Präparation und Analyse histologischer Objektträger von Augäpfeln von Ratten und Mäusen zur Beurteilung der Netzhaut

Zusammenfassung

Dieses Manuskript stellt ein Protokoll zur histologischen Präparation von Objektträgern aus Augäpfeln von Nagetieren vor. Mit der vorgeschlagenen Methode kann die innere Netzhaut einfach sichtbar gemacht und unter einem Lichtmikroskop beurteilt werden. Das Verfahren wird für die Augäpfel von Mäusen und Ratten vorgestellt.

Zusammenfassung

Ein Augapfel für Nagetiere ist ein mächtiges Werkzeug, um die Pathomechanismen vieler Augenerkrankungen wie Glaukom, hypertensive Retinopathie und viele mehr zu erforschen. Präklinische Experimente ermöglichen es den Forschern, die Wirksamkeit neuartiger Medikamente zu untersuchen, neue Behandlungsmethoden zu entwickeln oder nach neuen Pathomechanismen zu suchen, die an der Entstehung oder dem Fortschreiten der Krankheit beteiligt sind. Eine histologische Untersuchung liefert viele Informationen, die notwendig sind, um die Auswirkungen der durchgeführten Experimente zu beurteilen, und kann Degeneration, Gewebeumbau, Infiltration und viele andere Pathologien aufdecken. In der klinischen Forschung gibt es nur selten eine Chance, Augengewebe zu gewinnen, das für eine histologische Untersuchung geeignet ist, weshalb Forscher die Chance nutzen sollten, die die Untersuchung von Augäpfeln von Nagetieren bietet. Dieses Manuskript stellt ein Protokoll für die histologische Vorbereitung von Schnitten von Augäpfeln von Nagetieren vor. Das Verfahren wird für die Augäpfel von Mäusen und Ratten vorgestellt und umfasst die folgenden Schritte: (i) Entnahme des Augapfels, (ii) Konservierung des Augapfels für die weitere Analyse, (iii) Verarbeitung des Gewebes in Paraffin, (iv) Vorbereitung von Objektträgern, (v) Färbung mit Hämatoxylin und Eosin, (vi) Beurteilung des Gewebes unter einem Lichtmikroskop. Mit der vorgeschlagenen Methode kann die Netzhaut einfach sichtbar gemacht und detailliert beurteilt werden.

Einleitung

Der Augapfel ist eine kugelförmige Struktur, die das Sehorgan bildet. Das Innere des Augapfels kann in zwei Segmente unterteilt werden: das vordere Segment, das die Hornhaut, die Iris, den Ziliarkörper, die Linse, die Vorderkammer und die hintere Kammer umfasst, und das hintere Segment, das den Glaskörper, die Netzhaut, die Aderhaut, die Sklera und den Sehnervenkopf umfasst. Die vordere Kammer befindet sich zwischen der Hornhaut und der Iris ^1,2. Die Iris ist eine kreisförmige Struktur mit einer Öffnung in der Mitte, die als Pupille bezeichnet wird. An der Verbindungsstelle zwischen Hornhaut und Iris befindet sich der Abflusswinkel, an dem ein spezialisiertes System von Trabekeln das Kammerwasser vom Augapfel in das Venensystem ableitet. Die hintere Kammer wird durch die Iris, den Ziliarkörper und die Linse sowie die Aufhängebänder begrenzt, die die Linse an Ort und Stelle halten, begrenzt. Hinter der Linse befindet sich der Glaskörper, der die größte Struktur des Augapfels darstellt. Der Glaskörper haftet an der Netzhaut und stabilisiert deren Position. Die Netzhaut wird von der Aderhaut und der Sklera¹ umgeben. Die Anatomie des Augapfels ist in Abbildung 1 zusammengefasst.

Die Augapfelwand besteht aus drei Schichten. Die äußerste Schicht ist die Sklera, die den Augapfel vor Verletzungen schützt und seine Form beibehält. Am vorderen Pol des Augapfels verwandelt sich die Sklera in eine durchsichtige Hornhaut. Unter der Sklera befindet sich eine Gefäßstruktur, die Uvea genannt wird und deren Hauptfunktion darin besteht, die Strukturen des Auges zu nähren. Die Uvea bildet die Aderhaut und innerhalb des vorderen Pols den Ziliarkörper und die Iris¹. Die innerste Schicht ist die Netzhaut, eine hochspezialisierte Struktur des Auges, die aus Neuronen, Gliazellen und Pigmentepithelzellen besteht. Zu den retinalen Neuronen gehören die Photorezeptorzellen (Stäbchen und Zapfen), horizontale Zellen, bipolare Zellen, Amakrinzellen und retinale Ganglienzellen (RGCs). Diese Zellen sind in komplexe Schichten unterteilt und haben die Aufgabe, Lichtreize zu empfangen und zu verarbeiten ^2,3. Zu den Gliazellen der Netzhaut gehören die Müller-Zellen, Astrozyten und Mikroglia, die in allen Schichten der Netzhaut vorhanden sind. Zu den vielen Funktionen der Gliazellen gehören die Ernährung der Neuronen, die Unterstützung der Blut-Netzhaut-Schranke, die strukturelle Unterstützung der Neuronen zur Aufrechterhaltung der Schichtstruktur der Netzhaut, die Regulierung des Stoffwechsels der Neuronen, die Sekretion biologisch aktiver Proteine, die die Funktion, das Wachstum und das Überleben der Neuronen regulieren, sowie die Regulierung der immunologischen Prozesse in der Netzhaut⁴. Die Pigmentepithelzellen bilden die äußerste Schicht der Netzhaut und fungieren als Barriere zwischen Aderhaut und Photorezeptoren. Diese Zellen regulieren den bidirektionalen Transport von Abfallprodukten und Nährstoffen und schützen die Netzhaut auch vor übermäßigen lichtinduzierten Schäden, indem sie Lichtenergie absorbieren und lichterzeugte reaktive Sauerstoffspezies neutralisieren⁵.

Die Netzhaut kann in zehn Schichten unterteilt werden: (i) das retinale Pigmentepithel, (ii) die Photorezeptorsegmentschicht (Stäbchen und Zapfen), (iii) die äußere Grenzmembran (ELM), (iv) die äußere Kernschicht (ONL), (v) die äußere plexiforme Schicht (OPL), (vi) die innere Kernschicht (INL), (vii) die innere plexiforme Schicht (IPL), (viii) die Ganglienzellschicht (GCL), (ix) die retinale Nervenfaserschicht (RNFL), und (x) interne Grenzmembran (ILM)². Zu den kernhaltigen Schichten der Netzhaut gehören ONL, INL und GCL, während die Schichten mit synaptischen Verbindungen zwischen den Zellen OPL und IPL⁶ umfassen. Die Kerne von Stäbchen und Zapfen bilden das ONL, und ihre Axone erstrecken sich in das OPL, wo sie sich mit den Dendriten der bipolaren und horizontalen Zellen verbinden. Innerhalb des INL befinden sich die horizontalen, bipolaren und amakrinen Zellkerne. Innerhalb des IPL synapsieren die Axonendigungen von bipolaren und amakrinen Zellen mit den Dendriten der RGCs. Innerhalb der GCL machen die RGCs den größten Teil der Zellkörper aus, aber auch einige dislozierte Amakrinzellen sind dort zu finden. Die Axone der RGCs bilden den RNFL und weiter den Sehnerv ^7,8,9.

Viele Augenerkrankungen, wie z. B. neurodegenerative Erkrankungen der Netzhaut, führen zu irreversibler und unheilbarer Erblindung¹⁰. Das Sehen gilt als einer der wichtigsten Sinne¹¹, und eine dauerhafte Erblindung schränkt die Lebensqualität des Patienten erheblich ein. Um das Verständnis der Pathomechanismen vieler Krankheiten zu verbessern, wird die präklinische Forschung mit Zellkulturen oder Tiermodellen breit angelegt. Präklinische Studien an Versuchstieren bieten die Möglichkeit, die Pathomechanismen von Augenerkrankungen zu untersuchen und neue Therapiestrategien zu entwickeln. Augenkrankheiten können sowohl bei großen Tieren (Affen, Kühe, Hunde und Katzen) als auch bei kleinen Tieren (Kaninchen, Ratten, Mäuse und Zebrafische) modelliert werden. Die Verwendung größerer Tiere ermöglicht aufgrund seiner Größe einen besseren Zugang zum Auge. Experimente, die mit Nagetieren durchgeführt werden, ermöglichen hingegen aufgrund ihrer relativ schnellen Fortpflanzung die Züchtung von Inzuchtstämmen, die sich durch eine Anfälligkeit für bestimmte Krankheiten auszeichnen^12,13.

In Tiermodellen ist eine Enukleation möglich, die eine detaillierte histopathologische Untersuchung des Augapfels ermöglicht, mit der Beurteilung kleinerer Pathologien, die in bestimmten Strukturen des Auges während der Entwicklung der Krankheit auftreten - eine Untersuchung, die beim Menschen sehr selten durchgeführt werden kann. Die histopathologische Beurteilung ist ein äußerst wertvolles Instrument bei der Erforschung der Pathomechanismen von Augenerkrankungen. In der veröffentlichten Literatur sind die Beschreibungen der Methodik für die histologische Untersuchung von Augäpfeln sehr begrenzt, und es fehlen Schritt-für-Schritt-Anleitungen, was es Anfängern erschwert, sie nachzubilden. Ziel dieser Studie ist es, eine einfache und prägnante Methode zur Vorbereitung histologischer Objektträger und zur Beurteilung der Netzhaut von Ratte und Maus bereitzustellen.

Protokoll

Die Forschung wurde in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien durchgeführt. Die in dieser Studie verwendeten Augäpfel wurden von Tieren gewonnen, die in einem Experiment enthalten waren, das auf der Grundlage der Studiengenehmigungsnummer WAW2/122/2020 durchgeführt wurde, die von der 2^. Lokalen Ethikkommission an der Warschauer Universität für Naturwissenschaften in Warschau, Polen, ausgestellt wurde. Unser Protokoll wurde entwickelt, indem wir Mäuse im Alter von 11 und 44 Wochen und Ratten im Alter von 6, 12 und 16 Wochen untersuchten.

1. Vorbereitung der Mausaugäpfel

HINWEIS: Dieses Protokoll stellt die Methode zur Präparation von Schnitten von Augäpfeln von Mäusen dar und wurde unter Verwendung von Augäpfeln entwickelt, die von weiblichen C57Bl/6-Mäusen im Alter von 11 Wochen (Durchschnittsgewicht 21 g), weiblichen C57Bl/6-Mäusen im Alter von 44 Wochen (Durchschnittsgewicht 25 g), weiblichen DBA/2-Mäusen im Alter von 11 Wochen (Durchschnittsgewicht 21,5 g) und weiblichen DBA/2-Mäusen im Alter von 44 Wochen mit Glaukom (Durchschnittsgewicht 25 g) entnommen wurden.

1. Enukleation
   1. Verwende eine kleine Pinzette, um die Augenlider zu öffnen. Drücke auf die Augenlider, damit der Augapfel prolapsiert.
   2. Präpariere den Augapfel von der Augenhöhle, indem du das Gewebe hinter dem Augapfel mit einer kleinen, scharfen Schere abschneidest. Sobald der Augapfel aus der Augenhöhle entfernt ist, schneiden Sie das herstehende Bindegewebe und die periokularen Muskeln ab.
      1. Markieren Sie die Augäpfel zur besseren Orientierung, indem Sie zum Beispiel eine kleine Naht an den Sehnenstumpf des lateralen Rektusmuskels des Augapfels binden, um die Schläfenseite des Augapfels zu markieren.
2. Fixierung von Geweben
   1. Legen Sie den enukleierten Augapfel in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und lassen Sie ihn 24 Stunden lang in einer 4%igen Lösung von Paraformaldehyd (PFA) ruhen, die in Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) gelöst ist.
   2. Behandeln Sie anschließend den Augapfel 24 Stunden lang in einer 10%igen Saccharoselösung, entfernen Sie ihn und legen Sie ihn 24 Stunden lang in eine 20%ige Saccharoselösung, und schließlich entfernen Sie ihn und legen Sie ihn für 24 Stunden in eine 30%ige Saccharoselösung.
      HINWEIS: Halten Sie den Augapfel während des gesamten Vorgangs auf einer niedrigen Temperatur von 4 °C. Nadeleinstiche zur Saccharoseinfiltration sollten vermieden werden, um das Risiko einer Augapfelschädigung zu minimieren.
3. Einfrieren und Lagern von Gewebe
   1. Nehmen Sie den Augapfel aus der Saccharoselösung und trocknen Sie ihn, indem Sie ihn leicht mit einem Papiertuch abtupfen.
   2. Legen Sie den Augapfel in ein sauberes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und frieren Sie es für die zukünftige Verarbeitung bei -80 °C ein.
      HINWEIS: Bei einer Lagerung bei -80 °C kann ein Augapfel bis zu 12 Monate bis zur zukünftigen Verarbeitung lebensfähig bleiben.
4. Vorbereitung der Objektträger
   1. Tauen Sie den Augapfel bei Raumtemperatur auf. Schieben Sie es aus dem Mikrozentrifugenröhrchen in eine Kassette und spülen Sie es 20 Minuten lang unter fließendem Wasser ab, um die Saccharose auszuwaschen.
   2. Dehydrieren Sie den Augapfel, indem Sie ihn in die folgenden Lösungen unter einem Abzug legen und dann aus den folgenden Lösungen entfernen: 70%ige Lösung von Ethylalkohol (EtOH) für 10 min, 80%ige Lösung von EtOH für 10 min, 96%ige Lösung von EtOH für 10 min, 99,9%ige Lösung von EtOH für 10 min und Aceton für 5 min.
   3. Reinigen Sie den Augapfel, indem Sie ihn 5 Minuten lang unter einem Abzug in Xylol legen.
   4. Schmelzen Sie das Paraffin, indem Sie etwas festes Paraffin in ein Becherglas geben und es in einen Laborinkubator geben, der auf eine Temperatur eingestellt ist, die höher ist als die vom Paraffinhersteller angegebene Schmelztemperatur (die Schmelztemperatur von Paraffin liegt zwischen 46 °C und 68 °C). Nachdem das Paraffin vollständig geschmolzen ist (die Zeit hängt von der Menge des verwendeten Paraffins ab), den Augapfel in das Becherglas mit dem Paraffin schieben und 1 h im Inkubator warm halten. Während 1 h Paraffininfiltration in das Gewebe das Paraffin alle 10 - 15 min umrühren.
      HINWEIS: Für diesen Schritt kann ein Gewebeprozessor verwendet werden, der die Paraffininfiltration beim Rühren der Lösung ermöglicht.
   5. Betten Sie den Augapfel in einen Paraffinblock ein, wie unten beschrieben.
      1. Öffnen Sie die Kassette und entfernen Sie die obere Abdeckung. Wähle eine Metallform und gieße eine kleine Menge Paraffin ein, um den Boden der Form zu bedecken. Entfernen Sie den Augapfel mit einer Pinzette aus der Kassette und legen Sie ihn auf das Paraffin in der Form. Lege den Augapfel auf die Seite, um einen Schnitt in der Sagittalebene zu gewährleisten.
         HINWEIS: Wenn Sie den Augapfel auf die Seite legen (mit dem vorderen Pol auf der einen Seite und dem hinteren Pol auf der anderen), können Sie in der Sagittalebene schneiden. Auf diese Weise werden Schnitte durch die Hornhaut, die Iris, den Ziliarkörper, die Pupille, die periphere und die zentrale Netzhaut erhalten.
      2. Kühlen Sie die Form auf einer auf -15 °C eingestellten Kühlplatte kurz ab, damit sich das Paraffin leicht verfestigt und das Gewebe an Ort und Stelle verankert. Decken Sie das Taschentuch vorsichtig mit Paraffin ab und den Kassettenboden zu einem Block. Legen Sie den Block auf eine Kühlplatte, damit er vollständig erstarrt. Nehmen Sie dann den Block aus der Metallform und legen Sie die Paraffinblöcke vor dem Schneiden für mindestens 15 Minuten zum Abkühlen auf die Kühlplatte.
   6. Befestigen Sie einen Paraffinblock im Mikrotom. Stellen Sie das Mikrotom so ein, dass es das überschüssige Paraffin vom Block abschneidet (wir stellen es so ein, dass es 15 μm schneidet) und trimmen Sie es bis zur Mitte des Augapfels. Ändern Sie die Mikrotomeinstellungen, um dünnere Abschnitte zu schneiden (wir haben es auf 3,5 μm eingestellt) und platzieren Sie den Schnitt auf einem Objektträger. Wenn Sie ein Mikrotom mit einem angrenzenden Wasserbad verwenden, entfernen Sie das überschüssige Wasser mit einem feuchten Tuch vom Objektträger.
      HINWEIS: Das Ziel ist es, mindestens 3 Querschnitte durch die Pupille zu erhalten. Je weniger erfahren der Forscher ist, desto mehr Schnitte sollten erhalten werden, um eine Schnittbildung auf dem Niveau des Schülers zu gewährleisten. Platzieren Sie ein paar Abschnitte auf einer Folie. Auch für weniger erfahrene Forscher schneiden Sie das Gewebe dicker, z. B. in 4 μm oder 5 μm dicke Abschnitte. Die Verwendung eines Mikrotoms mit einem angrenzenden Wasserbad erleichtert die Übertragung von Gewebeschnitten auf Objektträger im Vergleich zur Verwendung von Mikrotomen ohne Wasserbäder erheblich. Ein weiterer erwähnenswerter Punkt ist, dass die Linse möglicherweise schwer zu durchschneiden ist. Um das Risiko einer Gewebebeschädigung durch die spröde Linse zu minimieren, verwenden Sie nur scharfe Mikrotomklingen, die zum Durchtrennen von hartem Gewebe bestimmt sind. Erwägen Sie, eine Klinge zum Trimmen und eine andere zum Schneiden von Abschnitten zu verwenden, um die Abstumpfung der Klinge zu minimieren.
   7. Legen Sie den Objektträger für 30 min in einen Laborinkubator, der auf 56 °C eingestellt ist.
   8. Nehmen Sie den Objektträger aus dem Inkubator und beginnen Sie mit der manuellen Färbung mit Hämatoxylin und Eosin (H&E), indem Sie den Objektträger nacheinander in die folgenden Lösungen legen und daraus entfernen. Beginnen Sie mit 7 min Xylol, 5 min Xylol (ein weiteres Becherglas mit einer sauberen Lösung) und 5 min Xylol (ein weiteres Becherglas mit einer sauberen Lösung). Anschließend 2 min 96 % EtOH, 1 min 96 % EtOH (ein weiteres Becherglas mit einer sauberen Lösung), 1 min 96 % EtOH (ein weiteres Becherglas mit einer sauberen Lösung) auftragen.
   9. Waschen Sie in 5 min fließendem Wasser, dann 2 min Mayer's Hämatoxylin, 2 min Mayer's Hämatoxylin (ein anderes Becherglas mit einer sauberen Lösung), 5 min fließendes Wasser, 5 min fließendes Wasser (ein weiteres, sauberes Becherglas).
   10. 1 % Eosin für 2 min zugeben, gefolgt von 1 min 96 % EtOH, 30 s 96 % EtOH (ein weiteres Becherglas mit einer sauberen Lösung), 30 s 96 % EtOH (ein weiteres Becherglas mit einer sauberen Lösung), 2 min Xylol, 1 min Xylol (ein weiteres Becherglas mit einer sauberen Lösung), 2 min Xylol (ein weiteres Becherglas mit einer sauberen Lösung).
       HINWEIS: Alternativ können Sie einen automatischen Objektträgerfärbeer verwenden.
   11. Versiegeln Sie den Objektträger mit einem automatischen Objektträgerversiegelungsgerät. Der vorbereitete Objektträger ist bereit für die Lagerung und Beurteilung unter einem Lichtmikroskop.
       HINWEIS: Alternativ können Sie die Gleitversiegelung manuell durchführen, indem Sie eine dünne Schicht Polystyrol-Eindeckmittel auf das befleckte Tuch auftragen und es mit einem Glasdeckglas abdecken.
       VORSICHT: Schritte, die PFA, EtOH, Aceton und Xylol enthalten, sollten unter einem Laborabzug durchgeführt werden.

2. Vorbereitung des Rattenaugenschnitts und der Schlittenmontage

HINWEIS: Dieses Protokoll stellt die Methode zur Präparation von Schnitten von Augäpfeln von Ratten dar und wurde unter Verwendung von Augäpfeln entwickelt, die entnommen wurden von: männlichen SHR-Ratten im Alter von 6 Wochen (Durchschnittsgewicht 115,5 g), männlichen SHR-Ratten im Alter von 12 Wochen mit arterieller Hypertonie (Durchschnittsgewicht 262,5 g), männlichen WKY-Ratten im Alter von 6 Wochen (Durchschnittsgewicht 143,5 g), männlichen WKY-Ratten im Alter von 12 Wochen (Durchschnittsgewicht 265 g), männliche Lewis-Ratten im Alter von 12 Wochen (Durchschnittsgewicht 310 g) und männliche Lewis-Ratten im Alter von 16 Wochen mit induziertem Diabetes mellitus (Durchschnittsgewicht 259 g).

1. Enukleation
   1. Verwende eine kleine Pinzette, um die Augenlider zu öffnen. Drücken Sie auf die Augenlider, um den Augapfel vorzufallen.
   2. Präpariere den Augapfel von der Augenhöhle, indem du das Gewebe hinter dem Augapfel mit einer kleinen, scharfen Schere abschneidest.
      HINWEIS: Markieren Sie die Augäpfel zur besseren Orientierung, indem Sie z. B. eine kleine Naht an den Stumpf der Sehne des lateralen Rektusmuskels des Augapfels binden, um die Schläfenseite des Augapfels zu markieren.
2. Fixierung von Geweben
   1. Legen Sie den enukleierten Augapfel in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und lassen Sie ihn 24 Stunden lang in einer 4%igen Lösung von Paraformaldehyd (PFA) ruhen, die in Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) gelöst ist.
   2. Behandeln Sie anschließend den Augapfel 24 Stunden lang in einer 10%igen Saccharoselösung, entfernen Sie ihn und legen Sie ihn 24 Stunden lang in eine 20%ige Saccharoselösung, und entfernen Sie ihn schließlich und legen Sie ihn für 24 Stunden in eine 30%ige Saccharoselösung.
      HINWEIS: Halten Sie den Augapfel während des gesamten Vorgangs auf einer niedrigen Temperatur von 4 °C. Nadeleinstiche zur Saccharoseinfiltration sollten vermieden werden, um das Risiko einer Augapfelschädigung zu minimieren.
3. Einfrieren und Lagern von Gewebe
   1. Nehmen Sie den Augapfel aus der Saccharoselösung und trocknen Sie ihn, indem Sie ihn leicht mit einem Papiertuch abtupfen.
   2. Legen Sie den Augapfel in ein sauberes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und frieren Sie es für die zukünftige Verarbeitung bei -80 °C ein.
      HINWEIS: Bei einer Lagerung bei -80 °C kann der Augapfel bis zu 12 Monate lang lebensfähig bleiben, bis er in Zukunft verarbeitet werden kann.
4. Vorbereitung der Objektträger
   1. Nehmen Sie den Augapfel aus dem Gefrierschrank und aus dem Mikrozentrifugenröhrchen. Schneiden Sie den Augapfel entlang der Sagittalebene mit einem scharfen Skalpell in zwei Hälften. Entfernen Sie das Objektiv und entsorgen Sie es.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist am einfachsten an einem gefrorenen Augapfel durchzuführen, der frisch aus dem Gefrierschrank genommen wurde. Beim Schneiden des Augapfels kann die Linse das umliegende Gewebe beschädigen. Um das Risiko einer Beschädigung zu minimieren, verwenden Sie ein sehr scharfes Skalpell und bleiben Sie vorsichtig.
   2. Tauen Sie den Augapfel bei Raumtemperatur auf. Schieben Sie die beiden Hälften in eine Kassette und spülen Sie sie 20 Minuten lang unter fließendem Wasser ab, um die Saccharose auszuwaschen.
   3. Dehydrieren Sie den Augapfel, indem Sie ihn in die folgenden Lösungen unter einem Abzug legen und dann daraus entfernen: 70% ige Lösung von Ethylalkohol (EtOH) für 15 min, 80% ige Lösung von EtOH für 15 min, 96% ige Lösung von EtOH für 15 min, 99,9% ige Lösung von EtOH für 15 min und Aceton für 7 min.
   4. Reinigen Sie den Augapfel, indem Sie ihn 7 Minuten lang unter einem Abzug in Xylol legen.
   5. Schmelzen Sie das Paraffin, indem Sie etwas festes Paraffin in ein Becherglas geben und es in einen Laborinkubator geben, der auf eine Temperatur eingestellt ist, die höher ist als die vom Paraffinhersteller angegebene Schmelztemperatur (die Schmelztemperatur von Paraffin liegt zwischen 46 °C und 68 °C). Nachdem das Paraffin vollständig geschmolzen ist (die Zeit hängt von der Menge des verwendeten Paraffins ab), den Augapfel in das Becherglas mit dem Paraffin schieben und 1 h im Inkubator warm halten. Während 1 h Paraffininfiltration in das Gewebe das Paraffin alle 10 - 15 min umrühren.
      HINWEIS: Für diesen Schritt kann ein Gewebeprozessor verwendet werden, der die Paraffininfiltration beim Rühren der Lösung ermöglicht.
   6. Betten Sie den Augapfel in einen Paraffinblock ein, wie unten beschrieben.
      1. Öffnen Sie die Kassette und entfernen Sie die obere Abdeckung. Wähle eine Metallform und gieße eine kleine Menge Paraffin ein, um den Boden der Form zu bedecken. Entfernen Sie den Augapfel mit einer Pinzette aus der Kassette und legen Sie ihn auf das Paraffin in der Form. Platzieren Sie eine Augapfelhälfte mit dem Boden des Bechers nach oben und die andere nach unten.
         HINWEIS: Wenn Sie die Augapfelhälften mit der einen Hälfte nach oben und der anderen nach unten platzieren, können Sie das Gewebeschneiden in der Sagittalebene durchführen. Auf diese Weise werden Schnitte durch die Hornhaut, die Iris, den Ziliarkörper, die Pupille, die periphere und die zentrale Netzhaut erhalten.
      2. Kühlen Sie die Form auf einer auf -15 °C eingestellten Kühlplatte kurz ab, damit sich das Paraffin leicht verfestigt und der Augapfel an Ort und Stelle verankert ist. Bedecke den Augapfel vorsichtig mit Paraffin und den Kassettenboden, sodass ein Block entsteht. Legen Sie den Block auf eine Kühlplatte, damit er vollständig erstarrt. Nehmen Sie dann den Block aus der Metallform und legen Sie die Paraffinblöcke vor dem Schneiden für mindestens 15 Minuten zum Abkühlen auf die Kühlplatte.
   7. Befestigen Sie einen Paraffinblock im Mikrotom. Stellen Sie das Mikrotom so ein, dass es das überschüssige Paraffin vom Block abschneidet (wir stellen es so ein, dass es 15 μm schneidet) und trimmen Sie, bis Sie die Mitte des Augapfels erreichen. Ändern Sie die Mikrotomeinstellungen, um dünnere Abschnitte zu schneiden (wir haben es auf 3,5 μm eingestellt) und platzieren Sie den Schnitt auf einem Objektträger. Wenn Sie ein Mikrotom mit einem angrenzenden Wasserbad verwenden, entfernen Sie das überschüssige Wasser mit einem feuchten Tuch vom Objektträger.
      HINWEIS: Das Ziel ist es, mindestens 3 Querschnitte durch die Pupille zu erhalten. Je weniger erfahren der Forscher ist, desto mehr Schnitte sollten erhalten werden, um eine Schnittbildung auf dem Niveau des Schülers zu gewährleisten. Platzieren Sie ein paar Abschnitte auf einer Folie. Auch für weniger erfahrene Forscher schneiden Sie das Gewebe dicker, z. B. in 4 μm oder 5 μm dicke Abschnitte. Die Verwendung eines Mikrotoms mit einem angrenzenden Wasserbad erleichtert die Übertragung von Gewebeschnitten auf Objektträger im Vergleich zur Verwendung von Mikrotomen ohne Wasserbäder erheblich.
   8. Entfernen Sie den Objektträger und beginnen Sie mit der manuellen Färbung mit Hämatoxylin und Eosin (H&E), indem Sie den Objektträger nacheinander in die folgenden Lösungen legen und daraus entfernen. Beginnen Sie mit 7 min Xylol, 5 min Xylol (ein weiteres Becherglas mit einer sauberen Lösung) und 5 min Xylol (ein weiteres Becherglas mit einer sauberen Lösung). Anschließend 2 min 96 % EtOH, 1 min 96 % EtOH (ein weiteres Becherglas mit einer sauberen Lösung), 1 min 96 % EtOH (ein weiteres Becherglas mit einer sauberen Lösung) auftragen.
   9. Waschen Sie in 5 min fließendem Wasser, dann 2 min Mayer's Hämatoxylin, 2 min Mayer's Hämatoxylin (ein anderes Becherglas mit einer sauberen Lösung), 5 min fließendes Wasser, 5 min fließendes Wasser (ein weiteres, sauberes Becherglas).
   10. 1 % Eosin für 2 min zugeben, gefolgt von 1 min 96 % EtOH, 30 s 96 % EtOH (ein weiteres Becherglas mit einer sauberen Lösung), 30 s 96 % EtOH (ein weiteres Becherglas mit einer sauberen Lösung), 2 min Xylol, 1 min Xylol (ein weiteres Becherglas mit einer sauberen Lösung), 2 min Xylol (ein weiteres Becherglas mit einer sauberen Lösung).
       HINWEIS: Alternativ können Sie einen automatischen Objektträgerfärbeer verwenden.
   11. Versiegeln Sie den Objektträger mit einem automatischen Objektträgerversiegelungsgerät. Die vorbereiteten Objektträger sind bereit für die Lagerung und Beurteilung unter einem Lichtmikroskop.
       HINWEIS: Alternativ können Sie die Gleitversiegelung manuell durchführen, indem Sie eine dünne Schicht Polystyrol-Eindeckmittel auf das befleckte Tuch auftragen und mit einem Glasdeckglas abdecken.
       VORSICHT: Schritte, die PFA, EtOH, Aceton und Xylol enthalten, sollten unter einem Laborabzug durchgeführt werden.

3. Beurteilung der Augapfelabschnitte

1. Scannen von Objektträgern
   1. Legen Sie den Objektträger in einen histopathologischen Objektträgerscanner und scannen Sie die Schnitte im Scan-Modus: 40x. Speichern Sie die Bilder als hochauflösende digitale Dateien.
2. Analyse von Objektträgern
   1. Öffnen Sie die gescannte Datei mit Hilfe einer Bildbetrachtungssoftware. Finden Sie Pupillenquerschnitte und analysieren Sie drei aufeinanderfolgende Schnitte.
   2. Suchen Sie die dickste Stelle der Netzhaut und vergrößern Sie das Bild auf das 20-fache, indem Sie auf das Vergrößerungsfeld in der oberen rechten Ecke drücken und das 20-fache auswählen. Bewegen Sie die Maus auf die ELM-Ebene an der dicksten Stelle der Netzhaut, drücken Sie die rechte Maustaste und wählen Sie "Kommentieren" und "Lineal".
   3. Bewegen Sie die Maus in Richtung ILM, und klicken Sie auf die linke Schaltfläche. Benennen Sie die Messung RT und aktivieren Sie die Kontrollkästchen Titel anzeigen und Länge anzeigen. Auf diese Weise wird die Netzhautdicke (RT) gemessen und die Messung in μm angezeigt. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 2 und Abbildung 3 dargestellt.
   4. Verwenden Sie das Lineal, messen Sie die Dicke jeder Netzhautschicht, einschließlich ONL, OPL, INL und IPL, und beschriften Sie sie. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 4 und Abbildung 5 dargestellt.
   5. Um die Anzahl der Zellen innerhalb der GCL zu zählen, legen Sie eine vorgegebene Länge der Netzhaut fest. Verwenden Sie beispielsweise für die Netzhaut der Maus einen 500-μm-Schnitt und für die Netzhaut der Ratte fünf 100-μm-Abschnitte.
   6. Messen Sie mit dem Lineal den gewählten Abstand entlang der GCL. Drücken Sie die rechte Maustaste und wählen Sie Annotate > Saved > 1x RBC aus. Klicken Sie auf jede Zelle, die als runde, hämatoxylingefärbter Körper entlang der GCL über die vorgegebene Länge der Netzhaut identifiziert wurde. Zählen Sie die Anzahl der eingekreisten Zellen. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 6 und Abbildung 7 dargestellt.
   7. Nachdem Sie drei aufeinanderfolgende Abschnitte analysiert haben, ziehen Sie den Durchschnitt für alle Messungen.

Ergebnisse

Mit Hilfe des vorgestellten Protokolls kann die Anatomie und Morphologie spezifischer Strukturen des Augapfels detailliert beurteilt werden. Unser Team konzentriert sich auf die Erforschung der Pathomechanismen der Neurodegeneration bei Netzhauterkrankungen wie dem Glaukom, der diabetischen Retinopathie und der hypertensiven Retinopathie. Um die Merkmale der Neurodegeneration in der Netzhaut zu beurteilen, untersuchten wir die RT (Maus-Augapfel -Abbildung 2,...

Diskussion

Die histologische Untersuchung des Augapfels von Maus und Ratte ist ein mächtiges Werkzeug auf dem Gebiet der experimentellen Ophthalmologie. Sie kann neue Informationen über Veränderungen der Augenstrukturen im Verlauf von Augenerkrankungen liefern, die sonst im klinischen Umfeld nicht beobachtet würden. Die beschriebenen Protokolle stellen eine einfache Methode zur Durchführung einer histologischen Analyse der Netzhaut dar. Die Feinheiten des Verfahrens, das zur Bearbeitung von vo...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Chempur	111024800
Dumont Tweezers #5, 11cm, 0.05 x 0.01mm Tips	World Precision Instruments	14095	small, microsurgical forceps
Eosin	Mar-Four	4P.05.2001/L	Aqueous solution
Ethyl alcohol 96 %	Chempur	CH.ET.AL.96%CZDA.CH
Ethyl alcohol 99.9 %	Chempur	CH.ETYL.ALK.99,9%BW	Use to prepare 70% and 80% solutions of EtOH
Glacier - 86 °C Ultralow Temperature Freezer NU-9483E	NuAire	13027D0034	Freezing temperature - 80 °C
Glass slides	Mar-Four	MI.15.01673	Ground glass slides with a double-sided matte field for description
Leica CV5030 Fully Automated Glass Coverslipper	Leica Biosystems	14,04,78,80,101	Automated slide sealer
Mayer's hematoxylin	Chempur	124687402
Metal base molds 15 mm  x 15 mm	Leica Biosystems	3803081
Microme HM 340 E	Thermo Scientific	90-519-0	Microtome
Microtome razor blades	Mar-Four	HI.N.35	Cutting angle 35°
Micro-Twin biopsy cassette	Mar-Four	LN.13874550
Microwave Hybrid Tissue Processor	Milestone
Multistainer Leica ST5020	Leica Biosystems		Automated slide stainer
NanoZoomer 2.0-HT slide scanner	Hamamatsu	C9600	Histopathological slide scanner
NDP.view2 Image viewing software	Hamamatsu	U12388-01	Image viewing software
Paraffin Pathowax Plus	Mar-Four	4P.PWP.010	Melting temperature 56 °C - 58 °C
Paraformaldehyde	Sigma - Aldrich	441244-1KG	Prepare a 4% solution in PBS
PBS Tablets	Merck Millipore	524650-1EA	Use to prepare a solution of phosphate buffer saline, per manufacturer's instructions
Pierce Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL	Thermo Scientific	69715
Refrigerator-freezer EN14000AW	Electrolux	925032562-00	refrigeration 4 °C
Scalpel blade	Swann-Morton	T.OST.SKAL00.024
Sucrose	Chempur	427720906
SuperCut Spring Scissors, 12.5cm, Curved	World Precision Instruments	501925	curved, small microsurgical scissors
Tape for automatic sealers	Mar-Four	KP-3020/SMRH001
Xylene	Chempur	CH.KSYL.5l.METAL.OP