Purification d’affinité d’une protéine marquée 6X-His à l’aide d’un système de chromatographie liquide à protéines rapides

Résumé

Cet article fournit une procédure pour la purification d’affinité d’une protéine recombinante humaine, l’endonucléase de lambeau 1 (FEN1), qui a été marquée avec un marqueur 6X-histidine. Le protocole implique l’utilisation de deux colonnes d’ions métalliques immobilisées distinctes pour la purification de la protéine marquée.

Résumé

La caractérisation fonctionnelle des protéines nécessite qu’elles soient exprimées et purifiées en quantités substantielles avec une grande pureté pour effectuer des analyses biochimiques. Le système de chromatographie liquide rapide des protéines (FPLC) permet la séparation à haute résolution de mélanges de protéines complexes. En ajustant divers paramètres dans FPLC, tels que la sélection de la matrice de purification appropriée, la régulation de la température de l’échantillon de protéine et la gestion du débit de l’échantillon sur la matrice et du taux d’élution, il est possible d’assurer la stabilité et la fonctionnalité de la protéine. Dans ce protocole, nous démontrerons la polyvalence du système FPLC pour purifier la protéine FEN1 (6X-His-tagged flap endonucléase 1), produite dans des cultures bactériennes. Pour améliorer l’efficacité de la purification des protéines, nous nous concentrerons sur de multiples considérations, notamment l’emballage et la préparation appropriés de la colonne, l’injection d’échantillons à l’aide d’une boucle d’échantillon, le débit d’application de l’échantillon dans la colonne et les paramètres d’élution de l’échantillon. Enfin, le chromatogramme sera analysé afin d’identifier les fractions contenant des rendements élevés de protéines et les considérations pour un stockage approprié à long terme des protéines recombinantes. L’optimisation des méthodes de purification des protéines est cruciale pour améliorer la précision et la fiabilité de l’analyse des protéines.

Introduction

De nombreuses stratégies sont disponibles pour comprendre la biologie cellulaire. Une approche implique une stratégie descendante, dans laquelle des mutations génétiques sont introduites dans un gène, suivies de l’évaluation des changements phénotypiques qui en résultent dans un organisme modèle. À l’inverse, une approche réductionniste implique l’élucidation initiale des mécanismes moléculaires et des fonctions enzymatiques d’une protéine particulière, accompagnée de la caractérisation de ses interactions avec d’autres composants cellulaires. Par la suite, l’impact de cette protéine sur une voie biologique est évalué. Bien que chaque....

Protocole

1. Préparation de l’échantillon

1. Pour purifier FEN1 recombinant, exprimez la construction (pET-FCH-FEN1) dans les cellules BL21(DE3) comme décrit précédemment par Ononye et ^al.8.
   1. Inocuculer le milieu LB (tableau 1) avec une culture de nuit à 1 % et faire croître les cellules à 37 °C jusqu’à ce que la DO atteigne 0,6.
   2. Induire avec 0,4 M d’isopropyl-bêta-D-thiogalactoside (IPTG) et faire pousser la culture pendant 3 h supplémentaires.
   3. Récoltez les cellules en centrifugeant la culture à 5 000 × g pendant 15 min à 4 °C. Conservez les ....

Discussion

La chromatographie d’affinité est une technique largement utilisée pour purifier les protéines de liaison à l’ADN. La chromatographie d’affinité métallique immobilisée (IMAC) est un type spécifique de chromatographie d’affinité qui utilise des ions métalliques pour capturer les résidus d’histidine d’une séquence peptidique. C’est pourquoi le « 6X-His tag » ou « poly-His tag » est attaché au N-terminal ou au C-terminal des protéines à purifier. Le nickel e.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4x Laemmli sample buffer	BioRad	1610747
Acetic acid	Merck	UN2789
Beta-mercaptoethanol (BME)	Sigma	M-6250
Chromlab software version 6.1.27.0	BioRad		operates the NGC system
Complete MINI protease inhibitor tablet	Roche	11836153001
Coomassie Brilliant Blue R	Sigma	B0149
Dithiothreitol (DTT)	Dot Scientific	DSD11000
Econo-Column glass	BioRad	7371512
Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)	Dot Scientific	DSE57020
Flow adaptor	BioRad	7380014
Glycerol	Dot Scientific	DSG22020
Imidazole	Dot Scientific	DSI52000
Methanol	Fisher Scientific	A412
Mini PROTEAN TGX gels	BioRad	4561084
NGC Chromatography System	BioRad		automated liquid chromatography system
Ni-NTA Agarose	Qiagen	1018244
Phenyl-methyl-sulfonyl fluoride	Dot Scientific	DSP20270
PreScission Plus Protein Dual Color Standards	BioRad	1610374
Sodium chloride	Dot Scientific	DSS23020
TALON metal affinity resin	Takara	635502
Tris Base		DST60040