大鼠和小鼠眼球组织学载玻片的制备和分析以评估视网膜

摘要

本手稿介绍了啮齿动物眼球载玻片的组织学制备方案。使用所提出的方法，可以在光学显微镜下轻松观察和评估视网膜内层。该程序适用于小鼠和大鼠的眼球。

摘要

啮齿动物眼球是研究许多眼科疾病病理机制的有力工具，例如青光眼、高血压性视网膜病变等等。临床前实验使研究人员能够检查新药的疗效，开发新的治疗方法，或寻找与疾病发作或进展有关的新病理机制。组织学检查提供了大量必要的信息来评估所进行实验的效果，并且可以揭示变性、组织重塑、浸润和许多其他病理。在临床研究中，很少有机会获得适合组织学检查的眼组织，这就是为什么研究人员应该利用检查啮齿动物眼球提供的机会。本手稿提出了啮齿动物眼球切片的组织学制备方案。该程序针对小鼠和大鼠的眼球，包括以下步骤:（i） 收获眼球，（ii） 保存眼球以供进一步分析，（iii） 在石蜡中处理组织，（iv） 准备载玻片，（v） 用苏木精和伊红染色，（vi） 在光学显微镜下评估组织。使用所提出的方法，可以很容易地可视化和详细评估视网膜。

引言

眼球是一个球状结构，构成了视觉器官。眼球内部可分为两段:眼前段，包括角膜、虹膜、睫状体、晶状体、前房和后房，以及后段，包括玻璃体、视网膜、脉络膜、巩膜、视神经头。前房位于角膜和虹膜之间 ^1,2。虹膜是一个圆形结构，中心有一个开口，称为瞳孔。在角膜和虹膜的交界处，有引流角，一个专门的小梁系统将房水从眼球引流到静脉系统。后房由虹膜、睫状体和晶状体以及将晶状体固定到位的悬韧带束缚。晶状体后面是玻璃体，这是眼球最大的结构。玻璃体粘附在视网膜上并稳定其位置。视网膜被脉络膜和巩膜¹ 包围。眼球的解剖结构总结在 图 1 中。

眼球壁由三层组成。最外层是巩膜，它保护眼球免受伤害并保持其形状。在眼球的前极，巩膜变成透明的角膜。在巩膜下，有一个称为葡萄膜的血管结构，其主要功能是滋养眼睛的结构。葡萄膜形成脉络膜，在前极内形成睫状体和虹膜¹。最内层是视网膜，它是眼睛的高度专业化结构，由神经元、神经胶质细胞和色素上皮细胞组成。视网膜神经元包括感光细胞（视杆细胞和视锥细胞）、水平细胞、双极细胞、无长突细胞和视网膜神经节细胞 （RGC）。这些细胞被组织成复杂的层，它们的作用是接收和处理光刺激 ^2,3。视网膜的神经胶质细胞包括 Müller 细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞，它们存在于视网膜的所有层中。神经胶质细胞的许多功能包括神经元的营养、支持血液视网膜屏障、为神经元提供结构支持以维持视网膜的分层结构、调节神经元的新陈代谢、分泌调节神经元的功能、生长和存活的生物活性蛋白，以及调节视网膜内的免疫过程⁴.色素上皮细胞构成视网膜的最外层，充当脉络膜和光感受器之间的屏障。这些细胞调节废物和营养物质的双向运输，并通过吸收光能和中和光产生的活性氧来保护视网膜免受过度光诱导的损伤⁵。

视网膜可分为十层:（i） 视网膜色素上皮，（ii） 感光器节段层（视杆细胞和视锥细胞），（iii） 外界膜 （ELM），（iv） 外核层 （ONL），（v） 外丛状层 （OPL），（vi） 内核层 （INL），（vii） 内丛状层 （IPL），（viii） 神经节细胞层 （GCL），（ix） 视网膜神经纤维层 （RNFL）， （x） 内界膜 （ILM）²。视网膜的有核层包括 ONL、INL 和 GCL，而细胞之间具有突触连接的层包括 OPL 和 IPL⁶。杆细胞核和视锥细胞核形成 ONL，它们的轴突延伸到 OPL 中，在那里它们连接到双极和水平细胞的树突。在 INL 中，水平细胞核、双极细胞核和无长突细胞核位于该细胞核内。在 IPL 中，双极和无长突细胞的轴突末端与 RGC 的树突形成突触。在 GCL 中，RGC 构成了大部分细胞体，但在那里也可以找到一些脱位的无长突细胞。RGC 的轴突形成 RNFL，进一步形成视神经 ^7,8,9。

许多眼科疾病，如视网膜神经退行性疾病，会导致不可逆和无法治愈的失明¹⁰。视力被认为是最重要的感官之一¹¹，永久性失明会大大降低患者的生活质量。为了进一步了解许多疾病的病理机制，广泛使用细胞培养物或动物模型进行临床前研究。使用实验动物进行的临床前研究为评估眼病的病理机制和开发新的治疗策略提供了机会。眼病可以在大型动物（猴子、奶牛、狗和猫）和小动物（兔子、大鼠、小鼠和斑马鱼）中建模。由于体型较大，使用较大的动物可以更好地接近眼睛。另一方面，由于啮齿动物的繁殖速度相对较快，对啮齿动物进行的实验允许培育以易患某些疾病为特征的自交系^12,13。

在动物模型中，摘除术是可能的，这使得能够对眼球进行详细的组织病理学检查，并评估在疾病发展过程中出现在眼睛特定结构中的轻微病症 - 这种检查在人类中很少进行。在研究眼部疾病的病理机制时，组织病理学评估是一种非常有价值的工具。在已发表的文献中，对眼球组织学检查方法的描述非常有限，并且缺乏分步指南，这使得初学者难以重现。本研究旨在提供一种简单明了的制备组织学载玻片和评估大鼠和小鼠视网膜的方法。

研究方案

该研究是按照机构指南进行的。本研究中使用的眼球是从根据波兰华沙华沙生命科学大学^{第 2 届} 地方伦理委员会颁发的研究批准号 WAW2/122/2020 进行的研究批准号 WAW2/122/2020 进行的实验中获得的。我们的方案是通过检查 11 周龄和 44 周龄的小鼠以及 6 、 12 周和 16 周龄的大鼠而开发的。

1. 小鼠眼球的制备

注:该方案介绍了制备小鼠眼球切片的方法，并且是使用从以下来源收获的眼球开发的:11 周龄的雌性 C57Bl/6 小鼠（平均体重 21 克），44 周龄的雌性 C57Bl/6 小鼠（平均体重 25 克），11 周龄的雌性 DBA/2 小鼠（平均体重 21.5 克）和 44 周龄的青光眼雌性 DBA/2 小鼠（平均体重 25 克）。

1. 摘出术
   1. 使用小镊子打开眼睑。按压眼睑使眼球脱垂。
   2. 用小而锋利的剪刀剪掉眼球后面的组织，从眼窝中解剖眼球。一旦眼球从眼眶中取出，就切断突出的结缔组织和眼周肌。
      1. 标记眼球以获得更好的方向，例如，在眼球外直肌的肌腱残端上系上一根小缝合线，以标记眼球的颞侧。
2. 组织固定
   1. 将去核的眼球放入 1.5 mL 微量离心管中，使其在溶解在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中的 4% 多聚甲醛 （PFA） 溶液中静置 24 小时。
   2. 在此之后，在 10% 蔗糖溶液中处理眼球 24 小时，然后取出并在 20% 蔗糖溶液中放置 24 小时，最后，取出并在 30% 蔗糖溶液中放置 24 小时。
      注意:在整个过程中，将眼球保持在 4 °C 的低温下。 应避免穿刺蔗糖浸润，以尽量减少眼球损伤的风险。
3. 组织冷冻和储存
   1. 从蔗糖溶液中取出眼球，然后用纸巾轻轻擦拭擦干。
   2. 将眼球放入干净的 1.5 mL 微量离心管中，并在 - 80 °C 下冷冻以备将来处理。
      注意:如果储存在 - 80 °C 下，眼球可以保持活力长达 12 个月，直到将来处理。
4. 玻片制备
   1. 在室温下解冻眼球。将其从微量离心管中移入盒中，在流水下冲洗 20 分钟以洗掉蔗糖。
   2. 将眼球放入通风橱下，然后将其从以下溶液中取出，使其脱水:70% 乙醇 （EtOH） 溶液 10 分钟，80% 乙醇溶液 10 分钟，96% 乙醇溶液 10 分钟，99.9% 乙醇溶液 10 分钟，丙酮 5 分钟。
   3. 在通风橱下将眼球置于二甲苯中 5 分钟，以清除眼球。
   4. 将一些固体石蜡放入烧杯中，并将其放入实验室培养箱中，使其温度高于石蜡制造商规定的熔融温度（石蜡的熔融温度在 46 °C 至 68 °C 之间），以熔化石蜡。石蜡完全熔化后（时间取决于使用石蜡的量），将眼球移入装有石蜡的烧杯中，并在培养箱中保温 1 小时。在石蜡浸润到组织中 1 小时期间，每 10 - 15 分钟搅拌一次石蜡。
      注:此步骤可以使用在搅拌溶液时启用石蜡浸润的组织脱水机。
   5. 如下所述，将眼球嵌入石蜡块中。
      1. 打开包埋盒并取下顶盖。选择金属模具，倒入少量石蜡覆盖模具底部。用镊子从盒中取出眼球，并将其放在模具中的石蜡上。将眼球放在一侧，以确保在矢状面上切割。
         注意:将眼球侧放（前杆在一侧，后杆在另一侧）将能够在矢状面上进行切割。这样，将获得穿过角膜、虹膜、睫状体、瞳孔、周边和中央视网膜的切片。
      2. 在设置为 - 15 °C 的冷却板上短暂冷却模具，使石蜡略微凝固，从而将组织固定到位。小心地用石蜡覆盖组织和包埋盒底部，形成一个块。将块放在冷却板上以完全凝固。然后，从金属模具中取出石蜡块，将石蜡块放回冷却板上至少 15 分钟冷却后再切割。
   6. 在切片机中固定石蜡块。设置切片机以从块中修剪多余的石蜡（我们将其设置为切割 15 μm）并修剪至眼球中心。更改切片机设置以切割较薄的切片（我们将其设置为切割 3.5 μm）并将切片放在载玻片上。如果使用切片机和相邻的水浴，请用湿纸巾去除载玻片上多余的水。
      注意:目标是通过瞳孔获得至少 3 个横截面。研究人员经验越少，应获得更多的切片以确保在瞳孔水平进行切片。将几个部分放在一张幻灯片上。此外，对于经验不足的研究人员，将组织切得更厚，例如，切成 4 μm 或 5 μm 厚的切片。与使用没有水浴的切片机相比，使用带有相邻水浴的切片机可以更轻松地将组织切片转移到载玻片上。另一点值得注意的是，镜头可能很难切穿。为了最大限度地降低脆性晶状体损伤组织的风险，请仅使用专门用于切割硬组织的锋利切片机刀片。考虑使用一个刀片进行修剪，使用另一个刀片切割切片，以尽量减少刀片的钝化。
   7. 将载玻片放入设置为 56 °C 的实验室培养箱中 30 分钟。
   8. 从培养箱中取出载玻片，然后开始手动用苏木精和伊红 （H&E） 染色，依次将载玻片放入以下溶液中或从以下溶液中取出。从 7 分钟二甲苯、5 分钟二甲苯（另一个装有干净溶液的烧杯）和 5 分钟二甲苯（另一个装有干净溶液的烧杯）开始。然后加入 2 分钟 96% 乙醇、1 分钟 96% 乙醇（另一个装有干净溶液的烧杯）、1 分钟 96% 乙醇（另一个装有干净溶液的烧杯）。
   9. 用 5 分钟的流水清洗，然后用 2 分钟的 Mayer 苏木精、2 分钟的 Mayer 苏木精（另一个装有干净溶液的烧杯）、5 分钟的流水、5 分钟的流水（另一个干净的烧杯）。
   10. 加入 1% 曙红 2 分钟，然后加入 1 分钟 96% 乙醇、30 秒 96% 乙醇（另一个装有干净溶液的烧杯）、30 秒 96% 乙醇（另一个装有干净溶液的烧杯）、2 分钟二甲苯、1 分钟二甲苯（另一个装有干净溶液的烧杯）、2 分钟二甲苯（另一个装有干净溶液的烧杯）。
       注:或者，使用自动玻片染色机。
   11. 使用自动玻片封口机密封玻片。准备好的载玻片已准备好在光学显微镜下储存和评估。
       注:或者，通过在染色组织上放置一层薄薄的聚苯乙烯封固剂并用玻璃盖玻片覆盖来手动进行载玻片密封。
       注意:包括 PFA、EtOH、丙酮和二甲苯的步骤应在实验室通风橱下进行。

2. 大鼠眼球切片的准备和载玻片安装

注:该方案介绍了制备大鼠眼球切片的方法，并使用从以下位置收获的眼球开发:6 周龄雄性 SHR 大鼠（平均体重 115.5 克），12 周龄患有动脉高血压的雄性 SHR 大鼠（平均体重 262.5 克），6 周龄雄性 WKY 大鼠（平均体重 143.5 克），12 周龄雄性 WKY 大鼠（平均体重 265 克）， 12 周龄的雄性 Lewis 大鼠 （平均体重 310 g） 和 16 周龄的雄性 Lewis 大鼠 （平均体重 259 g）。

1. 摘出术
   1. 使用小镊子打开眼睑。按压眼睑以使眼球脱垂。
   2. 用小而锋利的剪刀剪掉眼球后面的组织，从眼窝中解剖眼球。
      注意:标记眼球以获得更好的方向，例如，在眼球外直肌的肌腱残端上系上一根小缝合线，以标记眼球的颞侧。
2. 组织固定
   1. 将去核的眼球放入 1.5 mL 微量离心管中，使其在溶于磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中的 4% 多聚甲醛 （PFA） 溶液中静置 24 小时。
   2. 在此之后，在 10% 蔗糖溶液中处理眼球 24 小时，然后取出并在 20% 蔗糖溶液中放置 24 小时，最后取出并在 30% 蔗糖溶液中放置 24 小时。
      注意:在整个过程中，将眼球保持在 4 °C 的低温下。 应避免穿刺蔗糖浸润，以尽量减少眼球损伤的风险。
3. 组织冷冻和储存
   1. 从蔗糖溶液中取出眼球，然后用纸巾轻轻擦拭擦干。
   2. 将眼球放入干净的 1.5 mL 微量离心管中，并在 -80 °C 下冷冻以备将来处理。
      注意:如果储存在 -80 °C 下，眼球可以保持活力长达 12 个月，直到将来处理。
4. 玻片制备
   1. 从冰箱和微量离心管中取出眼球。用锋利的手术刀沿矢状面将眼球切成两半。取下并丢弃镜头。
      注意:此步骤最容易对刚从冰箱中取出的冷冻眼球进行。在眼球切割过程中，晶状体可能会损坏周围组织。为了尽量减少损坏的风险，请使用非常锋利的手术刀并保持谨慎。
   2. 在室温下解冻眼球。将两半移入盒中，在流水下冲洗 20 分钟以洗掉蔗糖。
   3. 将眼球放入通风橱下的以下溶液中，然后将其从中取出，使其脱水:70% 乙醇 （EtOH） 溶液 15 分钟，80% 乙醇溶液 15 分钟，96% 乙醇溶液 15 分钟，99.9% 乙醇溶液 15 分钟，丙酮 7 分钟。
   4. 通过在通风橱下将眼球置于二甲苯中 7 分钟来清除眼球。
   5. 将一些固体石蜡放入烧杯中，并将其放入实验室培养箱中，使其温度高于石蜡制造商规定的熔融温度（石蜡的熔融温度在 46 °C 至 68 °C 之间），以熔化石蜡。石蜡完全熔化后（时间取决于石蜡的用量），将眼球移入装有石蜡的烧杯中，并在培养箱中保温 1 小时。在石蜡浸润到组织中 1 小时期间，每 10 - 15 分钟搅拌一次石蜡。
      注:此步骤可以使用在搅拌溶液时启用石蜡浸润的组织脱水机。
   6. 如下所述，将眼球嵌入石蜡块中。
      1. 打开包埋盒并取下顶盖。选择金属模具，倒入少量石蜡覆盖模具底部。用镊子从盒中取出眼球，并将其放在模具中的石蜡上。将一个眼球的一半放在杯子底部向上，另一个眼球向下。
         注意:将眼球的两半放在杯子的底部向上，另一半向下，以便在矢状面上切割组织。这样，将获得穿过角膜、虹膜、睫状体、瞳孔、周边和中央视网膜的切片。
      2. 在设置为 - 15 °C 的冷却板上短暂冷却模具，使石蜡略微凝固并将眼球固定到位。小心地用石蜡覆盖眼球和包埋盒底部，形成一个块。将块放在冷却板上以完全凝固。然后，从金属模具中取出石蜡块，将石蜡块放回冷却板上至少 15 分钟冷却后再切割。
   7. 在切片机中固定石蜡块。设置切片机以修剪块中多余的石蜡（我们将其设置为切割 15 μm）并修剪直到到达眼球中心。更改切片机设置以切割较薄的切片（我们将其设置为切割 3.5 μm）并将切片放在载玻片上。如果您使用的切片机带有相邻的水浴，请用湿纸巾去除载玻片上多余的水。
      注意:目标是通过瞳孔获得至少 3 个横截面。研究人员经验越少，应获得更多的切片以确保在瞳孔水平进行切片。将几个部分放在一张幻灯片上。此外，对于经验不足的研究人员，将组织切得更厚，例如，切成 4 μm 或 5 μm 厚的切片。与使用没有水浴的切片机相比，使用带有相邻水浴的切片机可以更轻松地将组织切片转移到载玻片上。
   8. 取下载玻片，开始手动用苏木精和伊红 （H&E） 染色，依次将载玻片放入以下溶液中或从以下溶液中取出。从 7 分钟二甲苯、5 分钟二甲苯（另一个装有干净溶液的烧杯）和 5 分钟二甲苯（另一个装有干净溶液的烧杯）开始。然后加入 2 分钟 96% 乙醇、1 分钟 96% 乙醇（另一个装有干净溶液的烧杯）、1 分钟 96% 乙醇（另一个装有干净溶液的烧杯）。
   9. 用 5 分钟的流水清洗，然后用 2 分钟的 Mayer 苏木精、2 分钟的 Mayer 苏木精（另一个装有干净溶液的烧杯）、5 分钟的流水、5 分钟的流水（另一个干净的烧杯）。
   10. 加入 1% 曙红 2 分钟，然后加入 1 分钟 96% 乙醇、30 秒 96% 乙醇（另一个装有干净溶液的烧杯）、30 秒 96% 乙醇（另一个装有干净溶液的烧杯）、2 分钟二甲苯、1 分钟二甲苯（另一个装有干净溶液的烧杯）、2 分钟二甲苯（另一个装有干净溶液的烧杯）。
       注:或者，使用自动玻片染色机。
   11. 使用自动玻片封口机密封玻片。准备好的载玻片可在光学显微镜下储存和评估。
       注:或者，通过在染色组织上放置一层薄薄的聚苯乙烯封片剂并用玻璃盖玻片覆盖来手动进行载玻片密封。
       注意:包括 PFA、EtOH、丙酮和二甲苯的步骤应在实验室通风橱下进行。

3. 评估眼球部分

1. 玻片扫描
   1. 将载玻片放入组织病理学载玻片扫描仪中，并使用扫描模式扫描切片:40 倍。将图像存储为高分辨率数字文件。
2. 幻灯片分析
   1. 使用图像查看软件打开扫描的文件。查找瞳孔截面并分析三个连续的截面。
   2. 找到视网膜最厚的部分，然后按右上角的放大框并选择 20 倍，将图像放大到 20 倍。将鼠标移动到视网膜最厚部分的 ELM 水平，然后按鼠标右键，选择 注释和 标尺.
   3. 将鼠标移向 ILM 并单击左侧按钮。将测量命名为 RT，然后选中 Show title （显示标题） 和 show length （显示长度） 复选框。这样，将测量视网膜厚度 （RT），并且测量值将以 μm 为单位显示。代表性结果如图 2 和 图 3 所示。
   4. 使用尺子测量每个视网膜层的厚度，包括 ONL、OPL、INL 和 IPL，并标记它们。代表性结果如图 4 和 图 5 所示。
   5. 要计算 GCL 内的细胞数量，请确定视网膜的预定长度。例如，对于小鼠视网膜，使用一个 500 μm 切片，对于大鼠视网膜，使用五个 100 μm 切片。
   6. 使用标尺测量沿 GCL 的所选距离。按鼠标右键并选择 Annotate > Saved > 1x RBC（注释 1x RBC）。在预定长度的视网膜上，沿 GCL 单击每个被识别为圆形苏木精染色体的细胞。计算被包围的单元格的数量。代表性结果如图 6 和 图 7 所示。
   7. 分析三个连续部分后，绘制所有测量值的平均值。

结果

通过使用所提出的协议，可以详细评估眼球特定结构的解剖结构和形态。我们的团队专注于研究视网膜疾病（如青光眼、糖尿病性视网膜病变和高血压性视网膜病变）神经退行性的病理机制。为了评估视网膜神经退行性变的特征，我们评估了 RT（小鼠眼球 - 图 2，大鼠眼球 - 图 3）、ONL、OPL、INL 和 IPL（小鼠眼球 -

讨论

小鼠和大鼠眼球的组织学检查是实验眼科领域的有力工具。它可以提供与眼科疾病过程中眼部结构变化相关的新信息，否则在临床环境中不会观察到这些信息。所描述的方案提出了一种对视网膜进行组织学分析的简单方法。此处不描述处理前组织（例如角膜）所需的程序的微妙之处。

在所介绍的研究中，在对动物实施安乐死后进行眼球摘除术，因为?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Chempur	111024800
Dumont Tweezers #5, 11cm, 0.05 x 0.01mm Tips	World Precision Instruments	14095	small, microsurgical forceps
Eosin	Mar-Four	4P.05.2001/L	Aqueous solution
Ethyl alcohol 96 %	Chempur	CH.ET.AL.96%CZDA.CH
Ethyl alcohol 99.9 %	Chempur	CH.ETYL.ALK.99,9%BW	Use to prepare 70% and 80% solutions of EtOH
Glacier - 86 °C Ultralow Temperature Freezer NU-9483E	NuAire	13027D0034	Freezing temperature - 80 °C
Glass slides	Mar-Four	MI.15.01673	Ground glass slides with a double-sided matte field for description
Leica CV5030 Fully Automated Glass Coverslipper	Leica Biosystems	14,04,78,80,101	Automated slide sealer
Mayer's hematoxylin	Chempur	124687402
Metal base molds 15 mm  x 15 mm	Leica Biosystems	3803081
Microme HM 340 E	Thermo Scientific	90-519-0	Microtome
Microtome razor blades	Mar-Four	HI.N.35	Cutting angle 35°
Micro-Twin biopsy cassette	Mar-Four	LN.13874550
Microwave Hybrid Tissue Processor	Milestone
Multistainer Leica ST5020	Leica Biosystems		Automated slide stainer
NanoZoomer 2.0-HT slide scanner	Hamamatsu	C9600	Histopathological slide scanner
NDP.view2 Image viewing software	Hamamatsu	U12388-01	Image viewing software
Paraffin Pathowax Plus	Mar-Four	4P.PWP.010	Melting temperature 56 °C - 58 °C
Paraformaldehyde	Sigma - Aldrich	441244-1KG	Prepare a 4% solution in PBS
PBS Tablets	Merck Millipore	524650-1EA	Use to prepare a solution of phosphate buffer saline, per manufacturer's instructions
Pierce Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL	Thermo Scientific	69715
Refrigerator-freezer EN14000AW	Electrolux	925032562-00	refrigeration 4 °C
Scalpel blade	Swann-Morton	T.OST.SKAL00.024
Sucrose	Chempur	427720906
SuperCut Spring Scissors, 12.5cm, Curved	World Precision Instruments	501925	curved, small microsurgical scissors
Tape for automatic sealers	Mar-Four	KP-3020/SMRH001
Xylene	Chempur	CH.KSYL.5l.METAL.OP