網膜を評価するためのラットおよびマウス眼球の組織学的スライドの調製と分析

要約

この原稿は、げっ歯類の眼球からのスライドの組織学的調製のためのプロトコルを提示します。提案手法により、内側の網膜を光学顕微鏡で容易に可視化し、評価することができる。この手順は、マウスとラットの眼球に提示されます。

要約

げっ歯類の眼球は、緑内障、高血圧性網膜症など、多くの眼科疾患の病態メカニズムを研究するための強力なツールです。前臨床試験により、研究者は新薬の有効性を調べたり、新しい治療法を開発したり、病気の発症や進行に関与する新しい病態メカニズムを探したりすることができます。組織学的検査は、実施された実験の影響を評価するために必要な多くの情報を提供し、変性、組織リモデリング、浸潤、およびその他の多くの病状を明らかにすることができます。臨床研究では、組織学的検査に適した眼組織が得られる可能性はほとんどないため、研究者はげっ歯類の眼球の検査によって提供される機会を利用する必要があります。この原稿は、げっ歯類の眼球切片の組織学的調製のためのプロトコルを提示します。この手順は、マウスおよびラットの眼球に対して提示され、(i)眼球の採取、(ii)さらなる分析のための眼球の保存、(iii)パラフィンでの組織の処理、(iv)スライドの調製、(v)ヘマトキシリンおよびエオシンによる染色、(vi)光学顕微鏡下での組織の評価。提案手法により、網膜を容易に可視化し、詳細に評価することができます。

概要

眼球は、視覚器官を構成する球体のような構造です。眼球の内部は、角膜、虹彩、毛様体、水晶体、前房、および後房を含む前眼部と、硝子体、網膜、脈絡膜、強膜、視神経乳頭を含む後眼部の2つのセグメントに分けることができます。前房は角膜と^虹彩1,2の間に位置しています。虹彩は、瞳孔と呼ばれる中央に開口部がある円形の構造です。角膜と虹彩の接合部には、小柱の特殊なシステムが眼球から静脈系に房水を排出するドレナージ角度があります。後房は、虹彩、毛様体、水晶体、および水晶体を所定の位置に保持する懸垂靭帯によって結合されています。レンズの後ろには、眼球の最大の構造である硝子体が配置されています。硝子体は網膜に付着し、その位置を安定させます。網膜は脈絡膜と強膜に囲まれています¹。眼球の解剖学的構造を図1にまとめます。

眼球壁は3つの層で構成されています。最も外側の層は強膜で、眼球を怪我から守り、その形状を保ちます。眼球の前極で、強膜は透明な角膜に変わります。強膜の下には、ブドウ膜と呼ばれる血管構造があり、その主な機能は目の構造に栄養を与えることです。ブドウ膜は脈絡膜を形成し、前極内では毛様体と虹彩^{を形成します1}。最も内側の層は網膜であり、これはニューロン、グリア細胞、色素上皮細胞で構成される目の高度に特殊化された構造です。網膜ニューロンには、視細胞(桿体および錐体)、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、および網膜神経節細胞(RGC)が含まれます。これらの細胞は複雑な層に組織化されており、その役割は光刺激を受け取って処理することです^2,3。網膜のグリア細胞は、網膜のすべての層に存在するミュラー細胞、星状細胞、およびミクログリアで構成されています。グリア細胞の多くの機能には、ニューロンの栄養、血液網膜関門のサポート、網膜の層状構造を維持するためのニューロンの構造的サポート、ニューロンの代謝の調節、ニューロンの機能、成長、生存を調節する生物学的に活性なタンパク質の分泌、および網膜内の免疫学的プロセスの調節が含まれます⁴.色素上皮細胞は網膜の最外層を構成し、脈絡膜と視細胞の間のバリアとして機能します。これらの細胞は、老廃物や栄養素の双方向輸送を調節するとともに、光エネルギーを吸収し、光で生成された活性酸素種を中和することで、網膜を過度の光による損傷から保護します⁵。

網膜は、(i)網膜色素上皮、(ii)視細胞セグメント層(桿体および錐体)、(iii)外部制限膜(ELM)、(iv)外部核層(ONL)、(v)外側網状層(OPL)、(vi)内部核層(INL)、(vii)内側網状層(IPL)、(viii)神経節細胞層(GCL)、(ix)網膜神経線維層(RNFL)、 (x)内部制限膜(ILM)²。網膜の核層には、ONL、INL、およびGCLが含まれ、細胞間のシナプス結合を有する層には、OPLおよびIPL^{が含まれます6}。桿体と錐体の核はONLを形成し、それらの軸索はOPLに伸び、そこで双極細胞と水平細胞の樹状突起に接続します。INL内には、水平細胞、双極細胞、およびアマクリン細胞の核があります。IPL内では、バイポーラ細胞およびアマクリン細胞の軸索終末は、RGCの樹状突起とシナプスを形成します。GCL内では、RGCが細胞体の大部分を占めていますが、脱臼したアマクリン細胞もそこに見られます。RGCの軸索はRNFLを形成し、さらに視神経^7,8,9を形成します。

網膜の神経変性疾患など、多くの眼科疾患は、不可逆的で不治の失明につながります¹⁰。視覚は最も重要な感覚の11つと考えられており¹¹、永久的な失明は患者の生活の質を著しく低下させます。多くの疾患の病態メカニズムの理解をさらに進めるために、細胞培養や動物モデルを用いた前臨床研究が広く行われています。実験動物を用いた前臨床試験は、眼疾患の病態メカニズムを評価し、新たな治療戦略を開発する機会を提供します。眼疾患は、大型動物 (サル、ウシ、イヌ、ネコ) と小動物 (ウサギ、ラット、マウス、ゼブラフィッシュ) の両方でモデル化できます。より大きな動物を使用すると、そのサイズのために目へのアクセスが容易になります。一方、げっ歯類を用いて行われた実験は、その比較的急速な繁殖のために、特定の疾患に対する感受性を特徴とする近交系の繁殖を可能にする^12,13。

動物モデルでは、眼球の組織病理学的検査を行い、疾患の発症中に眼の特定の構造に現れる軽度の病状を評価することで、眼球の詳細な組織病理学的検査を行うことが可能であり、これはヒトでは非常にまれにしか行われない検査である。病理組織学的評価は、眼疾患の病態メカニズムを研究する上で非常に貴重なツールです。発表された文献では、眼球の組織学的検査の方法論の説明は非常に限られており、ステップバイステップのガイドが不足しているため、初心者が再現することは困難です。この研究は、組織学的スライドを準備し、ラットとマウスの網膜を評価するためのシンプルで簡潔な方法を提供することを目的としています。

プロトコル

この研究は、機関のガイドラインに準拠して実施されました。この研究で使用された眼球は、ポーランドのワルシャワにあるワルシャワ生命科学大学の第^2回地方 倫理委員会が発行した研究承認番号WAW2/122/2020に基づいて実施された実験に含まれる動物から採取されました。私たちのプロトコルは、11週齢と44週齢のマウス、および6週齢、12週齢、16週齢のラットを調べることによって開発されました。

1.マウスの眼球の調製

注:このプロトコルは、マウスの眼球の切片を調製する方法を示し、11週齢の雌C57Bl/6マウス(平均重量21g)、44週齢の雌C57Bl/6マウス(平均重量25g)、11週齢の雌DBA/2マウス(平均重量21.5g)、および緑内障の44週齢の雌DBA/2マウス(平均重量25g)から採取した眼球を使用して開発されました。

1. 摘出
   1. 小さな鉗子を使ってまぶたを開きます。まぶたを押して眼球を脱出させます。
   2. 小さくて鋭いハサミで眼球の後ろの組織を切り取り、眼球をソケットから解剖します。眼球が眼窩から取り除かれたら、突き出た結合組織と眼周囲筋を切り取ります。
      1. たとえば、眼球の外側直筋の腱の切り株に小さな縫合糸を結び、眼球の側頭側をマークするなど、向きを良くするために眼球に印を付けます。
2. 組織の固定
   1. 除核した眼球を1.5mLの微量遠心チューブに入れ、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解したパラホルムアルデヒド(PFA)の4%溶液に24時間休ませます。
   2. これに続いて、眼球をスクロースの10%溶液で24時間処理し、次にスクロースの20%溶液で24時間取り出して置き、最後に、スクロースの30%溶液で24時間取り出して置きます。
      注意: プロセス全体を通して、眼球を4°Cの低温に保ちます。 スクロース浸潤のための針の穿刺は、眼球の損傷のリスクを最小限に抑えるために避けるべきです。
3. ティッシュの凍結と保管
   1. ショ糖溶液から眼球を取り出し、ペーパータオルで軽くたたいて乾かします。
   2. 眼球を清潔な1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れ、将来の処理のために-80°Cで凍結します。
      注:-80°Cで保存した場合、眼球は将来の処理まで最大12か月間生存し続けることができます。
4. スライドの準備
   1. 眼球を室温で解凍します。微量遠心チューブからカセットに移し、流水で20分間すすぎ、ショ糖を洗い流します。
   2. 眼球をヒュームフードの下に入れ、次に次の溶液から取り出します:エチルアルコール(EtOH)の70%溶液で10分間、EtOHの80%溶液で10分間、EtOHの96%溶液で10分間、EtOHの99.9%溶液で10分間、アセトンで5分間。
   3. ヒュームフードの下に5分間キシレンに入れて眼球をきれいにします。
   4. 固体パラフィンをビーカーに入れ、パラフィン製造業者が指定した融解温度(パラフィンの融解温度は46°C〜68°C)よりも高い温度に設定した実験室のインキュベーターに入れて、パラフィンを溶かします。パラフィンが完全に溶けた後(時間は使用済みパラフィンの量によって異なります)、眼球をパラフィンの入ったビーカーに移し、インキュベーター内で1時間保温します。パラフィンが組織に浸透してから1時間の間に、10〜15分ごとにパラフィンを攪拌します。
      注:このステップには、溶液を攪拌しながらパラフィン浸潤を可能にするティッシュプロセッサーを使用することができます。
   5. 以下で説明するように、眼球をパラフィンブロックに埋め込みます。
      1. カセットを開き、トップカバーを取り外します。金型を選び、型底を覆うように少量のパラフィンを注ぎます。鉗子でカセットから眼球を取り出し、型内のパラフィンに置きます。矢状面で確実に切断されるように、眼球を横に置きます。
         注意: 眼球を横に置くと(前極を片側に、後極を反対側に)、矢状面を切断できます。このようにして、角膜、虹彩、毛様体、瞳孔、末梢、および中心網膜を通る切片が得られます。
      2. -15°Cに設定された冷却プレートで型を短時間冷却し、パラフィンがわずかに固化して組織を所定の位置に固定します。組織をパラフィンで慎重に覆い、カセットの底をブロックを形成します。ブロックを冷却プレートの上に置いて、完全に固めます。次に、ブロックを金型から取り外し、パラフィンブロックを冷却プレートに戻し、少なくとも15分間冷ましてから切断します。
   6. ミクロトームにパラフィンブロックを固定します。ミクロトームをブロックから余分なパラフィンを切り取るようにセットし(15μmカットするように設定します)、眼球の中心まで切り取ります。ミクロトームの設定を変更して、より薄い切片を切断し(3.5μmを切断するように設定)、切片をスライド上に置きます。隣接するウォーターバスを備えたミクロトームを使用する場合は、湿ったティッシュでスライドから余分な水分を取り除きます。
      注:目標は、瞳孔を通して少なくとも3つの断面を取得することです。研究者の経験が浅いほど、瞳孔のレベルで切片化を確実にするために、より多くの切片を取得する必要があります。1 つのスライドにいくつかのセクションを配置します。また、経験の浅い研究者の場合は、組織を厚く、たとえば4 μmまたは5 μmの厚さに切断します。隣接するウォーターバスを備えたミクロトームを使用すると、ウォーターバスを使用しないミクロトームを使用する場合と比較して、組織切片をスライドに移すプロセスがはるかに容易になります。また、レンズが切り込みにくい場合もあるので注意が必要です。もろいレンズによる組織損傷のリスクを最小限に抑えるために、硬組織を切断するために指定された鋭利なミクロトームブレードのみを使用してください。ブレードの鈍化を最小限に抑えるために、1つのブレードをトリミングに使用し、もう1つのブレードをセクションの切断に使用することを検討してください。
   7. スライドを56°Cに設定した実験用インキュベーターに30分間入れます。
   8. インキュベーターからスライドを取り出し、スライドを次の溶液に順次入れたり取り出したりして、手動でヘマトキシリンとエオシン(H&E)による染色を開始します。7分間のキシレン、5分間のキシレン(きれいな溶液を含む別のビーカー)、および5分間のキシレン(クリーンな溶液を含む別のビーカー)から始めます。これに続いて、2分間の96%EtOH、1分間の96%EtOH(クリーンな溶液を含む別のビーカー)、1分間の96%EtOH(クリーンな溶液を含む別のビーカー)を使用します。
   9. 5分間の流水で洗い、次に2分間のメイヤーヘマトキシリン、2分間のメイヤーのヘマトキシリン(きれいな溶液を含む別のビーカー)、5分間の流水、5分間の流水(別のきれいなビーカー)で洗います。
   10. 1% Eosinを2分間添加し、続いて1 min 96% EtOH、30 s 96% EtOH(清浄な溶液を含む別のビーカー)、30 s 96% EtOH(清浄な溶液を含む別のビーカー)、2 分間キシレン、1 分間キシレン(清浄な溶液を含む別のビーカー)、2 分間キシレン(別のビーカーと清浄な溶液)を添加します。
       注:または、自動スライドステイナーを使用します。
   11. 自動スライドシーラーを使用してスライドをシールします。準備されたスライドは、光学顕微鏡で保管および評価する準備ができています。
       注:または、染色した組織にポリスチレンマウンタントの薄層を置き、ガラスカバースリップで覆うことにより、手動でスライドシールを実行します。
       注意: PFA、EtOH、アセトン、キシレンを含む手順は、実験室のヒュームフードの下で実行する必要があります。

2. ラット眼球切片の作製とスライド取付

注:このプロトコルは、ラットの眼球の切片を準備する方法を示し、以下から採取した眼球を使用して開発されました:6週齢の雄SHRラット(平均重量115.5g)、動脈性高血圧症の12週齢の雄SHRラット(平均重量262.5g)、6週齢の雄WKYラット(平均重量143.5g)、12週齢の雄WKYラット(平均重量265g)、 12週齢の雄ルイスラット(平均体重310g)、および糖尿病誘発性糖尿病を有する16週齢の雄ルイスラット(平均体重259g)。

1. 摘出
   1. 小さな鉗子を使ってまぶたを開きます。まぶたを押して眼球を脱出させます。
   2. 小さくて鋭いハサミで眼球の後ろの組織を切り取り、眼球をソケットから解剖します。
      注:たとえば、眼球の外側直筋の腱の切り株に小さな縫合糸を結び、眼球の側頭側をマークすることにより、向きを良くするために眼球に印を付けます。
2. 組織の固定
   1. 除核した眼球を1.5 mLの微量遠心チューブに入れ、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解したパラホルムアルデヒド(PFA)の4%溶液に24時間休ませます。
   2. これに続いて、眼球を10%ショ糖溶液で24時間処理し、次に取り出して20%ショ糖溶液に24時間置き、最後に取り出してショ糖30%溶液に24時間置きます。
      注意: プロセス全体を通して、眼球を4°Cの低温に保ちます。 スクロース浸潤のための針の穿刺は、眼球の損傷のリスクを最小限に抑えるために避けるべきです。
3. ティッシュの凍結と保管
   1. ショ糖溶液から眼球を取り出し、ペーパータオルで軽くたたいて乾かします。
   2. 眼球を清潔な1.5 mL微量遠心チューブに入れ、将来の処理のために-80°Cで凍結します。
      注:-80°Cで保存した場合、眼球は将来の処理まで最大12か月間生存し続けることができます。
4. スライドの準備
   1. 眼球を冷凍庫と微量遠心チューブから取り出します。鋭いメスで矢状面に沿って眼球を半分に切ります。レンズを取り外して廃棄します。
      注:この手順は、冷凍庫から取り出したばかりの冷凍眼球で実行するのが最も簡単です。眼球の切断中、水晶体が周囲の組織を損傷する可能性があります。損傷のリスクを最小限に抑えるために、非常に鋭利なメスを使用し、注意を怠らないでください。
   2. 眼球を室温で解凍します。2つの半分をカセットに入れ、流水で20分間すすぎ、ショ糖を洗い流します。
   3. 眼球をヒュームフードの下に入れ、次に取り出して脱水します:70%エチルアルコール(EtOH)溶液15分間、80%EtOH溶液15分間、96%EtOH溶液15分間、99.9%EtOH溶液15分間、アセトン7分間。
   4. 眼球をキシレンに7分間入れて、ドラフトの下に置きます。
   5. 固体パラフィンをビーカーに入れ、パラフィン製造業者が指定した融解温度(パラフィンの融解温度は46°C〜68°C)よりも高い温度に設定した実験室のインキュベーターに入れて、パラフィンを溶かします。パラフィンが完全に溶けた後(時間は使用するパラフィンの量によって異なります)、眼球をパラフィンの入ったビーカーに移し、インキュベーター内で1時間保温します。パラフィンが組織に浸透してから1時間の間に、10〜15分ごとにパラフィンを攪拌します。
      注:このステップには、溶液を攪拌しながらパラフィン浸潤を可能にするティッシュプロセッサーを使用することができます。
   6. 以下で説明するように、眼球をパラフィンブロックに埋め込みます。
      1. カセットを開き、トップカバーを取り外します。金型を選び、型底を覆うように少量のパラフィンを注ぎます。鉗子でカセットから眼球を取り出し、型内のパラフィンに置きます。片方の眼球の半分をカップの底を上にして置き、もう片方を下にして置きます。
         注:眼球の半分をカップの底を上にして半分を上にし、もう半分を下にして配置すると、矢状面での組織切断が可能になります。このようにして、角膜、虹彩、毛様体、瞳孔、末梢、および中心網膜を通る切片が得られます。
      2. -15°Cに設定された冷却プレートで金型を短時間冷却し、パラフィンがわずかに固化して眼球を所定の位置に固定します。眼球をパラフィンで丁寧に覆い、カセットの底をブロック状にします。ブロックを冷却プレートの上に置いて、完全に固めます。次に、ブロックを金型から取り外し、パラフィンブロックを冷却プレートに戻し、少なくとも15分間冷ましてから切断します。
   7. ミクロトームにパラフィンブロックを固定します。ミクロトームをブロックから余分なパラフィンをトリミングするようにセットし(15μmカットするように設定)、眼球の中心に達するまでトリミングします。ミクロトームの設定を変更して、より薄い切片を切断し(3.5μmを切断するように設定)、切片をスライド上に置きます。隣接するウォーターバスを備えたミクロトームを使用している場合は、湿ったティッシュでスライドから余分な水分を取り除きます。
      注:目標は、瞳孔を通して少なくとも3つの断面を取得することです。研究者の経験が浅いほど、瞳孔のレベルで切片化を確実にするために、より多くの切片を取得する必要があります。1 つのスライドにいくつかのセクションを配置します。また、経験の浅い研究者の場合は、組織を厚く、たとえば4 μmまたは5 μmの厚さに切断します。隣接するウォーターバスを備えたミクロトームを使用すると、ウォーターバスを使用しないミクロトームを使用する場合と比較して、組織切片をスライドに移すプロセスがはるかに容易になります。
   8. スライドを取り外し、ヘマトキシリンとエオシン(H&E)による染色を手動で開始するには、スライドを次の溶液に順次入れたり取り外したりします。7分間のキシレン、5分間のキシレン(きれいな溶液を含む別のビーカー)、および5分間のキシレン(クリーンな溶液を含む別のビーカー)から始めます。これに続いて、2分間の96%EtOH、1分間の96%EtOH(クリーンな溶液を含む別のビーカー)、1分間の96%EtOH(クリーンな溶液を含む別のビーカー)を使用します。
   9. 5分間の流水で洗い、次に2分間のメイヤーヘマトキシリン、2分間のメイヤーのヘマトキシリン(きれいな溶液を含む別のビーカー)、5分間の流水、5分間の流水(別のきれいなビーカー)で洗います。
   10. 1% Eosinを2分間添加し、続いて1 min 96% EtOH、30 s 96% EtOH(清浄な溶液を含む別のビーカー)、30 s 96% EtOH(清浄な溶液を含む別のビーカー)、2 分間キシレン、1 分間キシレン(清浄な溶液を含む別のビーカー)、2 分間キシレン(別のビーカーと清浄な溶液)を添加します。
       注:または、自動スライドステイナーを使用します。
   11. 自動スライドシーラーを使用してスライドをシールします。準備されたスライドは、光学顕微鏡で保管および評価する準備ができています。
       注:あるいは、染色された組織にポリスチレンマウンタンタントの薄層を置き、ガラスカバースリップで覆うことにより、手動でスライドシールを行います。
       注意: PFA、EtOH、アセトン、キシレンを含む手順は、実験室のヒュームフードの下で実行する必要があります。

3. 眼球部分の評価

1. スライドスキャン
   1. スライドを病理組織学的スライドスキャナーに入れ、スキャンモード(40倍)を使用して切片をスキャンします。画像を高解像度のデジタルファイルとして保存します。
2. スライド解析
   1. 画像表示ソフトウェアを使用してスキャンしたファイルを開きます。瞳断面を求め、連続する3つのセクションを解析します。
   2. 網膜の最も厚い部分を見つけ、右上隅にある倍率ボックスを押して 20倍を選択することで、画像を20倍に拡大します。マウスを網膜の最も厚い部分のELMのレベルに移動し、マウスの右ボタンを押して、[ 注釈]と [定規]を選択します。
   3. マウスをILMの方に移動し、左側のボタンをクリックします。測定にRTというタイトルを付け、タイトルを表示し、長さを表示するチェックボックスをオンにします。このようにして、網膜の厚さ (RT) が測定され、測定値が μm で表示されます。代表的な結果を 図 2 と 図 3 に示します。
   4. 定規を使用して、ONL、OPL、INL、IPLなどの各網膜層の厚さを測定し、それらにラベルを付けます。代表的な結果を 図 4 と 図 5 に示します。
   5. GCL内の細胞の数を数えるには、網膜の所定の長さを確立します。例えば、マウスの網膜には500μm切片を1つ、ラットの網膜には100μm切片を5つ使用します。
   6. 定規を使用して、GCLに沿って選択した距離を測定します。マウスの右ボタンを押し、[ Annotate > Saved > 1x RBC]を選択します。網膜の所定の長さにわたってGCLに沿って、丸いヘマトキシリン染色体として識別された各細胞をクリックします。丸で囲まれたセルの数を数えます。代表的な結果を 図 6 と 図 7 に示します。
   7. 3つの連続するセクションを分析した後、すべての測定値の平均を描画します。

結果

提示されたプロトコルの使用により、眼球の特定の構造の解剖学的構造および形態を詳細に評価することができる。当チームでは、緑内障、糖尿病性網膜症、高血圧性網膜症などの網膜疾患における神経変性の病態解明に取り組んでいます。網膜の神経変性の特徴を評価するために、RT(マウス眼球-図2、ラット眼球-図3)、O...

ディスカッション

マウスとラットの眼球の組織学的検査は、実験眼科の分野で強力なツールです。眼科疾患の経過に伴う眼の構造の変化に関連する新しい情報を提供できますが、これは臨床現場では観察されません。記載されたプロトコルは、網膜の組織学的分析を行う簡単な方法を提示する。角膜などの前部組織を処理するために必要な手順の微妙な点については、ここでは説明し...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Chempur	111024800
Dumont Tweezers #5, 11cm, 0.05 x 0.01mm Tips	World Precision Instruments	14095	small, microsurgical forceps
Eosin	Mar-Four	4P.05.2001/L	Aqueous solution
Ethyl alcohol 96 %	Chempur	CH.ET.AL.96%CZDA.CH
Ethyl alcohol 99.9 %	Chempur	CH.ETYL.ALK.99,9%BW	Use to prepare 70% and 80% solutions of EtOH
Glacier - 86 °C Ultralow Temperature Freezer NU-9483E	NuAire	13027D0034	Freezing temperature - 80 °C
Glass slides	Mar-Four	MI.15.01673	Ground glass slides with a double-sided matte field for description
Leica CV5030 Fully Automated Glass Coverslipper	Leica Biosystems	14,04,78,80,101	Automated slide sealer
Mayer's hematoxylin	Chempur	124687402
Metal base molds 15 mm  x 15 mm	Leica Biosystems	3803081
Microme HM 340 E	Thermo Scientific	90-519-0	Microtome
Microtome razor blades	Mar-Four	HI.N.35	Cutting angle 35°
Micro-Twin biopsy cassette	Mar-Four	LN.13874550
Microwave Hybrid Tissue Processor	Milestone
Multistainer Leica ST5020	Leica Biosystems		Automated slide stainer
NanoZoomer 2.0-HT slide scanner	Hamamatsu	C9600	Histopathological slide scanner
NDP.view2 Image viewing software	Hamamatsu	U12388-01	Image viewing software
Paraffin Pathowax Plus	Mar-Four	4P.PWP.010	Melting temperature 56 °C - 58 °C
Paraformaldehyde	Sigma - Aldrich	441244-1KG	Prepare a 4% solution in PBS
PBS Tablets	Merck Millipore	524650-1EA	Use to prepare a solution of phosphate buffer saline, per manufacturer's instructions
Pierce Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL	Thermo Scientific	69715
Refrigerator-freezer EN14000AW	Electrolux	925032562-00	refrigeration 4 °C
Scalpel blade	Swann-Morton	T.OST.SKAL00.024
Sucrose	Chempur	427720906
SuperCut Spring Scissors, 12.5cm, Curved	World Precision Instruments	501925	curved, small microsurgical scissors
Tape for automatic sealers	Mar-Four	KP-3020/SMRH001
Xylene	Chempur	CH.KSYL.5l.METAL.OP