затяните основание кулачка и стопорное кольцо (рис. 2B).
5. Начните подачу буфера со скоростью 10 мл/мин для уплотнения колонны. Продолжайте этот шаг в течение 3 минут или пока смола не будет хорошо упакована.

4. Грунтовка контура образца системы FPLC

1. Подсоедините трубку от верхней части контура образца к контуру E в системе FPLC (рисунок 3).
2. Подсоедините трубку от нижней части контура отбора проб к отходам 2 в системе FPLC.
3. Вставьте один конец трубки в отверстие колонки системы FPLC, а другой конец поместите в бутылку для отходов.
4. Вставьте трубку от насоса A в отфильтрованную воду двойной дистилляции (ddH₂O).
5. Дважды щелкните по настройкам насоса с помощью программного обеспечения (Рисунок 4A, обозначен как 2) и выберите контур впрыска системного насоса (Рисунок 4C).
6. Нажмите на настройки расхода (Рисунок 4A, обозначен как 1) и измените расход на 10 мл/мин. Введите 0% в поле %B (Рисунок 4B).
7. Запустите поток, чтобы промыть контур образца водой, которая будет толкать скользящее уплотнение вниз.
8. Как только скользящее уплотнение достигнет нижней части контура образца, остановите поток. Переключите насос A с ddH₂O на начальный буфер. Подсоедините трубку от верхней части контура отбора проб к отходу 2, а трубку снизу — к контуру E. Оставьте трубку от порта колонки в сливе.
9. Начните подачу с 10 мл/мин. Как только скользящее уплотнение, толкаемое вверх входящим пусковым буфером, достигнет верхней части контура образца, остановите поток. Теперь петля образца готова к введению образца.

5. Ввод образца

1. Дважды щелкните по настройкам насоса и выберите «Ручная нагрузочная петля » (Рисунок 4C).
2. Открутите трубку от петли Е и поместите ее в контейнер для отходов.
3. Подсоедините трубку от отверстия колонны к трубке в верхней части адаптера потока.
4. Наберите образец с помощью шприца объемом 30 мл; Затем прикрепите шприц к адаптеру порта для инъекций.
5. Вкрутите шприц в порт для инъекций и введите образец, убедившись, что он визуально введен в контур образца. Храните 100 мкл образца ( входной лизат метки) в микроцентрифужной пробирке при температуре -20 °C для анализа SDS-PAGE
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от общего объема образца может потребоваться 2-3 инъекции.
6. Закупорьте отверстие впрыска крышкой колонки.
7. Подсоедините трубку от нижней части контура образца обратно к порту контура E.
8. Поместите трубку от насоса B в буфер для элюирования.

6. Создание и анализ методов с помощью системно-связанного программного обеспечения FPLC

1. Перейдите на вкладку «Главная» и выберите «Новый метод».
2. Выберите вкладку Method settings в левом столбце, перейдите в раскрывающееся меню Column type и выберите Custom (рисунок 5).
3. Введите объем столбца (5 мл).
4. Введите требуемый расход для прогона (1 мл/мин).
5. Перейдите в раздел Выбор единиц измерения и выберите CV (объемы столбцов) в качестве базовой единицы метода.
6. Убедитесь, что для параметра Вход A установлено значение Буфер A, а для параметра Вход B — буфер B (значение по умолчанию).
7. Выберите вкладку «Контур метода » в меню слева. Добавьте этапы очистки в следующем порядке: уравновешивание, нанесение образца, промывка колонки и элюирование.
   1. В разделе Равновесие установите объем уравновешивания равным 10 CV. Убедитесь, что настройка буфера поддерживается на уровне 0% B.
   2. На вкладке приложения с образцами установите объем выборки, наблюдая за петлей выборки. Положение скользящего уплотнения указывает на объем образца.
   3. В разделе «Промывка колонны» установите объем промывки на 5 CV. Отключите сбор дробей для этого шага; Собирайте промывку целиком в стакан во время бега, а не собирайте по фракциям.
   4. Для элюирования установите объем градиента на 14 CV , начиная с 0% буфера B до 100% буфера B.
8. Сохраните метод и запустите прогон.
9. Убедитесь, что сборщик фракций начинает работу в положении первой дроби.
10. Введите имя прогона и нажмите кнопку Пуск.
11. Во время фазы равновесия следите за УФ-кривой в режиме реального времени. Убедитесь, что все соединения надежны и не протекают; Подтвердите полную цепь, найдя буфер, стекающий в контейнер для отходов. Если УФ-кривая не стабилизировалась в течение последних минут равновесия, продлите шаг уравновешивания до тех пор, пока не будет достигнута стабилизация (рис. 6).
12. Во время нанесения образца переключите пробирки, идущие в контейнер для отходов, на чистую мензурку. На этом этапе соберите несвязанные белки, вытекающие из пробирок для отходов, в виде сквозного канала (метка FT).
13. Обратите внимание на резкое увеличение УФ-кривой, которое, вероятно, достигнет максимально возможного значения в 3000 maU (Рисунок 6).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Типичная кривая выходит на плато при 3 000 maU на протяжении большей части стадии нанесения образца.
14. Во время промывки колонки, когда остаточные несвязанные белки смываются, а на смоле остаются только связанные белки, обратите внимание на резкое падение УФ-кривой (рис. 6). Если УФ-кривая не снизилась к концу этапа стирки, продлите шаг, нажимая кнопку удержания до тех пор, пока УФ-излучение не снизится достаточно. В начале этого шага перенесите трубки для отходов из стакана FT в другую чистую стакан с маркировкой Wash.
15. Когда начнется этап элюирования, убедитесь, что коллектор фракций переместился в нужное положение и начните сбор фракций. Визуализируйте элюирование белка, ища пики на УФ-кривой (рис. 6).
16. После завершения выполнения перейдите на вкладку « Главная » и выберите «Открыть выполнение». Откройте прогон, чтобы просмотреть хроматограмму, и выберите интегрирование пиков в верхнем меню, чтобы отметить пики, полученные во время прогона.
17. Выберите вкладку Дроби, чтобы визуализировать фракции, содержащие элюированный белок.

7. Анализ страницы SDS

1. Смешайте по 15 мкл каждой фракции, содержащей белок, с 5 мкл буфера для загрузки образцов SDS (Таблица 1). Нагрейте образцы до 95 °C в течение 5 минут.
2. Загрузите образцы в сборные гели и запустите при напряжении 160 В в течение 45 минут вместе с предварительно окрашенным белковым маркером.
3. Окрашиваем гели в растворе окрашивания Coomassie brilliant blue в течение 30 минут (табл. 1).
4. Смойте гель в ddH₂O (повторите 3 раза).
5. Удалить гель из пятна в растворе для задержания в течение 1 ч (табл. 1).
6. Наблюдайте за белковыми полосами; обнаружить FEN1 на отметке 42 кДа.
7. Пул фракций, содержащих FEN1, и концентрируют в бассейне с помощью центробежного фильтра с усилием 10 кДа. Аликвотировать и хранить в морозильной камере при температуре -80°C.

Результаты

Лизаты клеток BL21 (DE3), экспрессирующие hFEN1, пропускали через уравновешенные смолы Ni-NTA и TALON. Смола Ni-NTA заряжена ионами Ni²⁺ и обладает высокой связующей способностью. Результаты показывают, что смола Ni-NTA дает большее количество FEN1 по сравнению со смолой TALON (

Обсуждение

Аффинная хроматография является широко используемым методом очистки ДНК-связывающих белков. Иммобилизованная аффинная хроматография металлов (IMAC) — это особый тип аффинной хроматографии, в котором используются ионы металлов для захвата остатков гистидина пептидн?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4x Laemmli sample buffer	BioRad	1610747
Acetic acid	Merck	UN2789
Beta-mercaptoethanol (BME)	Sigma	M-6250
Chromlab software version 6.1.27.0	BioRad		operates the NGC system
Complete MINI protease inhibitor tablet	Roche	11836153001
Coomassie Brilliant Blue R	Sigma	B0149
Dithiothreitol (DTT)	Dot Scientific	DSD11000
Econo-Column glass	BioRad	7371512
Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)	Dot Scientific	DSE57020
Flow adaptor	BioRad	7380014
Glycerol	Dot Scientific	DSG22020
Imidazole	Dot Scientific	DSI52000
Methanol	Fisher Scientific	A412
Mini PROTEAN TGX gels	BioRad	4561084
NGC Chromatography System	BioRad		automated liquid chromatography system
Ni-NTA Agarose	Qiagen	1018244
Phenyl-methyl-sulfonyl fluoride	Dot Scientific	DSP20270
PreScission Plus Protein Dual Color Standards	BioRad	1610374
Sodium chloride	Dot Scientific	DSS23020
TALON metal affinity resin	Takara	635502
Tris Base		DST60040