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요약

이 원고는 설치류 안구에서 슬라이드의 조직학적 준비를 위한 프로토콜을 제시합니다. 제안된 방법을 사용하면 광학 현미경으로 내부 망막을 쉽게 시각화하고 평가할 수 있습니다. 절차는 생쥐와 쥐의 안구에 대해 제시됩니다.

초록

설치류 안구는 녹내장, 고혈압성 망막병증 등과 같은 많은 안과 질환의 병리 메커니즘을 연구하기 위한 강력한 도구입니다. 전임상 실험을 통해 연구자들은 신약의 효능을 조사하거나, 새로운 치료 방법을 개발하거나, 질병의 발병 또는 진행과 관련된 새로운 병리 메커니즘을 찾을 수 있습니다. 조직학적 검사는 수행된 실험의 효과를 평가하는 데 필요한 많은 정보를 제공하며 퇴행, 조직 리모델링, 침투 및 기타 여러 병리를 밝힐 수 있습니다. 임상 연구에서 조직학적 검사에 적합한 눈 조직을 얻을 수 있는 기회는 거의 없기 때문에 연구자들은 설치류의 안구 검사가 제공하는 기회를 활용해야 합니다. 이 원고는 설치류 안구 절편의 조직학적 준비를 위한 프로토콜을 제시합니다. 절차는 마우스와 쥐의 안구에 대해 제시되며 (i) 안구 적출, (ii) 추가 분석을 위해 안구 보존, (iii) 파라핀으로 조직 처리, (iv) 슬라이드 준비, (v) 헤마톡실린 및 에오신 염색, (vi) 광학 현미경으로 조직 평가. 제안된 방법을 사용하면 망막을 쉽게 시각화하고 자세히 평가할 수 있습니다.

서문

안구는 시각 기관을 구성하는 지구본과 같은 구조입니다. 안구 내부는 각막, 홍채, 섬모체, 수정체, 전방, 후방을 포함하는 전안부와 유리체, 망막, 맥락막, 공막, 시신경두를 포함하는 후안부의 두 부분으로 나눌 수 있습니다. 전방(anterior chamber)은 각막과 홍채 사이에 위치합니다 1,2. 홍채는 중앙에 동공이라고 하는 구멍이 있는 원형 구조입니다. 각막과 홍채의 접합부에는 배수각이 있는데, 여기서 전문화된 섬유주 시스템이 안구에서 정맥계로 수액을 배출합니다. 후방(posterior chamber)은 홍채(iris), 모양체(ciliary body), 수정체(lens)뿐만 아니라 수정체를 제자리에 고정하는 현수인대(suspensory ligament)에 의해 묶여 있습니다. 수정체 뒤에는 안구의 가장 큰 구조인 유리체가 있습니다. 유리체는 망막에 부착되어 그 위치를 안정시킵니다. 망막은 맥락막(choroid)과 공막(sclera)으로 둘러싸여 있다1. 안구의 해부학적 구조는 그림 1에 요약되어 있습니다.

안구 벽은 세 개의 층으로 구성됩니다. 가장 바깥쪽 층은 공막(sclera)으로, 안구를 손상으로부터 보호하고 모양을 유지합니다. 안구의 앞쪽 극에서 공막은 투명한 각막으로 변합니다. 공막 아래에는 포도막(uvea)이라고 하는 혈관 구조가 있는데, 이 조직의 주요 기능은 안구 구조에 영양을 공급하는 것입니다. 포도막은 맥락막을 형성하고, 전극 내에서는 섬모체와 홍채1을 형성합니다. 가장 안쪽 층은 망막으로, 뉴런, 신경교세포, 색소 상피 세포로 구성된 고도로 전문화된 눈 구조입니다. 망막 뉴런에는 광수용체 세포(간상세포와 원추세포), 수평세포, 양극성 세포, 무축삭 세포, 망막 신경절 세포(RGC)가 포함됩니다. 이 세포는 복잡한 층으로 구성되어 있으며, 그들의 역할은 빛의 자극을 받아들이고 처리하는 것입니다 2,3. 망막의 신경교세포(glial cell)는 뮐러세포(Müller cell), 성상세포(astrocyte), 미세아교세포(microglia)로 구성되며, 이들은 망막의 모든 층에 존재합니다. 신경교세포의 많은 기능에는 뉴런의 영양, 혈액-망막 장벽 지원, 망막의 층적 구조를 유지하기 위한 뉴런의 구조적 지원, 뉴런의 신진대사 조절, 뉴런의 기능, 성장 및 생존을 조절하는 생물학적 활성 단백질의 분비, 망막 내 면역학적 과정 조절등이 있습니다 4. 색소 상피 세포는 망막의 가장 바깥쪽 층을 구성하며 맥락막과 광수용체 사이의 장벽 역할을 합니다. 이 세포는 노폐물과 영양분의 양방향 이동을 조절하고 빛 에너지를 흡수하고 빛에서 생성된 활성산소종을 중화하여 과도한 빛으로 인한 손상으로부터 망막을 보호합니다5.

망막은 10개의 층으로 나눌 수 있습니다: (i) 망막 색소 상피, (ii) 광수용체 분절층(간상체 및 원추세포), (iii) 외부 제한막(ELM), (iv) 외부 핵층(ONL), (v) 외망상층(OPL), (vi) 내핵층(INL), (vii) 내망상층(IPL), (viii) 신경절 세포층(GCL), (ix) 망막 신경 섬유층(RNFL), 및 (x) 내부 제한 멤브레인(ILM)2. 망막의 핵층에는 ONL, INL 및 GCL이 포함되며, 세포 간 시냅스 연결이 있는 층에는 OPL 및 IPL6이 있습니다. 간상체와 원추세포의 핵은 ONL을 형성하고 축삭돌기는 OPL로 확장되어 양극성 및 수평 세포의 수상돌기에 연결됩니다. INL 내에는 수평세포, 양극성 세포핵, 무축삭 세포핵이 있습니다. IPL 내에서 양극성 세포와 무축삭 세포의 축삭 말단은 망막 신경절 세포의 수상돌기와 시냅스를 형성합니다. GCL 내에서 망막 신경절 세포는 대부분의 세포체를 구성하지만 일부 탈구된 무축삭 세포도 발견될 수 있습니다. 망막 신경절 세포의 축삭돌기는 RNFL을 형성하고, 더 나아가 시신경을형성합니다 7,8,9.

망막의 신경퇴행성 질환과 같은 많은 안과 질환은 돌이킬 수 없고 불치의 실명을 초래한다10. 시각은 가장 중요한 감각 중 하나로 간주되며11 영구적인 실명은 환자의 삶의 질을 현저히 떨어뜨린다. 많은 질병의 병리 메커니즘에 대한 이해를 심화하기 위해 세포 배양 또는 동물 모델을 사용한 전임상 연구가 광범위하게 수행됩니다. 실험 동물을 사용한 전임상 연구는 안과 질환의 기저에 있는 병리 메커니즘을 평가하고 새로운 치료 전략을 개발할 수 있는 기회를 제공합니다. 안과 질환은 대형 동물(원숭이, 소, 개, 고양이)과 작은 동물(토끼, 쥐, 생쥐, 제브라피시) 모두에서 모델링할 수 있습니다. 더 큰 동물을 사용하면 크기 때문에 눈에 더 쉽게 접근할 수 있습니다. 반면에 설치류로 수행 된 실험은 상대적으로 빠른 번식으로 인해 특정 질병에 대한 감수성을 특징으로하는 근친 균주의 번식을 허용합니다12, 13.

동물 모델에서는 적출이 가능하여 안구에 대한 상세한 조직병리학적 검사를 수행할 수 있으며, 질병 발병 중 눈의 특정 구조에서 나타나는 경미한 병리학을 평가할 수 있습니다. 조직병리학적 평가는 안구 장애의 병리 메커니즘을 연구하는 동안 매우 유용한 도구입니다. 발표된 문헌에서 안구의 조직학적 검사 방법론에 대한 설명이 매우 제한적이고 단계별 가이드가 부족하여 초보자가 재현하기 어렵습니다. 이 연구는 조직학적 슬라이드를 준비하고 쥐와 쥐의 망막을 평가하는 간단하고 간결한 방법을 제공하는 것을 목표로 합니다.

프로토콜

연구는 기관 지침에 따라 수행되었습니다. 본 연구에 사용된 안구는 폴란드 바르샤바에 있는 바르샤바 생명과학대학교의 제2차 지역 윤리 위원회에서 발행한 연구 승인 번호 WAW2/122/2020을 기반으로 수행된 실험에 포함된 동물에서 얻은 것입니다. 우리의 프로토콜은 11주와 44주 된 쥐와 6주, 12주, 16주 된 쥐를 검사하여 개발되었습니다.

1. 마우스 안구의 준비

참고: 이 프로토콜은 생쥐 안구 절편을 준비하는 방법을 제시하며, 11주 령의 암컷 C57Bl/6마리의 마우스(평균 체중 21g), 44주 령의 암컷 C57Bl/6마리의 마우스(평균 체중 25g), 11주 령의 암컷 DBA/마우스 2마리(평균 체중 21.5g) 및 녹내장이 있는 44주 령의 암컷 DBA/마우스 2마리(평균 체중 25g)에서 채취한 안구를 사용하여 개발되었습니다.

  1. 적출
    1. 작은 집게를 사용하여 눈꺼풀을 엽니다. 안구가 탈출할 수 있도록 눈꺼풀을 누릅니다.
    2. 작고 날카로운 가위로 안구 뒤의 조직을 잘라 안구에서 안구를 해부합니다. 안구가 안와에서 제거되면 튀어나온 결합 조직과 안구 주위 근육을 잘라냅니다.
      1. 예를 들어, 안구의 측직근 힘줄 그루터기에 작은 봉합사를 묶어 안구의 측두근을 표시하여 안구의 측두부 쪽을 표시하여 안구의 방향을 더 잘 잡을 수 있도록 표시합니다.
  2. 조직의 정착
    1. 적출된 안구를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해된 파라포름알데히드(PFA) 4% 용액에 24시간 동안 그대로 둡니다.
    2. 그 후, 10 % 자당 용액에 안구를 24 시간 동안 처리 한 다음 제거하고 20 % 자당 용액에 24 시간 동안 놓고, 마지막으로 제거하고 30 % 자당 용액에 24 시간 동안 놓습니다.
      알림: 이 과정에서 안구를 4°C의 낮은 온도로 유지하십시오. 안구 손상의 위험을 최소화하기 위해 자당 침투에 대한 바늘 천자를 피해야 합니다.
  3. 조직 동결 및 보관
    1. 자당 용액에서 안구를 제거하고 종이 타월로 가볍게 두드려 말리십시오.
    2. 깨끗한 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 안구를 넣고 향후 처리를 위해 -80°C에서 동결합니다.
      참고: -80 °C에서 보관하면 안구는 향후 처리될 때까지 최대 12개월 동안 생존할 수 있습니다.
  4. 슬라이드 준비
    1. 안구는 실온에서 해동합니다. 마이크로 원심분리기 튜브에서 카세트로 옮기고 흐르는 물에 20분 동안 헹구어 자당을 씻어냅니다.
    2. 흄 후드 아래의 용액에 안구를 넣은 다음 제거하여 안구를 탈수합니다: 에틸 알코올(EtOH) 70% 용액 10분, EtOH 80% 용액 10분, EtOH 96% 용액 10분, EtOH 99.9% 용액 10분, 아세톤 5분.
    3. 흄 후드 아래에 자일렌에 5분 동안 넣어 안구를 청소합니다.
    4. 비커에 고체 파라핀을 넣고 파라핀 제조업체가 지정한 용융 온도(파라핀의 용융 온도는 46°C에서 68°C 사이)보다 높은 온도로 설정된 실험실 인큐베이터에 넣어 파라핀을 녹입니다. 파라핀이 완전히 녹은 후(시간은 사용된 파라핀의 양에 따라 다름) 파라핀이 있는 비커로 안구를 옮기고 인큐베이터에서 1시간 동안 따뜻하게 유지합니다. 파라핀이 조직에 침투한 지 1시간 동안 10-15분마다 파라핀을 저어줍니다.
      참고: 용액을 교반하는 동안 파라핀 침투를 가능하게 하는 조직 처리기를 이 단계에 사용할 수 있습니다.
    5. 아래 설명된 대로 안구를 파라핀 블록에 삽입합니다.
      1. 카세트를 열고 상단 커버를 제거합니다. 금속 주형을 선택하고 소량의 파라핀을 부어 주형 바닥을 덮습니다. 집게로 카세트에서 안구를 제거하고 금형의 파라핀에 놓습니다. 시상면에서 절단할 수 있도록 안구를 옆으로 눕힙니다.
        알림: 안구를 옆으로 눕히면(앞쪽 극이 한쪽에, 뒤쪽 극이 다른 쪽에 위치함) 시상면을 절단할 수 있습니다. 이런 식으로 각막, 홍채, 섬모체, 동공, 말초 및 중앙 망막을 통한 절편을 얻을 수 있습니다.
      2. 파라핀이 약간 응고되어 조직을 제자리에 고정할 수 있도록 -15°C로 설정된 냉각판에서 금형을 잠시 냉각합니다. 파라핀으로 조직을 조심스럽게 덮고 카세트 바닥을 덮어 블록을 형성합니다. 블록을 냉각판에 올려 완전히 응고시킵니다. 그런 다음 금속 주형에서 블록을 제거하고 파라핀 블록을 냉각판에 다시 놓고 절단하기 전에 최소 15분 동안 냉각시킵니다.
    6. 마이크로톰에 파라핀 블록을 고정합니다. 마이크로톰을 설정하여 블록에서 여분의 파라핀을 잘라내고(15μm를 자르도록 설정) 안구 중앙까지 다듬습니다. 마이크로톰 설정을 변경하여 더 얇은 부분을 자르고(여기서는 3.5μm를 자르도록 설정) 섹션을 슬라이드에 배치합니다. 인접한 수조와 함께 마이크로톰을 사용하는 경우 젖은 티슈로 슬라이드에서 여분의 물을 제거하십시오.
      참고: 목표는 동공을 통해 최소 3개의 단면을 얻는 것입니다. 경험이 적은 연구자일수록 학생 수준에서 절편을 보장하기 위해 더 많은 단면을 얻어야 합니다. 하나의 슬라이드에 두 개의 섹션을 배치합니다. 또한 경험이 부족한 연구자의 경우 조직을 더 두껍게 절단하는 등의 방법을 4μm 또는 5μm 두께로 절단할 수 있습니다. 인접한 수조와 함께 마이크로톰을 사용하면 수조 없이 마이크로톰을 사용하는 것과 비교할 때 조직 절편을 슬라이드로 옮기는 과정이 훨씬 쉬워집니다. 주목할 가치가 있는 또 다른 점은 렌즈를 절단하기 어려울 수 있다는 것입니다. 부서지기 쉬운 렌즈로 인한 조직 손상 위험을 최소화하려면 단단한 조직을 절단하도록 지정된 날카로운 마이크로톰 블레이드만 사용하십시오. 한 블레이드는 트리밍에 사용하고 다른 블레이드는 블레이드의 무뎌짐을 최소화하기 위해 섹션을 절단하는 데 사용하는 것이 좋습니다.
    7. 슬라이드를 56°C로 설정된 실험실 인큐베이터에 30분 동안 놓습니다.
    8. 인큐베이터에서 슬라이드를 제거하고 다음 용액에 슬라이드를 순차적으로 넣고 제거하여 수동으로 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색을 시작합니다. 7분 크실렌, 5분 자일렌(깨끗한 용액이 있는 다른 비커) 및 5분 자일렌(깨끗한 용액이 있는 또 다른 비커)으로 시작합니다. 2분 96% EtOH, 1분 96% EtOH(깨끗한 용액이 있는 다른 비커), 1분 96% EtOH(깨끗한 용액이 있는 다른 비커)를 사용합니다.
    9. 흐르는 물에 5분, Mayer의 헤마톡실린 2분, Mayer의 헤마톡실린(깨끗한 용액이 있는 또 다른 비커), 흐르는 물 5분, 흐르는 물 5분(또 다른 깨끗한 비커)으로 씻습니다.
    10. 1% Eosin을 2분 동안 추가한 다음 1분 96% EtOH, 30초 96% EtOH(깨끗한 용액이 있는 다른 비커), 30초 96% EtOH(깨끗한 용액이 있는 다른 비커), 2분 크실렌, 1분 자일렌(깨끗한 용액이 있는 다른 비커), 2분 자일렌(깨끗한 용액이 있는 다른 비커)을 추가합니다.
      참고: 또는 자동 슬라이드 염색기를 사용하십시오.
    11. 자동 슬라이드 실러를 사용하여 슬라이드를 밀봉합니다. 준비된 슬라이드는 광학 현미경으로 보관 및 평가할 준비가 되었습니다.
      참고: 또는 염색된 조직에 폴리스티렌 마운턴트의 얇은 층을 놓고 유리 커버슬립으로 덮어 수동으로 슬라이드 씰링을 수행합니다.
      주의 : PFA, EtOH, 아세톤 및 자일렌을 포함하는 단계는 실험실 흄 후드 아래에서 수행해야 합니다.

2. 쥐 안구 단면도와 활주 설치의 준비

참고: 이 프로토콜은 쥐 안구 절편을 준비하는 방법을 제시하며 6주 령의 수컷 SHR 쥐(평균 체중 115.5g), 동맥성 고혈압이 있는 12주 령의 수컷 SHR 쥐(평균 체중 262.5g), 6주 령의 수컷 WKY 쥐(평균 체중 143.5g), 12주 령의 수컷 WKY 쥐(평균 체중 265g), 생후 12주 령의 수컷 루이스 쥐(평균 체중 310g)와 당뇨병을 앓고 있는 16주 령의 수컷 루이스 쥐(평균 체중 259g).

  1. 적출
    1. 작은 집게를 사용하여 눈꺼풀을 엽니다. 눈꺼풀을 눌러 안구를 탈출시킵니다.
    2. 작고 날카로운 가위로 안구 뒤의 조직을 잘라 안구에서 안구를 해부합니다.
      참고: 예를 들어, 안구의 측직근 힘줄 그루터기에 작은 봉합사를 묶어 안구의 측두근을 표시하여 안구의 측두부 쪽을 표시하는 등 더 나은 방향을 위해 안구를 표시합니다.
  2. 조직의 정착
    1. 적출된 안구를 1.5mL 미세원심분리 튜브에 넣고 인산염 완충액 식염수(PBS)에 용해된 파라포름알데히드(PFA) 4% 용액에 24시간 동안 둡니다.
    2. 그 후, 10% 자당 용액에 안구를 24시간 동안 처리한 후, 제거하고 20% 자당 용액에 24시간 동안 놓고, 마지막으로 제거하여 30% 자당 용액에 24시간 동안 놓습니다.
      알림: 이 과정에서 안구를 4°C의 낮은 온도로 유지하십시오. 안구 손상의 위험을 최소화하기 위해 자당 침투에 대한 바늘 천자를 피해야 합니다.
  3. 조직 동결 및 보관
    1. 자당 용액에서 안구를 제거하고 종이 타월로 가볍게 두드려 말리십시오.
    2. 깨끗한 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 안구를 넣고 향후 처리를 위해 -80°C에서 동결합니다.
      참고: -80°C에서 보관하면 안구는 향후 처리될 때까지 최대 12개월 동안 생존할 수 있습니다.
  4. 슬라이드 준비
    1. 냉동실과 마이크로 원심분리기 튜브에서 안구를 제거합니다. 날카로운 메스로 시상면을 따라 안구를 반으로 자릅니다. 렌즈를 제거하고 버리십시오.
      알림: 이 단계는 냉동실에서 갓 꺼낸 얼어붙은 안구에 수행하는 것이 가장 쉽습니다. 안구를 자르는 동안 수정체가 주변 조직을 손상시킬 수 있습니다. 손상 위험을 최소화하려면 매우 날카로운 메스를 사용하고 주의하십시오.
    2. 안구는 실온에서 해동합니다. 두 개의 반쪽을 카세트로 옮기고 흐르는 물에 20분 동안 헹구어 자당을 씻어냅니다.
    3. 흄 후드 아래의 용액에 안구를 넣은 다음 제거하여 안구를 탈수시킵니다: 에틸 알코올(EtOH) 70% 용액을 15분, 80% EtOH 용액을 15분, 99.9% 용액을 15분, 아세톤을 7분 동안 넣습니다.
    4. 흄 후드 아래에 자일렌에 7분 동안 넣어 안구를 청소합니다.
    5. 비커에 고체 파라핀을 넣고 파라핀 제조업체가 지정한 용융 온도(파라핀의 용융 온도는 46°C에서 68°C 사이)보다 높은 온도로 설정된 실험실 인큐베이터에 넣어 파라핀을 녹입니다. 파라핀이 완전히 녹은 후(시간은 사용된 파라핀의 양에 따라 다름) 파라핀이 있는 비커로 안구를 옮기고 인큐베이터에서 1시간 동안 따뜻하게 유지합니다. 파라핀이 조직에 침투한 지 1시간 동안 10-15분마다 파라핀을 저어줍니다.
      참고: 용액을 교반하는 동안 파라핀 침투를 가능하게 하는 조직 처리기를 이 단계에 사용할 수 있습니다.
    6. 아래 설명된 대로 안구를 파라핀 블록에 삽입합니다.
      1. 카세트를 열고 상단 커버를 제거합니다. 금속 주형을 선택하고 소량의 파라핀을 부어 주형 바닥을 덮습니다. 집게로 카세트에서 안구를 제거하고 금형의 파라핀에 놓습니다. 한쪽 안구를 컵 바닥이 위로 향하게 하고 다른 안구를 아래로 향하게 놓습니다.
        참고: 안구 반쪽을 컵 바닥이 위로 향하게 하고 다른 반쪽을 아래로 향하게 하면 시상면에서 조직을 절단할 수 있습니다. 이런 식으로 각막, 홍채, 섬모체, 동공, 말초 및 중앙 망막을 통한 절편을 얻을 수 있습니다.
      2. 파라핀이 약간 굳어지고 안구가 제자리에 고정되도록 -15°C로 설정된 냉각판에서 금형을 잠시 냉각합니다. 파라핀으로 안구를 조심스럽게 덮고 카세트 바닥을 블록으로 만듭니다. 블록을 냉각판에 올려 완전히 응고시킵니다. 그런 다음 금속 주형에서 블록을 제거하고 파라핀 블록을 냉각판에 다시 놓고 절단하기 전에 최소 15분 동안 냉각시킵니다.
    7. 마이크로톰에 파라핀 블록을 고정합니다. 마이크로톰을 설정하여 블록에서 여분의 파라핀을 잘라내고(15μm를 자르도록 설정) 안구 중앙에 도달할 때까지 다듬습니다. 마이크로톰 설정을 변경하여 더 얇은 부분을 자르고(여기서는 3.5μm를 자르도록 설정) 섹션을 슬라이드에 배치합니다. 인접한 수조와 함께 마이크로톰을 사용하는 경우 젖은 티슈로 슬라이드에서 여분의 물을 제거하십시오.
      참고: 목표는 동공을 통해 최소 3개의 단면을 얻는 것입니다. 경험이 적은 연구자일수록 학생 수준에서 절편을 보장하기 위해 더 많은 단면을 얻어야 합니다. 하나의 슬라이드에 두 개의 섹션을 배치합니다. 또한 경험이 부족한 연구자의 경우 조직을 더 두껍게 절단하는 등의 방법을 4μm 또는 5μm 두께로 절단할 수 있습니다. 인접한 수조와 함께 마이크로톰을 사용하면 수조 없이 마이크로톰을 사용하는 것과 비교할 때 조직 절편을 슬라이드로 옮기는 과정이 훨씬 쉬워집니다.
    8. 슬라이드를 제거하고 다음 용액에 슬라이드를 순차적으로 끼우고 제거하여 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 수동으로 염색을 시작합니다. 7분 크실렌, 5분 자일렌(깨끗한 용액이 있는 다른 비커) 및 5분 자일렌(깨끗한 용액이 있는 또 다른 비커)으로 시작합니다. 2분 96% EtOH, 1분 96% EtOH(깨끗한 용액이 있는 다른 비커), 1분 96% EtOH(깨끗한 용액이 있는 다른 비커)를 사용합니다.
    9. 흐르는 물에 5분, Mayer의 헤마톡실린 2분, Mayer의 헤마톡실린(깨끗한 용액이 있는 또 다른 비커), 흐르는 물 5분, 흐르는 물 5분(또 다른 깨끗한 비커)으로 씻습니다.
    10. 1% Eosin을 2분 동안 추가한 다음 1분 96% EtOH, 30초 96% EtOH(깨끗한 용액이 있는 다른 비커), 30초 96% EtOH(깨끗한 용액이 있는 다른 비커), 2분 크실렌, 1분 자일렌(깨끗한 용액이 있는 다른 비커), 2분 자일렌(깨끗한 용액이 있는 다른 비커)을 추가합니다.
      참고: 또는 자동 슬라이드 염색기를 사용하십시오.
    11. 자동 슬라이드 실러를 사용하여 슬라이드를 밀봉합니다. 준비된 슬라이드는 광학 현미경으로 보관 및 평가할 준비가 되어 있습니다.
      참고: 또는 염색된 조직에 폴리스티렌 장착제의 얇은 층을 놓고 유리 커버슬립으로 덮어 슬라이드 밀봉을 수동으로 수행합니다.
      주의 : PFA, EtOH, 아세톤 및 자일렌을 포함하는 단계는 실험실 흄 후드 아래에서 수행해야 합니다.

3. 안구 부분 평가

  1. 슬라이드 스캔
    1. 슬라이드를 조직병리학적 슬라이드 스캐너에 넣고 스캔 모드: 40x를 사용하여 섹션을 스캔합니다. 이미지를 고해상도 디지털 파일로 저장합니다.
  2. 슬라이드 분석
    1. 이미지 보기 소프트웨어를 사용하여 스캔한 파일을 엽니다. 교차 동공 단면을 찾고 세 개의 연속된 단면을 분석합니다.
    2. 망막의 가장 두꺼운 부분을 찾아 오른쪽 상단 모서리에 있는 확대 상자를 누르고 20배를 선택하여 이미지를 20배로 확대합니다. 마우스를 망막의 가장 두꺼운 부분에 있는 ELM 수준으로 이동하고 마우스의 오른쪽 버튼을 누르고 주석 달기 및 눈금자를 선택합니다.
    3. ILM으로 마우스를 이동하고 왼쪽 단추를 클릭합니다. 측정 RT의 제목을 지정하고 제목을 표시하고 길이를 표시하는 상자를 선택합니다. 이런 식으로 망막 두께(RT)가 측정되고 측정값이 μm 단위로 표시됩니다. 대표적인 결과는 그림 2 와 그림 3에 나와 있습니다.
    4. 자를 사용하여 ONL, OPL, INL 및 IPL을 포함한 각 망막층의 두께를 측정하고 레이블을 지정합니다. 대표적인 결과가 그림 4 와 그림 5에 나와 있습니다.
    5. GCL 내의 세포 수를 세려면 미리 결정된 망막 길이를 설정합니다. 예를 들어, 마우스 망막의 경우 500μm 섹션 1개를 사용하고 쥐 망막의 경우 100μm 섹션 5개를 사용합니다.
    6. 눈금자를 사용하여 GCL을 따라 선택한 거리를 측정합니다. 마우스의 오른쪽 버튼을 누르고 1x RBC> Annotate > Saved를 선택합니다. 미리 결정된 망막 길이에 걸쳐 GCL을 따라 둥글고 헤마톡실린으로 염색된 몸체로 식별된 각 세포를 클릭합니다. 원으로 둘러싸인 셀의 수를 계산합니다. 대표적인 결과가 그림 6 과 그림 7에 나와 있습니다.
    7. 세 개의 연속된 섹션을 분석한 후 모든 측정값에 대한 평균을 그립니다.

결과

제시된 프로토콜을 사용하여 안구의 특정 구조의 해부학과 형태를 자세히 평가할 수 있습니다. 우리 팀은 녹내장, 당뇨병성 망막병증, 고혈압성 망막병증과 같은 망막 질환에서 신경퇴행의 병리기전을 연구하는 데 중점을 두고 있습니다. 망막의 신경퇴행 특징을 평가하기 위해 RT(쥐 안구-그림 2, 쥐 안구-그림 3), ONL, OPL, INL, IPL...

토론

쥐와 쥐의 안구에 대한 조직학적 검사는 실험 안과 분야에서 강력한 도구입니다. 안과 질환 과정에서 안구 구조의 변화와 관련된 새로운 정보를 제공할 수 있으며, 그렇지 않으면 임상 환경에서 관찰되지 않을 것입니다. 설명된 프로토콜은 망막의 조직학적 분석을 수행하는 간단한 방법을 제시합니다. 각막과 같은 전방 조직을 처리하는 데 필요한 절차의 미묘함은 여기?...

공개

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 말

쥐를 포함한 이 작업은 2014-2020년 운영 프로그램 지식 교육 개발에 따라 유럽 사회 기금이 공동 자금을 지원하는 바르샤바 의과 대학의 발전을 위한 기회로서의 TIME 2 MUW - 교육 우수성 프로젝트의 일환으로 자금을 지원받았으며, 공동 자금 조달 계약 번호: POWR.03.05.00-00-Z040/18-00. 생쥐를 포함한 이 작업은 2020년부터 2022년까지 시행된 프로젝트의 일환으로 수행되었으며, 바르샤바 의과대학이 확보한 과학 보조금으로 자금을 지원받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetone Chempur 111024800
Dumont Tweezers #5, 11cm, 0.05 x 0.01mm TipsWorld Precision Instruments14095small, microsurgical forceps
EosinMar-Four4P.05.2001/LAqueous solution
Ethyl alcohol 96 %Chempur CH.ET.AL.96%CZDA.CH
Ethyl alcohol 99.9 %Chempur CH.ETYL.ALK.99,9%BWUse to prepare 70% and 80% solutions of EtOH
Glacier - 86 °C Ultralow Temperature Freezer NU-9483ENuAire13027D0034Freezing temperature - 80 °C
Glass slidesMar-FourMI.15.01673Ground glass slides with a double-sided matte field for description
Leica CV5030 Fully Automated Glass CoverslipperLeica Biosystems 14,04,78,80,101Automated slide sealer 
Mayer's hematoxylinChempur 124687402
Metal base molds 15 mm  x 15 mmLeica Biosystems 3803081
Microme HM 340 EThermo Scientific90-519-0Microtome
Microtome razor bladesMar-FourHI.N.35Cutting angle 35°
Micro-Twin biopsy cassetteMar-FourLN.13874550
Microwave Hybrid Tissue ProcessorMilestone
Multistainer Leica ST5020Leica Biosystems Automated slide stainer 
NanoZoomer 2.0-HT slide scannerHamamatsuC9600Histopathological slide scanner
NDP.view2 Image viewing softwareHamamatsuU12388-01Image viewing software
Paraffin Pathowax PlusMar-Four4P.PWP.010Melting temperature 56 °C - 58 °C
ParaformaldehydeSigma - Aldrich441244-1KGPrepare a 4% solution in PBS
PBS TabletsMerck Millipore524650-1EAUse to prepare a solution of phosphate buffer saline, per manufacturer's instructions
Pierce Microcentrifuge Tubes, 1.5 mLThermo Scientific69715
Refrigerator-freezer EN14000AWElectrolux925032562-00refrigeration 4 °C
Scalpel bladeSwann-MortonT.OST.SKAL00.024
SucroseChempur 427720906
SuperCut Spring Scissors, 12.5cm, CurvedWorld Precision Instruments501925curved, small microsurgical scissors
Tape for automatic sealersMar-FourKP-3020/SMRH001
XyleneChempur CH.KSYL.5l.METAL.OP 

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