Hızlı Protein Sıvı Kromatografi Sistemi Kullanılarak 6X His Etiketli Bir Proteinin Afinite Saflaştırılması

Özet

Bu makale, bir 6X-histidin etiketi ile etiketlenmiş bir insan rekombinant proteini olan flep endonükleaz 1'in (FEN1) afinite saflaştırılması için bir prosedür sağlar. Protokol, etiketli proteinin saflaştırılması için iki farklı hareketsizleştirilmiş metal iyon kolonunun kullanılmasını içerir.

Özet

Proteinlerin fonksiyonel karakterizasyonu, biyokimyasal analizler yapmak için bunların yüksek saflıkta önemli miktarlarda ifade edilmesini ve saflaştırılmasını gerektirir. Hızlı Protein Sıvı Kromatografisi (FPLC) sistemi, karmaşık protein karışımlarının yüksek çözünürlükte ayrılmasını sağlar. FPLC'de uygun saflaştırma matrisinin seçilmesi, protein numunesinin sıcaklığının düzenlenmesi ve numunenin matris üzerindeki akış hızının ve elüsyon hızının yönetilmesi gibi çeşitli parametreleri ayarlayarak, proteinin stabilitesini ve işlevselliğini sağlamak mümkündür. Bu protokolde, bakteri kültürlerinde üretilen 6X-His etiketli flep endonükleaz 1 (FEN1) proteinini saflaştırmak için FPLC sisteminin çok yönlülüğünü göstereceğiz. Protein saflaştırma verimliliğini artırmak için, uygun kolon paketleme ve hazırlama, bir numune döngüsü kullanarak numune enjeksiyonu, numune uygulamasının kolona akış hızı ve numune elüsyon parametreleri dahil olmak üzere birçok hususa odaklanacağız. Son olarak, kromatogram, yüksek protein verimi içeren fraksiyonları ve uygun rekombinant proteinin uzun süreli depolanması için hususları belirlemek için analiz edilecektir. Protein saflaştırma yöntemlerinin optimize edilmesi, protein analizinin hassasiyetini ve güvenilirliğini artırmak için çok önemlidir.

Giriş

Hücresel biyolojiyi anlamak için çok sayıda strateji mevcuttur. Bir yaklaşım, genetik mutasyonların bir gene sokulduğu ve ardından bir model organizmada ortaya çıkan fenotipik değişikliklerin değerlendirilmesinin izlediği yukarıdan aşağıya bir stratejiyi içerir. Tersine, indirgemeci bir yaklaşım, belirli bir proteinin moleküler mekanizmalarının ve enzimatik fonksiyonlarının, diğer hücresel bileşenlerle etkileşimlerinin karakterizasyonu ile birlikte ilk açıklanmasını gerektirir. Daha sonra, bu proteinin biyolojik bir yol üzerindeki etkisi değerlendirilir. Her araştırma yaklaşımının kendine özgü avantajları ve sınırlamaları olmasına rağ....

Protokol

1. Numune hazırlama

1. Rekombinant FEN1'i saflaştırmak için, daha önce Ononye ve ^ark.8 tarafından tarif edildiği gibi BL21 (DE3) hücrelerindeki yapıyı (pET-FCH-FEN1) eksprese edin.
   1. LB ortamını (Tablo 1) gece boyunca% 1 kültür ile aşılayın ve hücreleri OD 0.6'ya ulaşana kadar 37 ° C'de büyütün.
   2. 0.4 M izopropil-beta-D-tiyogalaktozit (IPTG) ile indükleyin ve kültürü 3 saat daha büyütün.
   3. Kültürü 5.000 × g'da 4 ° C'de 15 dakika santrifüjleyerek hücreleri hasat edin. Peleti -80°C'lik bir dondurucuda saklayın.
   4. Saflaştırma gününd....

Tartışmalar

Afinite kromatografisi, DNA bağlayıcı proteinleri saflaştırmak için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. İmmobilize metal afinite kromatografisi (IMAC), bir peptit dizisinin histidin kalıntılarını yakalamak için metal iyonlarını kullanan spesifik bir afinite kromatografisi türüdür. Bu nedenle "6X-His etiketi" veya "poli-His etiketi", saflaştırılacak proteinlerin N-terminaline veya C-terminaline eklenir. Nikel ve kobalt en yaygın kullanılan metal iyonlarıdır v.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
4x Laemmli sample buffer	BioRad	1610747
Acetic acid	Merck	UN2789
Beta-mercaptoethanol (BME)	Sigma	M-6250
Chromlab software version 6.1.27.0	BioRad		operates the NGC system
Complete MINI protease inhibitor tablet	Roche	11836153001
Coomassie Brilliant Blue R	Sigma	B0149
Dithiothreitol (DTT)	Dot Scientific	DSD11000
Econo-Column glass	BioRad	7371512
Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)	Dot Scientific	DSE57020
Flow adaptor	BioRad	7380014
Glycerol	Dot Scientific	DSG22020
Imidazole	Dot Scientific	DSI52000
Methanol	Fisher Scientific	A412
Mini PROTEAN TGX gels	BioRad	4561084
NGC Chromatography System	BioRad		automated liquid chromatography system
Ni-NTA Agarose	Qiagen	1018244
Phenyl-methyl-sulfonyl fluoride	Dot Scientific	DSP20270
PreScission Plus Protein Dual Color Standards	BioRad	1610374
Sodium chloride	Dot Scientific	DSS23020
TALON metal affinity resin	Takara	635502
Tris Base		DST60040