Retinayı değerlendirmek için sıçan ve fare gözbebeklerinin histolojik slaytlarının hazırlanması ve analizi

Özet

Bu el yazması, kemirgen gözbebeklerinden slaytların histolojik olarak hazırlanması için bir protokol sunmaktadır. Önerilen yöntemle, iç retina ışık mikroskobu altında kolayca görüntülenebilir ve değerlendirilebilir. Prosedür, farelerin ve sıçanların gözbebekleri için sunulmuştur.

Özet

Kemirgen göz küresi, glokom, hipertansif retinopati ve daha pek çok oftalmik hastalığın patomekanizmalarını araştırmak için güçlü bir araçtır. Klinik öncesi deneyler, araştırmacıların yeni ilaçların etkinliğini incelemelerini, yeni tedavi yöntemleri geliştirmelerini veya hastalığın başlangıcında veya ilerlemesinde rol oynayan yeni patomekanizmaları aramalarını sağlar. Histolojik bir inceleme, yürütülen deneylerin etkilerini değerlendirmek için gerekli birçok bilgiyi sağlar ve dejenerasyon, doku yeniden şekillenmesi, infiltrasyon ve diğer birçok patolojiyi ortaya çıkarabilir. Klinik araştırmalarda, histolojik inceleme için uygun göz dokusu elde etme şansı nadiren vardır, bu nedenle araştırmacılar kemirgenlerden gözbebeklerinin incelenmesinin sunduğu fırsattan yararlanmalıdır. Bu makale, kemirgen göz kürelerinin kesitlerinin histolojik hazırlığı için bir protokol sunmaktadır. Prosedür farelerin ve sıçanların göz küreleri için sunulmuştur ve aşağıdaki adımları içerir: (i) göz küresinin toplanması, (ii) göz küresinin daha ileri analizler için saklanması, (iii) dokunun parafin içinde işlenmesi, (iv) slaytların hazırlanması, (v) hematoksilen ve eozin ile boyama, (vi) dokunun ışık mikroskobu altında değerlendirilmesi. Önerilen yöntem ile retina kolayca görselleştirilebilir ve ayrıntılı olarak değerlendirilebilir.

Giriş

Göz küresi, görme organını oluşturan küre benzeri bir yapıdır. Göz küresinin içi iki bölüme ayrılabilir: kornea, iris, siliyer cisim, lens, ön kamara ve arka odayı içeren ön segment ve vitröz gövde, retina, koroid, sklera, optik sinir başını içeren arka segment. Ön kamara, kornea ile iris ^1,2 arasında yer alır. İris, merkezinde göz bebeği adı verilen bir açıklığı olan dairesel bir yapıdır. Kornea ve irisin birleştiği yerde, özel bir trabekül sisteminin sulu mizahı göz küresinden venöz sisteme boşalttığı drenaj açısı vardır. Arka oda, iris, siliyer cisim ve lensin yanı sıra lensi yerinde tutan askı bağları ile bağlanır. Lensin arkasında, göz küresinin en büyük yapısı olan vitreus gövdesi bulunur. Vitreus gövdesi retinaya yapışır ve pozisyonunu stabilize eder. Retina koroid ve sklera ile çevrilidir¹. Göz küresinin anatomisi Şekil 1'de özetlenmiştir.

Göz küresi duvarı üç katmandan oluşur. En dış katman, göz küresini yaralanmalardan koruyan ve şeklini koruyan skleradır. Göz küresinin ön kutbunda, sklera şeffaf bir korneaya dönüşür. Skleranın altında, birincil işlevi göz yapılarını beslemek olan uvea adı verilen vasküler bir yapı vardır. Uvea koroidi oluşturur ve ön kutup içinde siliyer cisim ve iris¹. En iç katman, nöronlar, glial hücreler ve pigment epitel hücrelerinden oluşan, gözün oldukça özel bir yapısı olan retinadır. Retinal nöronlar, fotoreseptör hücrelerini (çubuklar ve koniler), yatay hücreleri, bipolar hücreleri, amakrin hücrelerini ve retinal ganglion hücrelerini (RGC'ler) içerir. Bu hücreler karmaşık katmanlar halinde düzenlenmiştir ve rolleri ışık uyaranlarını almak ve işlemektir ^2,3. Retinanın glial hücreleri, retinanın tüm katmanlarında bulunan Müller hücrelerini, astrositleri ve mikrogliaları içerir. Glial hücrelerin birçok işlevi arasında nöronların beslenmesi, kan-retina bariyerinin desteklenmesi, retinanın katmanlı yapısını korumak için nöronların yapısal desteği, nöronların metabolizmasının düzenlenmesi, nöronların işleyişini, büyümesini ve hayatta kalmasını düzenleyen biyolojik olarak aktif proteinlerin salgılanması ve retina içindeki immünolojik süreçlerin düzenlenmesi^{yer alır 4}. Pigment epitel hücreleri, retinanın en dış tabakasını oluşturur ve koroid ile fotoreseptörler arasında bir bariyer görevi görür. Bu hücreler, atık ürünlerin ve besin maddelerinin çift yönlü taşınmasını düzenler ve ayrıca ışık enerjisini emerek ve ışıkla üretilen reaktif oksijen türlerini nötralize ederek retinayı aşırı ışık kaynaklı hasardan korur⁵.

Retina on katmana ayrılabilir: (i) retina pigment epiteli, (ii) fotoreseptör segment tabakası (çubuklar ve koniler), (iii) dış sınırlayıcı membran (ELM), (iv) dış nükleer tabaka (ONL), (v) dış pleksiform tabaka (OPL), (vi) iç nükleer tabaka (INL), (vii) iç pleksiform tabaka (IPL), (viii) ganglion hücre tabakası (GCL), (ix) retina sinir lifi tabakası (RSLT), ve (x) iç sınırlayıcı membran (ILM)². Retinanın çekirdekli katmanları ONL, INL ve GCL'yi içerirken, hücreler arasında sinaptik bağlantıları olan katmanlar OPL ve IPL^6'yı içerir. Çubukların ve konilerin çekirdekleri ONL'yi oluşturur ve aksonları, bipolar ve yatay hücrelerin dendritlerine bağlandıkları OPL'ye uzanır. INL içinde yatay, bipolar ve amakrin hücre çekirdekleri bulunur. IPL içinde, bipolar ve amakrin hücrelerin akson terminalleri, RGC'lerin dendritleri ile sinaps yapar. GCL içinde, RGC'ler hücre gövdelerinin çoğunu oluşturur, ancak burada bazı çıkık amakrin hücreleri de bulunabilir. RGC'lerin aksonları RNFL'yi ve ayrıca - optik sinir 7,8,9'u oluşturur.

Retinanın nörodejeneratif bozuklukları gibi birçok oftalmik hastalık, geri dönüşü olmayan ve tedavi edilemez körlüğe yol açar¹⁰. Görme en önemli duyulardan biri olarak kabul edilir¹¹ ve kalıcı körlük hastanın yaşam kalitesini önemli ölçüde azaltır. Birçok hastalığın patomekanizmalarının daha iyi anlaşılmasını sağlamak için, hücre kültürleri veya hayvan modelleri kullanılarak yapılan klinik öncesi araştırmalar geniş çapta gerçekleştirilmektedir. Deney hayvanları kullanılarak yapılan preklinik çalışmalar, göz hastalıklarının altında yatan patomekanizmaların değerlendirilmesi ve yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesi için bir fırsat sunmaktadır. Göz hastalıkları hem büyük hayvanlarda (maymunlar, inekler, köpekler ve kediler) hem de küçük hayvanlarda (tavşanlar, sıçanlar, fareler ve zebra balığı) modellenebilir. Daha büyük hayvanların kullanılması, büyüklüğü nedeniyle göze daha iyi erişim sağlar. Öte yandan, kemirgenlerle yapılan deneyler, nispeten hızlı üremeleri nedeniyle, bazı hastalıklara duyarlılık ile karakterize edilen akraba suşların üremesine izin verir^12,13.

Hayvan modellerinde, hastalığın gelişimi sırasında gözün belirli yapılarında ortaya çıkan küçük patolojilerin değerlendirilmesi ile göz küresinin ayrıntılı bir histopatolojik incelemesinin yapılmasını sağlayan enükleasyon mümkündür - insanlar arasında çok nadiren yapılabilen bir muayene. Histopatolojik değerlendirme, oküler bozuklukların patomekanizmalarını araştırırken son derece değerli bir araçtır. Yayınlanmış literatürde, gözbebeklerinin histolojik muayenesi için metodolojinin açıklamaları çok sınırlıdır ve adım adım kılavuzlar eksiktir, bu da yeni başlayanların yeniden oluşturmasını zorlaştırır. Bu çalışma, histolojik slaytların hazırlanması ve sıçan ve fare retinasının değerlendirilmesi için basit ve özlü bir yöntem sağlamayı amaçlamaktadır.

Protokol

Araştırma, kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada kullanılan gözbebekleri, Polonya'nın Varşova kentindeki Varşova Yaşam Bilimleri Üniversitesi'ndeki 2^{. Yerel Etik} Kurulu tarafından verilen WAW2/122/2020 çalışma onayına dayalı olarak yürütülen bir deneye dahil edilen hayvanlardan elde edilmiştir. Protokolümüz 11 ve 44 haftalık fareler ve 6, 12 ve 16 haftalık sıçanlar incelenerek geliştirilmiştir.

1. Fare gözbebeklerinin hazırlanması

NOT: Bu protokol, fare gözbebeklerinin bölümlerini hazırlama yöntemini sunar ve aşağıdakilerden toplanan göz küreleri kullanılarak geliştirilmiştir: 11 haftalık dişi C57Bl / 6 fareler (ortalama ağırlık 21 g), 44 haftalık dişi C57Bl / 6 fareler (ortalama ağırlık 25 g), 11 haftalık dişi DBA / 2 fareler (ortalama ağırlık 21.5 g) ve glokomlu 44 haftalık dişi DBA / 2 fareler (ortalama ağırlık 25 g).

1. Enükleasyon
   1. Göz kapaklarını açmak için küçük forseps kullanın. Göz küresinin sarkması için göz kapaklarına bastırın.
   2. Göz küresinin arkasındaki dokuyu küçük, keskin bir makasla keserek göz küresini yuvadan çıkarın. Göz küresi yörüngeden çıkarıldıktan sonra, çıkıntılı bağ dokusunu ve göz çevresi kaslarını kesin.
      1. Daha iyi yönlendirme için gözbebeklerini işaretleyin, örneğin, göz küresinin temporal tarafını işaretlemek için göz küresinin lateral rektus kasının tendonunun kütüğüne küçük bir dikiş bağlayarak.
2. Dokuların fiksasyonu
   1. Enükleasyonlu göz küresini 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine yerleştirin ve 24 saat boyunca fosfat tampon salin (PBS) içinde çözülmüş %4'lük paraformaldehit (PFA) çözeltisinde dinlendirin.
   2. Bunu takiben, göz küresini 24 saat boyunca% 10'luk bir sükroz çözeltisi içinde muamele edin, daha sonra% 20'lik bir sükroz çözeltisi içinde 24 saat boyunca çıkarın ve yerleştirin ve son olarak,% 30'luk bir sükroz çözeltisi içinde 24 saat boyunca çıkarın.
      NOT: İşlem boyunca göz küresini 4 °C gibi düşük bir sıcaklıkta tutun. Göz küresi hasarı riskini en aza indirmek için sükroz infiltrasyonu için iğne deliklerinden kaçınılmalıdır.
3. Doku dondurma ve saklama
   1. Göz küresini sükroz solüsyonundan çıkarın ve bir kağıt havluyla hafifçe vurarak kurulayın.
   2. Göz küresini temiz bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve gelecekteki işlemler için - 80 °C'de dondurun.
      NOT: - 80 °C'de saklanırsa, bir göz küresi gelecekteki işlemlere kadar 12 aya kadar canlı kalabilir.
4. Slayt hazırlama
   1. Göz küresini oda sıcaklığında çözdürün. Mikrosantrifüj tüpünden bir kasete aktarın ve sakarozu yıkamak için 20 dakika akan su altında durulayın.
   2. Göz küresini bir çeker ocak altında aşağıdaki solüsyonlara yerleştirerek ve ardından çıkararak kurutun: 10 dakika boyunca% 70 etil alkol (EtOH) çözeltisi,% 80 10 dakika EtOH çözeltisi,% 96 10 dakika EtOH çözeltisi,% 99.9 10 dakika EtOH çözeltisi ve 5 dakika boyunca aseton.
   3. Çeker ocak altında 5 dakika boyunca ksilen içine yerleştirerek göz küresini temizleyin.
   4. Bir behere bir miktar katı parafin koyarak ve parafin üreticisi tarafından belirtilen erime sıcaklığından daha yüksek bir sıcaklığa ayarlanmış bir laboratuvar inkübatörüne koyarak parafini eritin (parafinin erime sıcaklığı 46 °C ile 68 °C arasındadır). Parafin tamamen eridikten sonra (süre kullanılan parafin miktarına bağlıdır), göz küresini parafinli behere doğru hareket ettirin ve inkübatörde 1 saat sıcak tutun. Dokuya 1 saatlik parafin infiltrasyonu sırasında, parafini her 10-15 dakikada bir karıştırın.
      NOT: Bu adım için çözeltiyi karıştırırken parafin sızmasını sağlayan bir doku işlemcisi kullanılabilir.
   5. Göz küresini aşağıda açıklandığı gibi bir parafin bloğuna gömün.
      1. Kaseti açın ve üst kapağı çıkarın. Metal bir kalıp seçin ve kalıbın altını kaplamak için az miktarda parafin dökün. Göz küresini forseps ile kasetten çıkarın ve kalıptaki parafinin üzerine yerleştirin. Sagital düzlemde kesmeyi sağlamak için göz küresini yan tarafına yerleştirin.
         NOT: Göz küresini yan yatırmak (ön kutup bir tarafa ve arka kutup diğer tarafa gelecek şekilde) sagital düzlemde kesmeyi mümkün kılacaktır. Bu şekilde kornea, iris, siliyer cisim, göz bebeği, periferik ve merkezi retinadan kesitler elde edilecektir.
      2. Parafinin dokuyu yerine sabitlemek için hafifçe katılaşması için kalıbı - 15 °C'ye ayarlanmış bir soğutma plakası üzerinde kısa bir süre soğutun. Bir blok oluşturmak için dokuyu parafin ve kaset tabanını dikkatlice örtün. Tamamen katılaşması için bloğu bir soğutma plakasına koyun. Ardından, bloğu metal kalıptan çıkarın ve parafin bloklarını kesmeden önce soğuması için en az 15 dakika soğutma plakasına geri yerleştirin.
   6. Mikrotomda bir parafin bloğu sabitleyin. Bloktaki fazla parafini kesmek için mikrotomu ayarlayın (15 μm kesecek şekilde ayarladık) ve göz küresinin ortasına kadar kesin. Daha ince kesitler kesmek için mikrotom ayarlarını değiştirin (3,5 μm kesecek şekilde ayarladık) ve kesiti bir slayt üzerine yerleştirin. Bitişik bir su banyosu olan bir mikrotom kullanıyorsanız, slayttaki fazla suyu nemli bir doku ile çıkarın.
      NOT: Amaç, göz bebeğinden en az 3 kesit elde etmektir. Araştırmacı ne kadar az deneyimli olursa, öğrenci düzeyinde kesit almayı sağlamak için o kadar çok kesit elde edilmelidir. Bir slayta birkaç bölüm yerleştirin. Ayrıca, daha az deneyimli araştırmacılar için, dokuyu daha kalın, örneğin 4 μm veya 5 μm kalınlığında bölümler halinde kesin. Bitişik bir su banyosuna sahip bir mikrotomun kullanılması, doku bölümlerinin slaytlara aktarılması işlemini, su banyosu olmayan mikrotomların kullanılmasına kıyasla çok daha kolay hale getirir. Kayda değer bir diğer nokta da lensin kesilmesinin zor olabileceğidir. Kırılgan lensin doku hasarı riskini en aza indirmek için, yalnızca sert dokuları kesmek için tasarlanmış keskin mikrotom bıçakları kullanın. Bıçağın körelmesini en aza indirmek için bir bıçağı kırpmak için ve diğerini bölümleri kesmek için kullanmayı düşünün.
   7. Slaytı 30 dakika boyunca 56 °C'ye ayarlanmış bir laboratuvar inkübatörüne yerleştirin.
   8. Slaytı inkübatörden çıkarın ve hematoksilen ve eozin (H & E) ile manuel olarak boyamaya başlayın, slaytı aşağıdaki solüsyonlara sırayla koyup çıkararak. 7 dakika ksilen, 5 dakika ksilen (temiz çözeltili başka bir beher) ve 5 dakika ksilen (temiz çözeltili başka bir beher) ile başlayın. Bunu 2 dk %96 EtOH, 1 dk %96 EtOH (temiz solüsyonlu başka bir beher), 1 dk %96 EtOH (temiz solüsyonlu başka bir beher) ile takip edin.
   9. 5 dakika akan suda, ardından 2 dakika Mayer hematoksilini, 2 dakika Mayer hematoksilini (temiz solüsyonlu başka bir beher), 5 dakika akan suda, 5 dakika akan suda (başka, temiz beher) yıkayın.
   10. 2 dakika boyunca% 1 Eosin ekleyin, ardından 1 dakika% 96 EtOH, 30 saniye% 96 EtOH (temiz çözeltili başka bir beher), 30 saniye% 96 EtOH (temiz çözeltili başka bir beher), 2 dakika ksilen, 1 dakika ksilen (temiz çözeltili başka bir beher), 2 dakika ksilen (temiz çözeltili başka bir beher).
       NOT: Alternatif olarak, otomatik bir slayt boyayıcı kullanın.
   11. Otomatik bir slayt kapatıcı kullanarak slaydı kapatın. Hazırlanan lam ışık mikroskobu altında saklanmaya ve değerlendirilmeye hazır hale gelir.
       NOT: Alternatif olarak, lekeli doku üzerine ince bir polistiren montaj tabakası yerleştirerek ve üzerini bir cam lamel ile kaplayarak sürgü sızdırmazlığını manuel olarak gerçekleştirin.
       DİKKAT: PFA, EtOH, aseton ve ksilen içeren adımlar bir laboratuvar çeker ocak altında gerçekleştirilmelidir.

2. Sıçan gözbebekleri bölümünün hazırlanması ve kızak montajı

NOT: Bu protokol, sıçan gözbebeklerinin kesitlerini hazırlama yöntemini sunar ve aşağıdakilerden toplanan gözbebekleri kullanılarak geliştirilmiştir: 6 haftalık erkek SHR sıçanları (ortalama ağırlık 115.5 g), arteriyel hipertansiyonu olan 12 haftalık erkek SHR sıçanları (ortalama ağırlık 262.5 g), 6 haftalık erkek WKY sıçanları (ortalama ağırlık 143.5 g), 12 haftalık erkek WKY sıçanları (ortalama ağırlık 265 g), 12 haftalık erkek Lewis sıçanları (ortalama ağırlık 310 g) ve indüklenmiş diabetes mellituslu 16 haftalık erkek Lewis sıçanları (ortalama ağırlık 259 g).

1. Enükleasyon
   1. Göz kapaklarını açmak için küçük forseps kullanın. Göz küresini sarkmak için göz kapaklarına bastırın.
   2. Göz küresinin arkasındaki dokuyu küçük, keskin bir makasla keserek göz küresini yuvadan çıkarın.
      NOT: Daha iyi yönlendirme için göz kürelerini işaretleyin, örneğinample, göz küresinin temporal tarafını işaretlemek için göz küresinin lateral rektus kasının tendonunun kütüğüne küçük bir dikiş bağlayarak.
2. Dokuların fiksasyonu
   1. Enükleasyonlu göz küresini 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve 24 saat boyunca fosfat tampon salin (PBS) içinde çözülmüş% 4'lük bir paraformaldehit (PFA) çözeltisi içinde dinlendirin.
   2. Bunu takiben, göz küresini 24 saat boyunca% 10'luk bir sükroz çözeltisi içinde muamele edin, daha sonra% 20'lik bir sükroz çözeltisi içinde 24 saat boyunca çıkarın ve yerleştirin ve son olarak% 30'luk bir sükroz çözeltisi içinde 24 saat boyunca çıkarın.
      NOT: İşlem boyunca göz küresini 4 °C gibi düşük bir sıcaklıkta tutun. Göz küresi hasarı riskini en aza indirmek için sükroz infiltrasyonu için iğne deliklerinden kaçınılmalıdır.
3. Doku dondurma ve saklama
   1. Göz küresini sükroz solüsyonundan çıkarın ve bir kağıt havluyla hafifçe vurarak kurulayın.
   2. Göz küresini temiz bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve gelecekteki işlemler için -80 ° C'de dondurun.
      NOT: -80 °C'de saklanırsa, göz küresi gelecekteki işlemlere kadar 12 aya kadar canlı kalabilir.
4. Slayt hazırlama
   1. Göz küresini dondurucudan ve mikrosantrifüj tüpünden çıkarın. Keskin bir neşter ile göz küresini sagital düzlem boyunca ikiye bölün. Lensi çıkarın ve atın.
      NOT: Bu adım, dondurucudan yeni alınmış donmuş bir göz küresi üzerinde gerçekleştirilmesi en kolay yöntemdir. Göz küresi kesimi sırasında lens çevre dokuya zarar verebilir. Hasar riskini en aza indirmek için çok keskin bir neşter kullanın ve dikkatli olun.
   2. Göz küresini oda sıcaklığında çözdürün. İki yarıyı bir kasete koyun ve sakarozu yıkamak için 20 dakika akan su altında durulayın.
   3. Göz küresini bir çeker ocak altında aşağıdaki solüsyonlara yerleştirerek ve ardından çıkararak kurutun: 15 dakika boyunca% 70 etil alkol (EtOH) çözeltisi, 15 dakika% 80 EtOH çözeltisi, 15 dakika% 96 EtOH çözeltisi, 15 dakika% 99.9 EtOH çözeltisi ve 7 dakika aseton.
   4. Çeker ocak altında 7 dakika boyunca ksilen içine yerleştirerek göz küresini temizleyin.
   5. Bir behere bir miktar katı parafin koyarak ve parafin üreticisi tarafından belirtilen erime sıcaklığından daha yüksek bir sıcaklığa ayarlanmış bir laboratuvar inkübatörüne koyarak parafini eritin (parafinin erime sıcaklığı 46 °C ile 68 °C arasındadır). Parafin tamamen eridikten sonra (süre kullanılan parafin miktarına bağlıdır), göz küresini parafinli behere taşıyın ve inkübatörde 1 saat sıcak tutun. Dokuya 1 saatlik parafin infiltrasyonu sırasında, parafini her 10-15 dakikada bir karıştırın.
      NOT: Bu adım için çözeltiyi karıştırırken parafin sızmasını sağlayan bir doku işlemcisi kullanılabilir.
   6. Göz küresini aşağıda açıklandığı gibi bir parafin bloğuna gömün.
      1. Kaseti açın ve üst kapağı çıkarın. Metal bir kalıp seçin ve kalıbın altını kaplamak için az miktarda parafin dökün. Göz küresini forseps ile kasetten çıkarın ve kalıptaki parafinin üzerine yerleştirin. Bir göz küresinin yarısını bardağın dibi yukarı, diğerini aşağı gelecek şekilde yerleştirin.
         NOT: Göz küresi yarımlarının bir yarısı kabın alt kısmı yukarı, diğer yarısı aşağı gelecek şekilde yerleştirilmesi, sagital düzlemde doku kesimini mümkün kılacaktır. Bu şekilde kornea, iris, siliyer cisim, göz bebeği, periferik ve merkezi retinadan kesitler elde edilecektir.
      2. Parafinin hafifçe katılaşması ve göz küresini yerine sabitlemesi için kalıbı - 15 °C'ye ayarlanmış bir soğutma plakası üzerinde kısa bir süre soğutun. Bir blok oluşturmak için göz küresini parafin ve kaset tabanını dikkatlice kapatın. Tamamen katılaşması için bloğu bir soğutma plakasına koyun. Ardından, bloğu metal kalıptan çıkarın ve parafin bloklarını kesmeden önce soğuması için en az 15 dakika soğutma plakasına geri yerleştirin.
   7. Mikrotomda bir parafin bloğu sabitleyin. Bloktaki fazla parafini kesmek için mikrotomu ayarlayın (15 μm kesecek şekilde ayarladık) ve göz küresinin merkezine ulaşana kadar kesin. Daha ince kesitler kesmek için mikrotom ayarlarını değiştirin (3,5 μm kesecek şekilde ayarladık) ve kesiti bir slayt üzerine yerleştirin. Bitişik bir su banyosu olan bir mikrotom kullanıyorsanız, slayttaki fazla suyu nemli bir doku ile çıkarın.
      NOT: Amaç, göz bebeğinden en az 3 kesit elde etmektir. Araştırmacı ne kadar az deneyimli olursa, öğrenci düzeyinde kesit almayı sağlamak için o kadar çok kesit elde edilmelidir. Bir slayta birkaç bölüm yerleştirin. Ayrıca, daha az deneyimli araştırmacılar için, dokuyu daha kalın, örneğin 4 μm veya 5 μm kalınlığında bölümler halinde kesin. Bitişik bir su banyosuna sahip bir mikrotomun kullanılması, doku bölümlerinin slaytlara aktarılması işlemini, su banyosu olmayan mikrotomların kullanılmasına kıyasla çok daha kolay hale getirir.
   8. Slaytı çıkarın ve hematoksilen ve eozin (H & E) ile manuel olarak boyamaya başlayın, slaytı aşağıdaki solüsyonlara sırayla koyup çıkararak. 7 dakika ksilen, 5 dakika ksilen (temiz çözeltili başka bir beher) ve 5 dakika ksilen (temiz çözeltili başka bir beher) ile başlayın. Bunu 2 dk %96 EtOH, 1 dk %96 EtOH (temiz solüsyonlu başka bir beher), 1 dk %96 EtOH (temiz solüsyonlu başka bir beher) ile takip edin.
   9. 5 dakika akan suda, ardından 2 dakika Mayer hematoksilini, 2 dakika Mayer hematoksilini (temiz solüsyonlu başka bir beher), 5 dakika akan suda, 5 dakika akan suda (başka, temiz beher) yıkayın.
   10. 2 dakika boyunca% 1 Eosin ekleyin, ardından 1 dakika% 96 EtOH, 30 saniye% 96 EtOH (temiz çözeltili başka bir beher), 30 saniye% 96 EtOH (temiz çözeltili başka bir beher), 2 dakika ksilen, 1 dakika ksilen (temiz çözeltili başka bir beher), 2 dakika ksilen (temiz çözeltili başka bir beher).
       NOT: Alternatif olarak, otomatik bir slayt boyayıcı kullanın.
   11. Otomatik bir slayt kapatıcı kullanarak slaydı kapatın. Hazırlanan slaytlar ışık mikroskobu altında saklanmaya ve değerlendirilmeye hazır hale gelir.
       NOT: Alternatif olarak, lekeli doku üzerine ince bir polistiren montaj tabakası yerleştirerek ve bir cam lamel ile kaplayarak sürgü sızdırmazlığını manuel olarak gerçekleştirin.
       DİKKAT: PFA, EtOH, aseton ve ksilen içeren adımlar bir laboratuvar çeker ocak altında gerçekleştirilmelidir.

3. Göz küresi bölümlerinin değerlendirilmesi

1. Slayt tarama
   1. Slaytı histopatolojik bir slayt tarayıcıya koyun ve tarama modunu kullanarak bölümleri tarayın: 40x. Görüntüleri yüksek çözünürlüklü dijital dosyalar olarak kaydedin.
2. Slayt analizi
   1. Taranan dosyayı görüntü görüntüleme yazılımı kullanarak açın. Çapraz öğrenci kesitlerini bulun ve ardışık üç bölümü analiz edin.
   2. Retinanın en kalın kısmını bulun ve sağ üst köşedeki büyütme kutusuna basıp 20x'i seçerek görüntüyü 20x'e büyütün. Fareyi retinanın en kalın kısmındaki ELM düzeyine getirin ve farenin sağ tarafındaki düğmeye basın, Açıklama Ekle ve Cetvel'i seçin.
   3. Fareyi ILM'ye doğru hareket ettirin ve sol taraftaki düğmeyi tıklatın. Ölçümün başlığını RT olarak belirleyin ve show title (başlığı göster) ve show length (uzunluğu göster) kutularını işaretleyin. Bu şekilde retina kalınlığı (RT) ölçülecek ve ölçüm μm cinsinden gösterilecektir. Temsili sonuçlar Şekil 2 ve Şekil 3'te gösterilmektedir.
   4. Cetveli kullanın, ONL, OPL, INL ve IPL dahil olmak üzere her retina katmanının kalınlığını ölçün ve etiketleyin. Temsili sonuçlar Şekil 4 ve Şekil 5'te gösterilmektedir.
   5. GCL içindeki hücre sayısını saymak için, retinanın önceden belirlenmiş bir uzunluğunu belirleyin. Örneğin, fare retinası için 500 μm'lik bir bölüm kullanın ve sıçan retinası için 100 μm'lik beş bölüm kullanın.
   6. Cetveli kullanarak, GCL boyunca seçilen mesafeyi ölçün. Farenin sağ tarafındaki düğmeye basın ve Açıklama Ekle > 1x RBC> Kaydedildi'yi seçin. Retinanın önceden belirlenmiş uzunluğu boyunca GCL boyunca yuvarlak, hematoksilen lekeli bir gövde olarak tanımlanan her hücreye tıklayın. Daire içine alınmış hücrelerin sayısını sayın. Temsili sonuçlar Şekil 6 ve Şekil 7'de gösterilmiştir.
   7. Ardışık üç bölümü analiz ettikten sonra, tüm ölçümler için ortalamayı çizin.

Sonuçlar

Sunulan protokolün kullanılmasıyla, göz küresinin belirli yapılarının anatomisi ve morfolojisi ayrıntılı olarak değerlendirilebilir. Ekibimiz glokom, diyabetik retinopati ve hipertansif retinopati gibi retina bozukluklarında nörodejenerasyonun patomekanizmalarını araştırmaya odaklanmaktadır. Retinadaki nörodejenerasyonun özelliklerini değerlendirmek için RT (fare göz küresi -Şekil 2, sıçan göz küresi -Şekil...

Tartışmalar

Fare ve sıçan göz küresinin histolojik incelemesi, deneysel oftalmoloji alanında güçlü bir araçtır. Oftalmik hastalıkların seyri sırasında oküler yapılarda meydana gelen değişikliklerle ilgili, aksi takdirde klinik ortamlarda gözlenmeyecek olan yeni bilgiler sağlayabilir. Açıklanan protokoller, retinanın histolojik bir analizini yapmak için basit bir yöntem sunar. Kornea gibi ön dokuları işlemek için gereken prosedürün incelikleri burada açıklanmamıştı...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Chempur	111024800
Dumont Tweezers #5, 11cm, 0.05 x 0.01mm Tips	World Precision Instruments	14095	small, microsurgical forceps
Eosin	Mar-Four	4P.05.2001/L	Aqueous solution
Ethyl alcohol 96 %	Chempur	CH.ET.AL.96%CZDA.CH
Ethyl alcohol 99.9 %	Chempur	CH.ETYL.ALK.99,9%BW	Use to prepare 70% and 80% solutions of EtOH
Glacier - 86 °C Ultralow Temperature Freezer NU-9483E	NuAire	13027D0034	Freezing temperature - 80 °C
Glass slides	Mar-Four	MI.15.01673	Ground glass slides with a double-sided matte field for description
Leica CV5030 Fully Automated Glass Coverslipper	Leica Biosystems	14,04,78,80,101	Automated slide sealer
Mayer's hematoxylin	Chempur	124687402
Metal base molds 15 mm  x 15 mm	Leica Biosystems	3803081
Microme HM 340 E	Thermo Scientific	90-519-0	Microtome
Microtome razor blades	Mar-Four	HI.N.35	Cutting angle 35°
Micro-Twin biopsy cassette	Mar-Four	LN.13874550
Microwave Hybrid Tissue Processor	Milestone
Multistainer Leica ST5020	Leica Biosystems		Automated slide stainer
NanoZoomer 2.0-HT slide scanner	Hamamatsu	C9600	Histopathological slide scanner
NDP.view2 Image viewing software	Hamamatsu	U12388-01	Image viewing software
Paraffin Pathowax Plus	Mar-Four	4P.PWP.010	Melting temperature 56 °C - 58 °C
Paraformaldehyde	Sigma - Aldrich	441244-1KG	Prepare a 4% solution in PBS
PBS Tablets	Merck Millipore	524650-1EA	Use to prepare a solution of phosphate buffer saline, per manufacturer's instructions
Pierce Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL	Thermo Scientific	69715
Refrigerator-freezer EN14000AW	Electrolux	925032562-00	refrigeration 4 °C
Scalpel blade	Swann-Morton	T.OST.SKAL00.024
Sucrose	Chempur	427720906
SuperCut Spring Scissors, 12.5cm, Curved	World Precision Instruments	501925	curved, small microsurgical scissors
Tape for automatic sealers	Mar-Four	KP-3020/SMRH001
Xylene	Chempur	CH.KSYL.5l.METAL.OP