טיהור זיקה של חלבון 6X-His-Tagged באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית של חלבון מהיר

Summary

מאמר זה מספק הליך לטיהור זיקה של חלבון רקומביננטי אנושי, דש אנדונוקלאז 1 (FEN1), אשר תויג בתג 6X-היסטידין. הפרוטוקול כולל שימוש בשני עמודי יונים מתכתיים משותקים נפרדים לטיהור החלבון המתויג.

Abstract

אפיון פונקציונלי של חלבונים מחייב ביטוי וטיהור שלהם בכמויות משמעותיות עם טוהר גבוה לביצוע בדיקות ביוכימיות. מערכת Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) מאפשרת הפרדה ברזולוציה גבוהה של תערובות חלבונים מורכבות. על ידי התאמת פרמטרים שונים ב-FPLC, כגון בחירת מטריצת הטיהור המתאימה, ויסות טמפרטורת דגימת החלבון, וניהול קצב זרימת הדגימה על גבי המטריצה וקצב האלוטיון, ניתן להבטיח את יציבות החלבון ותפקודו. בפרוטוקול זה, נדגים את הרבגוניות של מערכת FPLC לטיהור חלבון 6X-His-tagged flap endonuclease 1 (FEN1), המיוצר בתרביות חיידקים. כדי לשפר את יעילות טיהור החלבון, נתמקד במספר שיקולים, כולל אריזה והכנה נכונה של הטורים, הזרקת דגימה באמצעות לולאת דגימה, קצב זרימת יישום הדגימה לעמודה ופרמטרים של אלוציית דגימה. לבסוף, הכרומטוגרמה תנותח כדי לזהות שברים המכילים תפוקות גבוהות של חלבון ושיקולים לאחסון תקין של חלבון רקומביננטי לטווח ארוך. אופטימיזציה של שיטות טיהור חלבונים חיונית לשיפור הדיוק והאמינות של ניתוח חלבונים.

Introduction

קיימות אסטרטגיות רבות להבנת הביולוגיה התאית. גישה אחת כוללת אסטרטגיה מלמעלה למטה, שבה מוטציות גנטיות מוכנסות לתוך גן, ואחריו הערכה של שינויים פנוטיפיים כתוצאה מכך אורגניזם מודל. לעומת זאת, גישה רדוקציוניסטית כרוכה בהבהרה ראשונית של מנגנונים מולקולריים ופונקציות אנזימטיות של חלבון מסוים, המלווה באפיון יחסי הגומלין שלו עם רכיבים תאיים אחרים. לאחר מכן, ההשפעה של חלבון זה על מסלול ביולוגי מוערך. למרות שלכל גישה מחקרית יתרונות ומגבלות מובנים, השגת הבנה מקיפה של מסלול ביולוגי מחייבת חקירות בין-תחומיות.

מכיוון שהדנ"א הוא התוכנית הגנטית של החיים, הבנת מנגנוני שכפול הדנ"א ותחזוקת הגנום היא תחום עניין פעיל כבר למעלה ....

Protocol

1. הכנת מדגם

1. כדי לטהר FEN1 רקומביננטי, בטא את המבנה (pET-FCH-FEN1) בתאי BL21(DE3) כפי שתואר קודם לכן על ידי Ononye et ^al.8.
   1. חסן את מדיית LB (טבלה 1) בתרבית לילה של 1% והגדל את התאים בטמפרטורה של 37°C עד שה-OD יגיע ל-0.6.
   2. יש להשרות עם איזופרופיל-בטא-D-תיוגלאקטוזיד (IPTG) במינון 0.4M ולגדל את התרבית למשך 3 שעות נוספות.
   3. קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה של התרבית ב 5,000 × גרם במשך 15 דקות ב 4 °C (75 °F). אחסנו את הגלולה במקפיא בטמפרטורה של -80°C.
   4. ביום הטיהור, הסר את גלולת התא מהמקפיא של -80 מעלות צלזיוס, אפשר לה להפשיר על ק....

תוצאות

BL21 (DE3) תאי ליזטים המבטאים hFEN1 הועברו דרך שרפים שווי משקל של Ni-NTA ו-TALON. שרף Ni-NTA טעון ביוני Ni²⁺ ובעל יכולת קשירה גבוהה. התוצאות מראות כי שרף Ni-NTA מניב כמות גבוהה יותר של FEN1 בהשוואה לשרף TALON (איור 7). שרף Ni-NTA ידוע גם כלא נקשר באופן ספציפי לחלבונים אחרים המבוטא?.......

Discussion

כרומטוגרפיית זיקה היא טכניקה נפוצה לטיהור חלבונים קושרי DNA. IMAC (ראשי תיבות של Immobilized Metal Affinity Chromatography) היא סוג מסוים של כרומטוגרפיית זיקה המשתמשת ביוני מתכת כדי ללכוד את שאריות ההיסטידין של רצף פפטידי. זו הסיבה שהתג "6X-His tag" או "poly-His tag" מוצמד ל-N-terminus או ל-C-terminus של חלבונים שיש .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4x Laemmli sample buffer	BioRad	1610747
Acetic acid	Merck	UN2789
Beta-mercaptoethanol (BME)	Sigma	M-6250
Chromlab software version 6.1.27.0	BioRad		operates the NGC system
Complete MINI protease inhibitor tablet	Roche	11836153001
Coomassie Brilliant Blue R	Sigma	B0149
Dithiothreitol (DTT)	Dot Scientific	DSD11000
Econo-Column glass	BioRad	7371512
Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)	Dot Scientific	DSE57020
Flow adaptor	BioRad	7380014
Glycerol	Dot Scientific	DSG22020
Imidazole	Dot Scientific	DSI52000
Methanol	Fisher Scientific	A412
Mini PROTEAN TGX gels	BioRad	4561084
NGC Chromatography System	BioRad		automated liquid chromatography system
Ni-NTA Agarose	Qiagen	1018244
Phenyl-methyl-sulfonyl fluoride	Dot Scientific	DSP20270
PreScission Plus Protein Dual Color Standards	BioRad	1610374
Sodium chloride	Dot Scientific	DSS23020
TALON metal affinity resin	Takara	635502
Tris Base		DST60040