網膜を評価するためのラットおよびマウス眼球の組織学的スライドの調製と分析

要約

この原稿は、げっ歯類の眼球からのスライドの組織学的調製のためのプロトコルを提示します。提案手法により、内側の網膜を光学顕微鏡で容易に可視化し、評価することができる。この手順は、マウスとラットの眼球に提示されます。

要約

げっ歯類の眼球は、緑内障、高血圧性網膜症など、多くの眼科疾患の病態メカニズムを研究するための強力なツールです。前臨床試験により、研究者は新薬の有効性を調べたり、新しい治療法を開発したり、病気の発症や進行に関与する新しい病態メカニズムを探したりすることができます。組織学的検査は、実施された実験の影響を評価するために必要な多くの情報を提供し、変性、組織リモデリング、浸潤、およびその他の多くの病状を明らかにすることができます。臨床研究では、組織学的検査に適した眼組織が得られる可能性はほとんどないため、研究者はげっ歯類の眼球の検査によって提供される機会を利用する必要があります。この原稿は、げっ歯類の眼球切片の組織学的調製のためのプロトコルを提示します。この手順は、マウスおよびラットの眼球に対して提示され、(i)眼球の採取、(ii)さらなる分析のための眼球の保存、(iii)パラフィンでの組織の処理、(iv)スライドの調製、(v)ヘマトキシリンおよびエオシンによる染色、(vi)光学顕微鏡下での組織の評価。提案手法により、網膜を容易に可視化し、詳細に評価することができます。

概要

眼球は、視覚器官を構成する球体のような構造です。眼球の内部は、角膜、虹彩、毛様体、水晶体、前房、および後房を含む前眼部と、硝子体、網膜、脈絡膜、強膜、視神経乳頭を含む後眼部の2つのセグメントに分けることができます。前房は角膜と^虹彩1,2の間に位置しています。虹彩は、瞳孔と呼ばれる中央に開口部がある円形の構造です。角膜と虹彩の接合部には、小柱の特殊なシステムが眼球から静脈系に房水を排出するドレナージ角度があります。後房は、虹彩、毛様体、水晶体、および水晶体を所定の位置に保持する懸垂靭帯によって結合されています。レンズの後ろには、眼球の最大の構造である硝子体が配置されています。硝子体は網膜に付着し、その位置を安定させます。網膜は脈絡膜と強膜に囲まれています¹。眼球の解剖学的構造を図1にまとめます。

眼球壁は3つの層で構成されています。最も外側の層は強膜で、眼球を怪我から守り、その形状を保ちます。眼球の前極で、強膜は透明な角膜に変わります。強膜の下には、ブドウ膜と呼ばれる血管構造があり、その主な機能は目の構造に栄養を与えることです。ブドウ膜は脈絡膜を形成し、前極内では毛様体と虹彩

プロトコル

この研究は、機関のガイドラインに準拠して実施されました。この研究で使用された眼球は、ポーランドのワルシャワにあるワルシャワ生命科学大学の第^2回地方 倫理委員会が発行した研究承認番号WAW2/122/2020に基づいて実施された実験に含まれる動物から採取されました。私たちのプロトコルは、11週齢と44週齢のマウス、および6週齢、12週齢、16週齢のラットを調べることによって開発されました。

1.マウスの眼球の調製

注:このプロトコルは、マウスの眼球の切片を調製する方法を示し、11週齢の雌C57Bl/6マウス(平均重量21g)、44週齢の雌C57Bl/6マウス(平均重量25g)、11週齢の雌DBA/2マウス(平均重量21.5g)、および緑内障の44週齢の雌DBA/2マウス(平均重量25g)から採取した眼球を使用して開発されました。

1. 摘出
   1. 小さな鉗子を使ってまぶたを開きます。まぶたを押して眼球を脱出させます。
   2. 小さくて鋭いハサミで眼球の後ろの組織を切り取り、眼球をソケットから解剖します。眼球が眼窩から取り除かれたら、突き出た結合組織と眼周囲筋を切り取ります。
      1. たとえば、眼球の外側直筋の腱の切り株に小さな縫合糸を結び、眼....

結果

提示されたプロトコルの使用により、眼球の特定の構造の解剖学的構造および形態を詳細に評価することができる。当チームでは、緑内障、糖尿病性網膜症、高血圧性網膜症などの網膜疾患における神経変性の病態解明に取り組んでいます。網膜の神経変性の特徴を評価するために、RT(マウス眼球-図2、ラット眼球-図3)、O.......

ディスカッション

マウスとラットの眼球の組織学的検査は、実験眼科の分野で強力なツールです。眼科疾患の経過に伴う眼の構造の変化に関連する新しい情報を提供できますが、これは臨床現場では観察されません。記載されたプロトコルは、網膜の組織学的分析を行う簡単な方法を提示する。角膜などの前部組織を処理するために必要な手順の微妙な点については、ここでは説明し.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Chempur	111024800
Dumont Tweezers #5, 11cm, 0.05 x 0.01mm Tips	World Precision Instruments	14095	small, microsurgical forceps
Eosin	Mar-Four	4P.05.2001/L	Aqueous solution
Ethyl alcohol 96 %	Chempur	CH.ET.AL.96%CZDA.CH
Ethyl alcohol 99.9 %	Chempur	CH.ETYL.ALK.99,9%BW	Use to prepare 70% and 80% solutions of EtOH
Glacier - 86 °C Ultralow Temperature Freezer NU-9483E	NuAire	13027D0034	Freezing temperature - 80 °C
Glass slides	Mar-Four	MI.15.01673	Ground glass slides with a double-sided matte field for description
Leica CV5030 Fully Automated Glass Coverslipper	Leica Biosystems	14,04,78,80,101	Automated slide sealer
Mayer's hematoxylin	Chempur	124687402
Metal base molds 15 mm  x 15 mm	Leica Biosystems	3803081
Microme HM 340 E	Thermo Scientific	90-519-0	Microtome
Microtome razor blades	Mar-Four	HI.N.35	Cutting angle 35°
Micro-Twin biopsy cassette	Mar-Four	LN.13874550
Microwave Hybrid Tissue Processor	Milestone
Multistainer Leica ST5020	Leica Biosystems		Automated slide stainer
NanoZoomer 2.0-HT slide scanner	Hamamatsu	C9600	Histopathological slide scanner
NDP.view2 Image viewing software	Hamamatsu	U12388-01	Image viewing software
Paraffin Pathowax Plus	Mar-Four	4P.PWP.010	Melting temperature 56 °C - 58 °C
Paraformaldehyde	Sigma - Aldrich	441244-1KG	Prepare a 4% solution in PBS
PBS Tablets	Merck Millipore	524650-1EA	Use to prepare a solution of phosphate buffer saline, per manufacturer's instructions
Pierce Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL	Thermo Scientific	69715
Refrigerator-freezer EN14000AW	Electrolux	925032562-00	refrigeration 4 °C
Scalpel blade	Swann-Morton	T.OST.SKAL00.024
Sucrose	Chempur	427720906
SuperCut Spring Scissors, 12.5cm, Curved	World Precision Instruments	501925	curved, small microsurgical scissors
Tape for automatic sealers	Mar-Four	KP-3020/SMRH001
Xylene	Chempur	CH.KSYL.5l.METAL.OP