Fast Protein 액체 크로마토그래피 시스템을 사용한 6X-His-Tagged 단백질의 친화성 정제

요약

이 기사에서는 6X-histidine 태그로 라벨링된 인간 재조합 단백질인 flap endonuclease 1(FEN1)의 친화성 정제 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 태그된 단백질의 정제를 위해 두 개의 뚜렷한 고정화된 금속 이온 컬럼을 사용하는 것을 포함합니다.

초록

단백질의 기능적 특성을 규명하려면 생화학적 분석을 수행하기 위해 단백질을 고순도로 상당한 양으로 발현하고 정제해야 합니다. 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC) 시스템을 사용하면 복잡한 단백질 혼합물을 고분해능으로 분리할 수 있습니다. FPLC에서 적절한 정제 매트릭스 선택, 단백질 샘플의 온도 조절, 매트릭스에 대한 샘플의 유속 및 용리 속도 관리와 같은 다양한 파라미터를 조정함으로써 단백질의 안정성과 기능을 보장할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 박테리아 배양에서 생산된 6X-His 태그 플랩 엔도뉴클레아제 1(FEN1) 단백질을 정제하기 위한 FPLC 시스템의 다양성을 입증합니다. 단백질 정제 효율성을 개선하기 위해 적절한 컬럼 패킹 및 준비, 시료 루프를 사용한 시료 주입, 컬럼에 대한 시료 적용 유속, 시료 용리 파라미터 등 여러 고려 사항에 중점을 둘 것입니다. 마지막으로, 크로마토그램을 분석하여 높은 수율의 단백질을 함유한 분획을 식별하고 적절한 재조합 단백질 장기 보관을 위한 고려 사항을 식별합니다. 단백질 정제 분석법의 최적화는 단백질 분석의 정밀도와 신뢰성을 개선하는 데 매우 중요합니다.

서문

세포 생물학을 이해하기 위해 수많은 전략을 사용할 수 있습니다. 한 가지 접근법은 유전적 돌연변이를 유전자에 도입한 다음 모델 유기체에서 결과적으로 발생하는 표현형 변화를 평가하는 하향식 전략입니다. 반대로, 환원주의적 접근법은 특정 단백질의 분자 메커니즘 및 효소 기능의 초기 설명과 다른 세포 구성 요소와의 상호 작용의 특성화를 수반합니다. 그 후, 이 단백질이 생물학적 경로에 미치는 영향을 평가합니다. 각 연구 접근 방식에는 고유한 장점과 한계가 있지만 생물학적 경로에 대한 포괄적인 이해를 달성하려면 학제 간 연구가 필요합니다.

DNA가 생명체의 유전적 청사진이기 때문에 DNA 복제 및 게놈 유지의 메커니즘을 이해하는 것은 70년 이상 동안 활발한 관심 분야였습니다. DNA 복제 분야의 연구는 수많은 복제 단백질의 개별 구조와 기능에 관한 풍부한 데이터를 산출했습니다. 기계론적 측면과 생화학적 활성 분석을 포괄하는 이러한 연구는 이러한 단백질의 정제를 통해 실현 가능해졌으며, 이를 통해 체외 환경에서 세심한 검사를 수행할 수 있습니다. 결과적으로, 단백질 정제는 DNA 복제에 대한 기계론적 통찰을 밝히기 위한 대부분의 연구 노력에서 없어서는 안 될 유비쿼터스 기술....

프로토콜

1. 시료 전처리

1. 재조합 FEN1을 정제하기 위해, 이전에 Ononye et ^al.8에 의해 기술된 바와 같이 BL21(DE3) 세포에서 구조체(pET-FCH-FEN1)를 발현시킨다.
   1. LB 배지(표 1)에 1% 야간 배양액을 접종하고 OD가 0.6이 될 때까지 37°C에서 세포를 성장시킵니다.
   2. 0.4M 이소프로필-베타-D-티오갈락토사이드(IPTG)로 유도하고 추가로 3시간 동안 배양액을 성장시킵니다.
   3. 5,000× g 에서 4°C에서 15분 동안 배양액을 원심분리하여 세포를 수확합니다. 펠릿을 -80°C 냉동고에 보관하십시오.
   4. 정제 당일, -80°C 냉동고에서 세포 펠릿을 제거하고 얼음에서 해동시킨 다음 펠릿을 100mL의 용해 완충액에 재현탁시킵니다(표 1).
      알림: 세포 용해물은 단백질 분해를 방지하기 위해 취급 중에는 항상 얼음 위에 놓아야 합니다. 해동이 완료되면 전체 정제 과정을 같은 날에 완료해야 합니다. 세포 용해물은 밤새 냉장고에 보관해서는 안 됩니다.

토론

친화성 크로마토그래피는 DNA 결합 단백질을 정제하는 데 널리 사용되는 기술입니다. IMAC(Immobilized Metal Affinity Chromatography)는 금속 이온을 사용하여 펩타이드 염기서열의 히스티딘 잔기를 포획하는 특정 유형의 친화성 크로마토그래피입니다. 이것이 "6X-His 태그" 또는 "poly-His 태그"가 정제할 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 부착되는 이유입니다. 니켈과 코발트는 가장 일반적.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4x Laemmli sample buffer	BioRad	1610747
Acetic acid	Merck	UN2789
Beta-mercaptoethanol (BME)	Sigma	M-6250
Chromlab software version 6.1.27.0	BioRad		operates the NGC system
Complete MINI protease inhibitor tablet	Roche	11836153001
Coomassie Brilliant Blue R	Sigma	B0149
Dithiothreitol (DTT)	Dot Scientific	DSD11000
Econo-Column glass	BioRad	7371512
Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)	Dot Scientific	DSE57020
Flow adaptor	BioRad	7380014
Glycerol	Dot Scientific	DSG22020
Imidazole	Dot Scientific	DSI52000
Methanol	Fisher Scientific	A412
Mini PROTEAN TGX gels	BioRad	4561084
NGC Chromatography System	BioRad		automated liquid chromatography system
Ni-NTA Agarose	Qiagen	1018244
Phenyl-methyl-sulfonyl fluoride	Dot Scientific	DSP20270
PreScission Plus Protein Dual Color Standards	BioRad	1610374
Sodium chloride	Dot Scientific	DSS23020
TALON metal affinity resin	Takara	635502
Tris Base		DST60040